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文檔簡(jiǎn)介

1、RNA提取心得/經(jīng)驗(yàn)/體會(huì)/紀(jì)律(RNA提取注意事項(xiàng))!紀(jì)律一:杜絕外源酶的污染。  注意一:操作環(huán)境干凈無(wú)灰塵,嚴(yán)格戴好口罩,手套。  注意二:實(shí)驗(yàn)所涉及的離心管,Tip 頭,移液器桿,電泳槽,實(shí)驗(yàn)臺(tái)面等要徹底處理。  注意三:實(shí)驗(yàn)所涉及的試劑/溶液,尤其是水,必須確保 RNase-Free。紀(jì)律二:阻止內(nèi)源酶的活性  注意四:選擇合適的勻漿方法。  注意五:選擇合適的裂解液。  注意六:控制好樣品的起始量。紀(jì)律三:明確自己的抽提目的  注意七:任何裂解液系統(tǒng)在接近樣品最大起始量時(shí),抽提成功率急劇下降。  注意八

2、:RNA 抽提成功的唯一經(jīng)濟(jì)的標(biāo)準(zhǔn)是后續(xù)實(shí)驗(yàn)的一次成功,而不是得率。Rnase 污染的10大來(lái)源1:手指頭 手指頭是外源酶的第一來(lái)源,所以必需戴手套并且頻繁更換。另外,口罩也必需戴,因?yàn)楹粑彩且粋€(gè)重要的酶來(lái)源。戴手套口罩的另外的好處是保護(hù)實(shí)驗(yàn)人員。2:槍頭,離心管,移液器 單純的滅菌是不能滅活 Rnase 的,所以槍頭和離心管要用 DEPC 處理,即使是標(biāo)明為 DEPC 處理過(guò)的。移液器最好是專用的,用前用 75% 的酒精棉球搽拭干凈,尤其是桿子;另外,一定不要使用褪頭器。3:水/緩沖液 一定要確保無(wú) Rnase 污染。4:實(shí)驗(yàn)臺(tái)面 最起碼要用 75% 的酒精棉球搽拭干凈。5:內(nèi)源 Rnas

3、e 所有組織均含內(nèi)源酶,故組織用液氮速凍是降低降解的最好辦法。液氮保存/碾磨方法的確不方便,但對(duì)有一些內(nèi)源酶含量很高的組織,卻是唯一的辦法。6:RNA 樣品 RNA 抽提產(chǎn)物可能都會(huì)含痕量的 Rnase 污染。7:質(zhì)粒抽提 質(zhì)粒抽提往往用到 Rnase 降解 RNA,殘留的 Rnase 要用 Proteinase K 消化,PCI 抽提。8:RNA 保存 即使低溫保存,痕量的 Rnase 亦會(huì)導(dǎo)致 RNA 降解。長(zhǎng)期保存 RNA 的最好辦法是鹽/醇懸液,因?yàn)榇荚诘蜏貢r(shí)抑制所有的酶活性。9:陽(yáng)離子 (Ca, Mg) 在含這些離子時(shí),80C 加熱 5 分鐘會(huì)導(dǎo)致 RNA 被剪切,故如果 RNA 需

4、要被加熱,保存液需要含螯合劑 (1mM Sodium Citrate, pH 6.4)。10:后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用的酶 酶均有可能被 Rnase 污染。RNase 和 DEPC 處理1 / 81:高壓滅菌是可以滅活部分 Rnase A 的。實(shí)驗(yàn)證明:37 C 與 RNA 反應(yīng),沒有滅菌的 PBS,活性點(diǎn)為 100 pg/ml;滅菌后,活性點(diǎn)為 100 ng/ml。當(dāng)然,滅菌后 Rnase 仍然不能認(rèn)為沒有殘留。2:DEPC 在水中半衰期為 30 分鐘。0.1% 的 DEPC 滅菌 15 分鐘可以認(rèn)為徹底破壞了 DEPC。破壞后可以聞到一點(diǎn)氣味。3:在1M Tris, 1M HEPES, 1M MOPS

5、 中分別加入 1ug/ml Rnase A 和 0.1% 及 1% DEPC 實(shí)驗(yàn)。結(jié)果提示,0.1% DEPC 只對(duì) MOPS 有效,而 1% DEPC 對(duì)三種試劑都有效。4:0.01% DEPC,0.1% DEPC,1% DEPC 有效去除 Rnase A的濃度分別為:100 ng/ml,500ng/ml,1 ug/ml。但要注意,DEPC 滅活后的副產(chǎn)品,對(duì)有些后續(xù)實(shí)驗(yàn)是有影響的。我也來(lái)談?wù)凴NA的提取,我覺得14樓說(shuō)的方法很嚴(yán)格,但是有時(shí)候我們其實(shí)不必在過(guò)多的細(xì)節(jié)上太緊張。而在有些步驟一定要小心了。以下的內(nèi)容,是講給那些既想偷懶,有希望實(shí)驗(yàn)結(jié)果有保證的人聽的,如果你是習(xí)慣于每一步都很嚴(yán)

6、格的人的話,建議還是按照14樓的方法做,因?yàn)槟菢硬攀钦景 ?#160; 好了,下面是給想偷懶,但又不想搞砸實(shí)驗(yàn)的戰(zhàn)友看的。用最少的時(shí)間,Money,力氣,來(lái)做出最好的結(jié)果,是我們的終極目標(biāo)(PS:我相信一句話,懶人推動(dòng)科技進(jìn)步!個(gè)人愚見,大家不要拍我?。?。我是做植物的,所以以植物RNA提取為例子:一、關(guān)于器皿的處理:  槍頭ep管最好是用DEPC處理一下,當(dāng)然如果老板錢多的話,盡管用進(jìn)口的RNase-Free的吧。這里,如果你想要偷點(diǎn)懶,也是有辦法的,就是少處理一些ep管,因?yàn)楹竺嫖覀儠?huì)講到,不是所有的ep管都一定要處理的。  研缽,這個(gè)東西按要求是要高溫干燥處理的,但是

7、在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中,如果你不處理的話,也不會(huì)有太大的影響。因?yàn)樵谝话阄覀円幚淼牟牧仙隙紩?huì)帶有很多的RNA酶,設(shè)想一下,一個(gè)研磨碎了的細(xì)胞會(huì)釋放多少RNA酶出來(lái)。所以,在研缽上殘留的那些RNase,不是導(dǎo)致你RAN降解的原因。我的做法是,洗干凈的研缽,和槍頭等一起濕熱滅菌即可。如果你真的很急的話,連濕熱滅菌也免了。  關(guān)于手套、口罩和實(shí)驗(yàn)臺(tái)。手套是一個(gè)很重要的東西,這個(gè)千萬(wàn)不能省,而且實(shí)驗(yàn)過(guò)程當(dāng)中要勤換手套。因?yàn)?,一般我們?cè)谧鰧?shí)驗(yàn)是時(shí)候,還要取用很多其他試劑、儀器。所以手套往往是最有可能污染你樣品的東西。所以千萬(wàn)記得要換得勤快點(diǎn)。還有,順便說(shuō)一下,最好是戴兩層PE手套,因?yàn)閷?shí)驗(yàn)過(guò)程中,往往

8、手上會(huì)出汗,戴一層手套的話,往往脫下來(lái),就很難戴上去了。戴上兩層,外層的手套可以方便更換,免得戴不上,還把PE手套夾到ep管里面,這樣可是很危險(xiǎn)的!至于口罩,我認(rèn)為,不戴也沒關(guān)系,但不戴口罩的話,建議你少說(shuō)些話了,尤其是不要對(duì)這樣品。講話是時(shí)候,帶出去的口水,足夠降解你的樣品了。工作臺(tái)的話,我想,能在一個(gè)超凈臺(tái)上是最好,普通的bench也可以,但是要保證周圍沒人干擾,否則,有人沖你打個(gè)招呼,那噴過(guò)來(lái)的口水就夠讓你的RNA嗝屁了(像口水兵?)。二、關(guān)于實(shí)驗(yàn)過(guò)程和試劑  通常,提取植物RNA的方法如下  試劑:Trizol,氯仿,75乙醇,異丙醇,DEPC水;  操作

9、:    1)、每100mg組織加1ml TRIZOL試劑,用液氮?jiǎng)驖{后,室溫放置到變成液態(tài);    2)、將液體吸到1.5 ml EP管中(可以用沒有經(jīng)DEPC處理的ep管),加新開的氯仿0.2ml,振蕩15秒。    3)、室溫靜置2-3分鐘后,12000 rpm,15 min,4,離心。    4)、取0.5ml上清到ep管(DEPC處理)加等體積的氯仿重新抽提;4,12000g,15min;    5)、取上清無(wú)色水相(約0.6 ml)到 EP管(DEPC處理過(guò)),加0.5 ml新開的異

10、丙醇,室溫下靜置10分鐘;    6)、12000 rpm,15分鐘,4,離心。觀察總RNA在管底的白色沉淀,棄去上清(小心別倒了沉淀),75%乙醇1.0 ml洗滌(用DEPC水新配制)后,7500 rpm,5 min,4離心。    7)、重復(fù)洗滌(可選);    8)、去上清,用10 ul Tip吸干液體。氣干沉淀5-10分鐘;    9)、加DEPC水20-30 ul,槍打勻,溶解總RNA,測(cè)OD值。    10)、電泳,檢測(cè)RNA質(zhì)量。  講一下注意事項(xiàng)和可以偷懶的地方。Tri

11、zol現(xiàn)在我發(fā)現(xiàn)好多實(shí)驗(yàn)室都是自己做的,所以也不要吝嗇,多加一點(diǎn)吧,這個(gè)東西可以有效的抑制RNase的活力,情愿偏多,不要偏少。第1)步,在磨樣的時(shí)候,注意,千萬(wàn)要保持低溫,尤其是開始還沒加Trizol的時(shí)候,千萬(wàn)不要讓樣品的溫度升高了,否則就可以和你的RNA說(shuō)拜拜了。在加了Trizol后,情況會(huì)好些,如果研磨充分,那就暫時(shí)安全了。  第2)步的時(shí)候,這里直接加了氯仿,不少protocol上都還要多一步,先離心去渣,取上清后再加氯仿,這兩步完全可以合并,而且感覺合并的話,似乎RNA得率還高些!而且省下一批ep管,還省下一步的時(shí)間。  3)、4)和5)就按照protocol做

12、,可以放松點(diǎn),注意用處理過(guò)的ep管就好了,一般不會(huì)有降解的危險(xiǎn)。  第6)和7)兩步的洗滌會(huì)明顯的減少RNA的鹽含量,對(duì)提高RNA質(zhì)量有很大的幫助,當(dāng)然也會(huì)同時(shí)損失掉一部分的RNA,所以洗幾次,就看你的要求了。  后面幾步,大家就要小心了,現(xiàn)在剩下的可都是精貴的RNA了,做了幾個(gè)小時(shí),可別前功盡棄啊。最后一步,推薦使用進(jìn)口ep管,進(jìn)口管不容易把液體掛在管壁上,這樣,將來(lái)取用的時(shí)候,損失會(huì)小不少。三、其他  在批量提取的時(shí)候,建議用個(gè)大點(diǎn)的ep管架子,否則ep管擠在一起,手戴著手套,一不小心,就容易打翻樣品(哭吧,如果就一份樣)!槍頭的話都是高溫成型的,如果你使用是

13、槍頭是沒開封過(guò)的,一般不用DEPC處理也沒問(wèn)題。主要是怕二次污染,有些工廠是用人工包裝了,不是機(jī)器打包的,那建議處理一下。  友情提示,DEPC是疑似致癌物質(zhì),使用是時(shí)候千萬(wàn)小心!我始終認(rèn)為,安全是第一位的,如果條件允許的話,盡量使用進(jìn)口ep管和槍頭,這樣就不用接觸DEPC了。(TRIZOL提取注意事項(xiàng)TRIZOL試劑是直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA的試劑。它在破碎和溶解細(xì)胞時(shí)能保持RNA的完整性。加入氯仿后離心,樣品分成水樣層和有機(jī)層。RNA存在于水樣層中。收集上面的的水樣層后,RNA可以通過(guò)異丙醇沉淀來(lái)還原。在除去水樣層后,樣品中的DNA和蛋白也能相繼以沉淀的方式還原。乙醇沉淀能

14、析出中間層的DNA,在有機(jī)層中加入異丙醇能沉淀出蛋白。共純化DNA對(duì)于樣品間標(biāo)準(zhǔn)化RNA的產(chǎn)量十分有用。論是人、動(dòng)物、植物還是細(xì)菌組織,該方法對(duì)少量的組織(50-100 mg)和細(xì)胞(5×106)以及大量的組織(1 g)和細(xì)胞(>107)均有較好的分離效果。TRIZOL試劑操作上的簡(jiǎn)單性允許同時(shí)處理多個(gè)的樣品。所有的操作可以在一小時(shí)內(nèi)完成。TRIZOL抽提的總RNA能夠避免DNA和蛋白的污染。故而能夠作RNA 印跡分析、斑點(diǎn)雜交、poly(A)+ 選擇、體外翻譯、RNA酶保護(hù)分析和分子克隆。如果是用于PCR,當(dāng)兩條引物位于單一外顯子內(nèi)時(shí),建議用級(jí)聯(lián)擴(kuò)大的DNase I(Cat.

15、 No. 18068)來(lái)處理抽提的總RNA。RIZOL試劑能促進(jìn)不同種屬不同分子量大小的多種RNA的析出。例如,從大鼠肝臟抽提的RNA瓊脂糖凝膠電泳并用溴化乙啶染色,可見許多介于7 kb和15 kb之間不連續(xù)的高分子量條帶,(mRNA和hnRNA成分)兩條優(yōu)勢(shì)核糖體RNA條帶位于5 kb (28S)和2 kb (18S),低分子量RNA介于0.1 和 0.3 kb之間 (tRNA, 5S)。當(dāng)抽提的RNA用TE稀釋時(shí)其A260/A280比值1.8預(yù)防RNA酶污染:提RNA過(guò)程中任一環(huán)節(jié)的不正確操作都可能導(dǎo)致RNA酶的污染。由于RNA酶的活性很難完全抑制,預(yù)防其污染是十分必要的。在實(shí)際的操作中應(yīng)

16、遵循以下指南:* 全程佩戴一次性手套。皮膚經(jīng)常帶有細(xì)菌和霉菌,可能污染RNA的抽提并成為RNA酶的來(lái)源。培養(yǎng)良好的微生物實(shí)驗(yàn)操作習(xí)慣預(yù)防微生物污染。* 使用滅菌的,一次性的塑料器皿和自動(dòng)吸管抽提RNA,避免使用公共儀器所導(dǎo)致的RNA酶交叉污染。例如,使用RNA探針的實(shí)驗(yàn)室可能用RNA酶A 或 T1來(lái)降低濾紙上的背景,因而某些非一次性的物品(如自動(dòng)吸管)可能富含RNA酶。* 在TRIZOL中,RNA是隔離在RNA酶污染之外的。而對(duì)樣品的后續(xù)操作會(huì)要求用無(wú)RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150°C的烘箱中烘烤4小時(shí)。塑料器皿可以在0.5 M NaOH中浸泡10分鐘,

17、用水徹底漂洗干凈后高壓滅菌備用。其他注意事項(xiàng)* 當(dāng)TRIZOL用量少于2-ml時(shí)建議使用清潔的一次性的聚丙材質(zhì)試管。* 當(dāng)TRIZOL用量較大時(shí),可以使用玻璃試管(Corex)或聚丙材質(zhì)試管,事先檢驗(yàn)以確保該試管可以耐受加入TRIZOL和氯仿后12,000×g的離心力。不可使用有裂縫或者破損的試管。* 離心前小心平衡試管。* 離心前玻璃管口必須蓋上鋁箔并用石蠟?zāi)し饪?,聚丙烯管必須蓋緊。RNA抽提指南注意:用TRIZOL抽提RNA時(shí)要戴手套和護(hù)眼罩。避免接觸皮膚和衣服。在化學(xué)通風(fēng)櫥完成操作。避免呼吸道吸入。如無(wú)例外,所有的操作應(yīng)該在15 -25°C的條件下完成,試劑亦在15

18、-25°C的條件下。RNA提取注意事項(xiàng)一些RNA提取方法,在進(jìn)行具體實(shí)驗(yàn)時(shí),應(yīng)根據(jù)研究對(duì)象的性質(zhì),提取核酸的用途而對(duì)上述方法在操作步驟和試劑使用量上作一定的修改。1、 在核酸提取時(shí),為了增加細(xì)胞的裂解度,增加核蛋白復(fù)合體破碎度,以釋放更多的游離核酸,在操作中常要用到溶菌酶和蛋白酶K,在確保沒有核酸水解酶存在的前提下,酶反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)越好。2、 有時(shí)在使用蛋白酶時(shí),為了抑制核酸水解酶的降解作用,可在蛋白酶緩沖液中用終濃度5mM的EDTA代替NaCL,并且可將反應(yīng)溫度提高到5060,并將反應(yīng)時(shí)間縮短到1525min,但酶用量必須提高1020倍。溶菌酶使用時(shí)緩沖液中需加EDTA,因游離金屬離

19、子對(duì)酶有抑制。3、 許多植物材料中富含酚,在細(xì)胞破碎時(shí),在多酚氧化酶作用下,被氧化成有色的錕類物資,影響核酸的提取及降低提取質(zhì)量,在提取液中加入PVP和巰基乙醇對(duì)降低酚類的干撓可能有所幫助。PVP將與酚形成復(fù)雜的聚合體,在提取時(shí)將酚從核酸成分中游離。且PVP與巰基乙醇作為強(qiáng)還原劑可防止多酚的褐變。另外作為還原劑的這些成分在一定程度上可抑制核酸水解酶的作用。4、 許多生物材料在提取核酸時(shí),都會(huì)遇到多糖的污染問(wèn)題,具體表現(xiàn)為有機(jī)溶劑沉淀時(shí),沉淀很多,但復(fù)溶時(shí),大量沉淀不溶,電泳觀察時(shí)核酸含量很低。      克服多糖污染可采用以下一些辦法1) CTAB多次抽提。2) 在有機(jī)溶劑沉淀時(shí)先稀釋樣品濃度(可到10倍左右),對(duì)低濃度樣品再進(jìn)行沉淀。3) 在有機(jī)溶劑沉淀時(shí)選用異丙醇和5MNaCL作為沉淀溶劑,此時(shí)氯化鈉的用量可用到1/5-1/2的體積,異丙醇可用到0.6-1的體積。異丙醇沉淀核酸時(shí),高濃度鹽存在將使大量多糖存在在溶液中,從而可達(dá)到去多糖的作用。但高濃度的鹽存在會(huì)影響核酸的進(jìn)一步操作,因此必須用乙醇多次洗滌脫鹽。5、 在核酸提取時(shí),酚與氯仿均起到變性

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