1、胚胎移植前遺傳病診斷的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)研究    胚胎移植前遺傳病診斷的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)研究    中華婦產(chǎn)科雜志 2000年第8期第35卷 植入前遺傳學(xué)診斷    作者：紀(jì)亞忠趙亞南盛毅馬錦琪張其    單位：紀(jì)亞忠（200433 上海, 第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)技術(shù)中心）；趙亞南（200433 上海, 第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)技術(shù)中心）；盛毅（200433 上海, 第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)技術(shù)中心）；馬錦琪（200433 上海,

2、 第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)技術(shù)中心）；張其（200433 上海, 第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)技術(shù)中心）    關(guān)鍵詞： 植入前診斷；聚合酶鏈反應(yīng)；活組織檢查；胚泡移植    【摘要】目的利用人囊性纖維增生癥 (cystic fibrosis, CF)F508 突變基因轉(zhuǎn)基因小鼠，進(jìn)行胚胎移植前遺傳病診斷(preimplantation genetic diagnosis, PGD) 的臨床前期研究。方法通過(guò)輸卵管沖洗術(shù)，獲得48細(xì)胞階段、雜合子F508基因早期胚胎，進(jìn)行單個(gè)卵裂球活檢后再將活檢后的胚胎移植至假

3、孕雌性小鼠。同時(shí)利用套式聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，對(duì)活檢所得的單個(gè)卵裂球分別進(jìn)行F508 突變基因檢測(cè)。結(jié)果（1）活檢胚胎的孵出率（4細(xì)胞期84.6%,8細(xì)胞期90.0%，n=102）、移植后種植率（4細(xì)胞期66.7%,8細(xì)胞期70.3%，n=79）、小鼠出生體重及出生3周時(shí)主要臟器重量（n=133），與未活檢對(duì)照鼠無(wú)顯著差異（P0.05）。（2）利用套式聚合酶鏈反應(yīng)行基因擴(kuò)增（n=32），對(duì)單個(gè)卵裂球F508突變基因的診斷成功率為100.0%。 結(jié)論在小鼠胚胎4 細(xì)胞或8細(xì)胞階段實(shí)施單個(gè)卵裂球顯微活檢，不影響胚胎的進(jìn)一步分化以及小鼠出生后正常生長(zhǎng)發(fā)育；利用顯微活檢得到的單個(gè)卵裂球進(jìn)行突變基因診斷是可

4、行的。    Preclinical Study of Preimplantation Genetic Diagnosis in Animal    JI Yazhong, ZHAO Yanan, SHENG Yi, et al.    （Center of Reproductive Medicine, Changhai Hospital, Second Military Medical Univerity， Shanghai 200433, China） 

5、0;  【Abstract】ObjectiveTo perform preimplantation genetic diagnosis (PGD) in transgenic mice. MethodsSingle blastomere from murine heterozygous pre-embryo at 4 or 8-cell stage was sampled by microbiopsy for detection of the human gene F508 mutation of cystic fibrosis and biopsied pre-embry

6、o was transferred to Swiss mice foster mothers. F508 mutation detection on the single blastomere was performed with nested polymerase chain reaction(PCR). Results(1) Significant difference was not observed statistically for the in vitro hatching rate (n=102), the birth rate (n=79), birth weight and

7、organ weight (n=133) at 3 weeks after births between mice born from biopsied embryos and controls. (2) Thirty-two nested PCR were performed for the diagnosis of the cystic fibrosis F508 mutation, with 100.0% specificity and 100.0% sensitivity. ConclusionsMicrobiopsy of pre-embryos with 4 or 8-cells

8、did not alter their viability and further development. The technique of nested PCR on a single blastomere for the detection of cystic fibrosis F508 mutation is reliable.    【Key words】Preimplantation diagnosis; Polymerase chain reaction; Biopsy; Embryo transfer   &

9、#160;胚胎移植前遺傳疾病診斷（preimplantation gen- etic diagnosis,PGD），指對(duì)有高危遺傳疾患夫婦進(jìn)行體外受精（in-vitro fertilization, IVF），當(dāng)早期胚胎(pre-embryo)發(fā)育至48個(gè)細(xì)胞時(shí)，利用顯微操作系統(tǒng)活檢1、2個(gè)卵裂球，進(jìn)行遺傳疾病診斷。根據(jù)遺傳診斷結(jié)果，僅將正常胚胎移植至子宮1-3。該技術(shù)由英國(guó)Handyside醫(yī)生小組首創(chuàng)，于1990年第1例妊娠成功1。目前PGD已成功應(yīng)用于以下疾?。虹犘渭t細(xì)胞貧血4、血友病2、囊性纖維增生癥3、地中海貧血5 和自毀容貌綜合征6 等。目前已有近200名健康新生兒經(jīng)此技術(shù)出生，1

10、997年1月至1998年9月有66例臨床妊娠7。 鑒于PGD技術(shù)的先進(jìn)性、復(fù)雜性及針對(duì)我國(guó)計(jì)劃生育、優(yōu)生優(yōu)育工作的必要性，本研究以囊性纖維增生癥轉(zhuǎn)基因小鼠為模型，進(jìn)行PGD技術(shù)的臨床前期研究。    材料及方法    一、實(shí)驗(yàn)材料    1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：正常雌性小鼠（品系為C57BL6×CBAF1）由法國(guó)轉(zhuǎn)基因公司贈(zèng)送。    2顯微操作系統(tǒng)：為Nikon系列產(chǎn)品，含倒置顯微鏡（TE300）、Narishige系列顯微操作桿 (N

11、T-88)、拉針器 (PB-7)、鍛針器 (MF-9)、磨針器 (ET-40)。    3基因擴(kuò)增儀：為Gen Amp 9600 型(美國(guó)PEKIN ELMER公司產(chǎn)品)。    4試劑：聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）引物、Taq酶、核苷酸購(gòu)自美國(guó)Promega公司，其余試劑為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。    二、實(shí)驗(yàn)方法    1雜合子早期胚胎的收集8：正常雌性小鼠經(jīng)孕馬血清、人絨毛膜促性腺激素（hCG）促排卵，與帶有人囊性纖維增生癥F508突

12、變基因的雄性轉(zhuǎn)基因純合子小鼠交尾成功2 d后處死。經(jīng)離體輸卵管沖洗術(shù)取得48細(xì)胞階段、攜有F508轉(zhuǎn)基因雜合子的早期胚胎。    2實(shí)驗(yàn)分組：小鼠早期胚胎的直徑約80 m。共收集4細(xì)胞及8細(xì)胞早期胚胎213個(gè)、214個(gè)。其中4細(xì)胞胚胎用于活檢122個(gè)，未活檢為91個(gè)；8細(xì)胞胚胎用于活檢128個(gè)，未活檢為86個(gè)。    3胚胎活檢、培養(yǎng)及移植：早期胚胎活檢在Nikon顯微操作系統(tǒng)上進(jìn)行?；顧z針外徑約30 m，固定針外徑約60 m?；顧z前使用Tyrod液（pH值2.5）消化透明帶，以便完整吸出單個(gè)卵裂球。M2培養(yǎng)基用于

13、胚胎的收集、活檢及移植，M16培養(yǎng)基用于胚胎的培養(yǎng)8。所有胚胎均培養(yǎng)于賀利氏培養(yǎng)箱中，溫度37、二氧化碳濃度5%。假孕Swiss小鼠經(jīng)苯巴比妥（0.5 mg/10 g）麻醉后進(jìn)行胚胎移植8。    4. F508基因檢測(cè)：采用套式PCR方法?；顧z所得的單個(gè)卵裂球在倒置顯微鏡下，經(jīng)雙蒸水洗滌3次后移入0.5 ml Eppendorf管中。其中含10 l雙蒸水及20 l消毒石蠟油。所有Eppendorf管均保存于-20備用。按文獻(xiàn)3采用套式PCR引物和反應(yīng)條件進(jìn)行。    三、 統(tǒng)計(jì)分析  

14、0; 原始數(shù)據(jù)由statview軟件（美國(guó)Abacus公司產(chǎn)品）處理，組間差異用2和方差分析比較。    結(jié)果    4細(xì)胞及8細(xì)胞早期胚胎的活檢成功率分別為90.2% 及93.8%。以上兩個(gè)階段的早期胚胎在活檢后培養(yǎng)至孵出或直接行胚胎移植。與未活檢胚胎相比，胚胎孵出率及移植成功率差異均無(wú)顯著性（P0.05,表1）。待自然分娩，行活檢的新生小鼠出生體重、3周時(shí)體重及心、肝、腎臟重量，與正常小鼠相比，差異無(wú)顯著性（P0.05,表2）。隨機(jī)取20個(gè)活檢所得的F508雜合子卵裂球，另加12管不同陰性對(duì)照，共進(jìn)行

15、32次套式PCR反應(yīng)。結(jié)果對(duì)F508的診斷成功率為100.0%，未見(jiàn)假陽(yáng)性或假陰性。    討論    一、PGD的臨床意義及安全性    PGD是當(dāng)今唯一能在實(shí)驗(yàn)條件下，避免妊娠患兒的先進(jìn)技術(shù)。較傳統(tǒng)的早期產(chǎn)前診斷免除了終止妊娠對(duì)母體身心的損傷。另外，PGD尚可為不全流產(chǎn)、反復(fù)IVF失敗或同時(shí)帶有遺傳疾患的不孕夫婦帶來(lái)福音。 早期胚胎的活檢是否影響到胚胎的進(jìn)一步分化及發(fā)育，這是開(kāi)展臨床PGD技術(shù)之前應(yīng)首先回答的關(guān)鍵問(wèn)題。大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，早期胚胎活檢后，除其隨后幾天的分裂

16、速度稍慢外9，活檢并不影響胚胎的進(jìn)一步分化發(fā)育10。本研究以小鼠出生體重、3周時(shí)體重與心臟、肝臟、腎臟的重量為指標(biāo)，與未活檢者相比無(wú)顯著差異。另外，在近10年來(lái)經(jīng)PGD出生的近200名新生兒中，未見(jiàn)有明顯異常7,11。初步表明了該技術(shù)的安全性，但還有待進(jìn)一步觀察、研究。    表148細(xì)胞胚胎活檢成功率、胚胎孵出率、移植成功率比較            類別    活檢  &#

17、160; 培養(yǎng)    移植                胚胎數(shù)    （個(gè)）    成功數(shù)    （個(gè)）    成功率    (%)    胚胎數(shù)&

18、#160;   （個(gè)）    孵出數(shù)    （個(gè)）    孵出率    （%）    胚胎數(shù)    （個(gè)）    成功數(shù)    （個(gè)）    成功率    (%)

19、0;           4細(xì)胞            活檢    122     110     90.2    52     44   

20、     84.6*    42     28         66.7*            未活檢              

21、;  51     47     92.2     40     29     72.5             8細(xì)胞           

22、0;活檢    128     120     93.8     50     45     90.0*    37     26     70.3*       

23、60;    未活檢                54     51     94.4    32    23     71.9      

24、;      與未活檢者比較，*P0.05表248細(xì)胞胚胎活檢與未活檢的小鼠出生時(shí)體重、生后3周體重及心、肝、腎臟重量（g，±s)            類別    只數(shù)    出生體重    生后3周時(shí)體重    生后3周時(shí)器官體重 &#

25、160;          心臟     肝臟    腎臟            4細(xì)胞            活檢    28 

26、   1.41±0.10*    10.74±1.06*    0.098±0.007*    0.658±0.067*    0.095±0.007*            未活檢    29

27、60;   1.41±0.07    10.76±0.79     0.099±0.009    0.642±0.058*    0.096±0.007*            8細(xì)胞    

28、0;       活檢    26    1.42±0.09*    10.76±0.98*    0.100±0.011*    0.642±0.050*    0.096±0.012*    &#

29、160;       未活檢    23     1.41±0.09    10.86±1.04     0.098±0.010    0.642±0.056*    0.098±0.012*    

30、        正常鼠    27    1.43±0.08    10.97±1.00     0.102±0.007     0.670±0.049     0.099±0.009    

31、;        *與未活檢者比較， P0.05二、進(jìn)行PGD的基本條件    PGD技術(shù)誕生已近10年，但該項(xiàng)技術(shù)仍僅被少數(shù)實(shí)驗(yàn)室所掌握，其原因有以下3個(gè)方面。    1. 診斷準(zhǔn)確性要求高。實(shí)驗(yàn)室診斷的準(zhǔn)確性依賴于材料的多少及質(zhì)量。現(xiàn)有的常規(guī)PCR技術(shù)需要一定量的DNA模板，根據(jù)基因拷貝數(shù)，一般至少要102105個(gè)細(xì)胞。但PGD時(shí)僅可獲得1、2個(gè)細(xì)胞，因而其成功關(guān)鍵在于減少假陽(yáng)性和假陰性，提高PGD技術(shù)的精確性。本研究采用套式PCR

32、技術(shù)，獲得了100% 的成功率。但在此之前的用白細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)單細(xì)胞套式PCR技術(shù)的探索，其失敗的主要原因在于材料污染。    2. 診斷速度要求快。由于尚沒(méi)有理想的早期胚胎培養(yǎng)條件，活檢后的早期胚胎應(yīng)在當(dāng)日，即68 h內(nèi)植入子宮，以保證活檢早期胚胎的種植成功率。有學(xué)者曾提出先冷凍活檢后的早期胚胎，待在較充裕的時(shí)間明確診斷后再進(jìn)行解凍及移植。遺憾的是，活檢胚胎的冷凍及解凍所造成創(chuàng)傷，會(huì)影響移植后的成功率。    3. 成熟的試管嬰兒助孕技術(shù)基礎(chǔ)。IVF（包括卵細(xì)胞內(nèi)單精子注射）后獲得早期胚胎是PGD的基礎(chǔ)。擁有成熟的試

33、管嬰兒技術(shù)，就能為PGD提供更多高質(zhì)量的早期胚胎，提高PGD成功的可能性。    另外，整個(gè)PGD技術(shù)涉及婦科、內(nèi)分泌、B超、胚胎及分子生物學(xué)等多個(gè)學(xué)科，其中胚胎學(xué)及分子生物學(xué)的緊密協(xié)作是PGD技術(shù)成功的關(guān)鍵因素。    除通過(guò)卵裂球活檢進(jìn)行PGD技術(shù)外，還可作第一極體、第二極體12及囊胚活檢13等。根據(jù)具體疾患還可采用原位雜交14 、熒光PCR、原位PCR及隨機(jī)引物預(yù)擴(kuò)增技術(shù)15。    三、PGD誤診原因    PGD技術(shù)在不斷完善

34、，但仍存在一定的誤診。誤診的原因除取材失敗如細(xì)胞未能移入反應(yīng)管、卵裂球無(wú)核等，與所用實(shí)驗(yàn)技術(shù)的局限性以及體外胚胎發(fā)育異常有關(guān)。如胚胎發(fā)育過(guò)程中嵌合體及多核卵裂球現(xiàn)象、合子后異常等, 在PCR診斷時(shí)出現(xiàn)的等位基因脫扣、原位雜交診斷時(shí)的信號(hào)缺失與重疊。    本研究受上海市科學(xué)技術(shù)發(fā)展基金資助(項(xiàng)目編號(hào)：984119003)    參考文獻(xiàn)    1，Handyside AH, Kontogianni EH, Hardy K, et al. Pregnancies from bi

35、opsied human preimplantation embryo sexed by Y-specific DNA amplification. Nature, 1990, 344:768-770.    2，Grifo JA, Tang YX, Cohen J, et al. Pregnancy after embryo biopsy and coamplification of DNA from X and Y chromosomes. JAMA, 1992, 268:727-729.    3，Handy

36、side AH, Lesko JG, Tarin JJ, et al. Birth of a normal girl after in vitro fertilization and preimplantation diagnostic testing for cystic fibrosis. N Engl J Med, 1992, 327:905-909.    4，Xu K, Shi ZM, Veeck LL, et al. First unaffected pregnancy using preimplantation genetic diagno

37、sis for sickle cell anemia. JAMA, 1999, 281:1701-1706.    5，Kuliev A, Rechitsky S, Verlinsky O, et al. Birth of healthy children after preimplantation diagnosis of thalassemias. J Assist Reprod Genet, 1999, 16:207-211.    6，Verlinsky Y, Handyside AH, Simpson J

38、L, et al. Current progress in preimplantation genetic diagnosis. J Assist Reprod Genet, 1993, 10:353-360.    7，Geraedts J, Handyside A, Harper J, et al. ESHRE Preimplantation Genetic Diagnosis (PGD) Consortium: preliminary assessment of data from January 1997 to September 1998， ESHRE PGD Consortium Steering Committee. Hum Reprod, 1999, 14:3138-3148.    8，Hogan B, Costantini F, Lacy E. Manipulating the mouse embryo, a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1986. 91-147.    9，Tarin JJ, Handyside AH. Embryo