.,第九章糖代謝相關(guān)檢驗,學(xué)習(xí)內(nèi)容,第一節(jié)血糖測定,第二節(jié)血清糖基化蛋白測定,第三節(jié)胰島素釋放及C肽釋放試驗,第四節(jié)糖代謝產(chǎn)物測定,第五節(jié)其他糖測定,學(xué)習(xí)目標(biāo),掌握血糖及口服糖耐量試驗的概念、實驗原理、操作方法及臨床應(yīng)用；掌握糖化血清蛋白測定的原理、方法學(xué)評價及臨床應(yīng)用,熟悉胰島素及胰島素釋放試驗的臨床應(yīng)用；熟悉C-肽及C-肽釋放試驗的臨床應(yīng)用。,了解血乳酸、丙酮酸、-羥丁酸及其他糖的測定。,能規(guī)范、熟練地進行血糖測定、口服糖耐量試驗、糖化血紅蛋白和糖化血清蛋白的測定，并正確解釋實驗結(jié)果,糖是一類化學(xué)本質(zhì)為多羥醛或多羥酮及其衍生物的有機化合物，糖代謝（carbohydratemetabolism）指葡萄糖(glucose，Glc)、糖原(glycogen，Gn)等在體內(nèi)的一系列復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)。在人體內(nèi)糖的主要形式是葡萄糖(glucose，Glc)及糖原(glycogen，Gn)。葡萄糖是糖在血液中的運輸形式，在機體糖代謝中占據(jù)主要地位；糖原是葡萄糖的多聚體,包括肝糖原、肌糖原和腎糖原等，是糖在體內(nèi)的儲存形式。葡萄糖與糖原都能在體內(nèi)氧化提供能量。,前言,臨床常用檢測試驗：血糖濃度測定，口服葡萄糖耐量試驗，糖化血紅蛋白測定，糖化血清蛋白測定，胰島素及胰島素釋放試驗，C-肽及C-肽釋放試驗，糖代謝產(chǎn)物（血乳酸、丙酮、-羥丁酸）測定，其他糖（果糖、半乳糖）測定等。,.,第一節(jié)血糖測定,血糖一般指血液中的葡萄糖。在激素等因素的調(diào)節(jié)下，血糖濃度保持相對恒定。健康人群空腹血糖的參考范圍通常為3.896.11mmol/L（70110mg/dl），但2003年美國糖尿病協(xié)會（ADA）建議下調(diào)參考范圍上限為5.6mmol/L（100mg/dl）。,血糖,血糖濃度取決于血糖的來源及去路的動態(tài)平衡。血糖的來源主要受機體進食的影響，而去路則取決于機體對血糖的利用。,一、糖代謝概述,根據(jù)機體所處的不同狀態(tài)，血糖主要有三個來源：1食物中糖類的消化吸收2糖原的分解3非糖物質(zhì)的轉(zhuǎn)化,（一）血糖的來源,葡萄糖的代謝過程根據(jù)機體的需要而定，主要代謝去路有：1有氧氧化2合成糖原3轉(zhuǎn)換為非糖物質(zhì)4轉(zhuǎn)換為其他糖類衍生物5生成尿糖,（二）血糖的去路,血糖的來源與去路,血糖如何維持穩(wěn)定？關(guān)鍵酶調(diào)節(jié)關(guān)鍵酶如何調(diào)節(jié)激素調(diào)節(jié)常見的升高血糖的激素胰高血糖素、糖皮質(zhì)激素和腎上腺素常見的降低血糖的激素胰島素,二、血糖濃度的調(diào)節(jié),定義：胰島素（insulin）是由胰島細胞合成分泌的多肽激素。它主要作用于肝臟、骨骼肌和脂肪組織。功能：一方面促進這些組織細胞攝取葡萄糖，并轉(zhuǎn)換成糖原或脂肪貯存；另一方面抑制肝臟的糖原分解和糖異生，從而降低血糖。,（一）降低血糖的激素胰島素,定義功能,化學(xué)構(gòu)成人胰島素含51個氨基酸殘基，分子量5808，由A、B兩條鏈組成，含兩個鏈間二硫鍵和一個鏈內(nèi)二硫鍵。人胰島素有別于其他生物的胰島素，但其B鏈的C末端（B23B26）具有高度保守性，是胰島素生物學(xué)活性的決定性區(qū)域，故不同來源的胰島素在免疫學(xué)和生物學(xué)活性上有相似性,（一）降低血糖的激素胰島素,合成過程首先在胰島細胞的核糖體上合成含100個氨基酸殘基的前胰島素原（preproinsulin）。前胰島素原很快被酶切去信號肽，生成86個氨基酸的胰島素原（proinsulin）。最后胰島素原通過蛋白酶作用，切掉4個氨基酸殘基，水解為51個氨基酸的胰島素和31個氨基酸的C-肽（C-peptide）。,（一）降低血糖的激素胰島素,（一）降低血糖的激素胰島素,前胰島素原（preproinsulin）,胰島素原（proinsulin）,胰島素（insulin）,C-肽（C-peptide）,釋放激動劑：葡萄糖、氨基酸、胰腺、胃腸激素等。阻斷劑：高血糖、生長抑素和-腎上腺素能。,（一）降低血糖的激素胰島素,胰島素主要為肝臟攝取并降解，少量由腎小球濾過，并在近曲小管重吸收和降解。胰島素在體循環(huán)中的生物半壽期為45min。主要通過胰島素和胰島素受體的結(jié)合，觸發(fā)細胞內(nèi)特異性的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。,（一）降低血糖的激素胰島素,降解作用機制,胰島素樣生長因子（insulinlikegrowthfactors，IGF）是一種多肽，與胰島素的結(jié)構(gòu)相似，具有類似于胰島素的代謝作用和促生長作用，主要有IGFI和IGFII。IGFI又稱生長調(diào)節(jié)素C（somatomedinC），是細胞生長和分化的主要調(diào)節(jié)因子之一，而IGFII的生理作用尚不清楚。IGFI主要由肝臟產(chǎn)生，其他許多阿組織也可合成IGFI，但不入血，僅在局部發(fā)揮作用。血液中，IGF濃度約比胰島素高1000倍，但絕大部分與特異性蛋白質(zhì)結(jié)合，僅少量以游離形式存在。而胰島素在血液中全部是游離的，因此相比胰島素，血液中IGF的活性很低。IGF通過特異性的IGF受體或胰島素受體而發(fā)揮作用。,（一）降低血糖的激素胰島素樣生長因子,IGFI在正常糖代謝中的作用尚不清楚，外源性注入可導(dǎo)致低血糖，而IGFI缺乏可引起生長遲緩。胰腺外腫瘤可致IGF的生成過量，患者可有饑餓性低血糖。測定IGFI濃度可評價生長激素的缺乏和過量，監(jiān)測機體的營養(yǎng)狀況。,（一）降低血糖的激素胰島素樣生長因子,胰高血糖素和腎上腺素,（二）升高血糖的激素,刺激葡萄糖釋放,減少葡糖糖利用,生長激素和皮質(zhì)醇,血糖的激素調(diào)節(jié),.,如果調(diào)節(jié)失衡，結(jié)果是什么？,高血糖或者低血糖低血糖：低于2.8mmol/L。高血糖：高于7.1mmol/L（高于8.89mmol/L，出現(xiàn)糖尿）。最常見病理性高血糖：糖尿病。,高血糖癥與糖尿病,高血糖癥（hyperglycemia）是糖代謝紊亂導(dǎo)致血糖濃度高于參考上限的一種異?，F(xiàn)象，主要表現(xiàn)為空腹血糖損傷、糖耐量減退或糖尿病。其中，空腹血糖損傷和糖耐量減退是正常糖代謝與糖尿病之間的中間狀態(tài)，皆系發(fā)展為糖尿病及心血管病變的危險因子和標(biāo)志，而糖尿病是一組嚴(yán)重的代謝性疾病。,糖尿病的發(fā)病機制與分型,糖尿?。╠iabetesmellitus,DM）是一組由于胰島素分泌不足或/和胰島素作用低下而引起的糖代謝紊亂性疾病。分型：型糖尿病、型糖尿病臨床癥狀:“三多一少”，即多尿、煩渴、多飲和體重減輕。,.,型糖尿病又叫青年發(fā)病型糖尿病或胰島素依耐型糖尿病。原因：胰腺產(chǎn)生胰島素的細胞已經(jīng)徹底損壞,從而完全失去了產(chǎn)生胰島素的功能.治療：依賴胰島素治療。,型糖尿病又叫非胰島素依耐型糖尿病。原因：自身能夠產(chǎn)生胰島素，但細胞無法對其作出反應(yīng)，使胰島素?zé)o法發(fā)揮作用。治療：需要胰島素單獨或與口服藥聯(lián)合應(yīng)用的治療,.,測定方法無機化學(xué)法有機化學(xué)法酶法參考范圍3.9-6.1mmol/L(70110mg/dL)臨床意義高血糖癥低血糖癥,三、血清（漿）葡萄糖測定與評價,原理葡萄糖在和堿性銅試劑混合加熱后，可使Cu2+還原成Cu+，后者與磷鉬酸試劑作用生成藍色的鉬藍。通過比色法測定藍色化合物，計算出血糖的含量特異性差、易受其他還原性物質(zhì)的干擾，現(xiàn)已淘汰空腹正常血糖參考值4.4-6.7mmol/L或80-120mg/dL,無機化學(xué)法：Folin-Wu法,.,有機化學(xué)法：鄰甲苯胺法,原理：葡萄糖為一含醛基的已糖，在酸性條件下加熱，可脫水生成5-羥甲基-2-呋喃甲醛，后者與鄰甲苯胺縮合成青色的Schiff堿。Schiff堿顏色的深淺與樣品中葡萄糖的含量成正比。評價：操作簡便，特異性高，操作簡便，可直接采用血漿或血清進行測定，但其使用的試劑具有腐蝕性和致癌性，現(xiàn)應(yīng)用較少。,酶法,葡萄糖氧化酶(GOD)法,己糖激酶(HK)法,葡萄糖脫氫酶法,國際公認,國家推薦,實驗9-1葡萄糖氧化酶（glucoseoxidase,GOD）法測定血糖,原理：葡萄糖氧化酶利用氧和水將葡萄糖氧化為葡萄糖酸，并釋放過氧化氫。過氧化氫在過氧化物酶(peroxidase，POD)作用下，分解為水和氧的同時將無色的4-氨基安替比林與酚氧化縮合生成紅色的醌類化合物。紅色的深淺在一定范圍內(nèi)與葡萄糖濃度成正比，在510nm波長處測定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)管比較可計算出血糖的濃度。,試劑準(zhǔn)備磷酸鹽緩沖液（0.1mol/L,pH7.0）酶試劑葡萄糖氧化酶1200U，過氧化物酶1200U，4-氨基安替比林10mg，溶于上述磷酸鹽緩沖液80mL中，調(diào)pH7.0，定容至100mL，2-8保存，可保存3個月酚溶液重蒸餾酚100mg溶于100mL蒸餾水中，避光、2-8保存，可保存1個月苯甲酸溶液（12mol/L）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（5.0mmol/L）,.,實驗操作,混勻，置37水浴保溫15分鐘，每管加蒸餾水0.5ml，在510nm波長處比色，以空白管調(diào)零，讀取各管吸光度。根據(jù)各管吸光度計算其血糖濃度。結(jié)果計算,取3支試管，按下表操作,葡萄糖含量（mmol/L）,.,自動化分析儀檢測,試劑主要成分與手動檢測類似，見試劑盒說明書。工作液配置：根據(jù)標(biāo)本量，臨時將酶試劑與緩沖液按照1:4比例混勻。操作定標(biāo)、質(zhì)量控制、標(biāo)本上機結(jié)果計算1mg/dLX0.0555=0.0555mmol/L,.,葡萄糖氧化酶法可直接測定腦脊液的葡萄糖含量，但不能直接測定尿液葡萄糖含量。這是因為尿液中的尿酸等干擾物質(zhì)濃度過高，可干擾過氧化物酶反應(yīng)，造成結(jié)果假性偏低。對于血液樣品需及時分離紅細胞。因為紅細胞的酵解將會導(dǎo)致測定結(jié)果偏低。建議測定樣品以草酸鉀-氟化鈉為抗凝劑以抑制糖酵解。,注意事項,.,嚴(yán)重黃疸、溶血及乳糜樣血清先制備無蛋白血濾液，然后在進行測定。酶酚混合液一般現(xiàn)用現(xiàn)配。葡萄糖氧化酶對-D葡萄糖高度特異，溶液中的葡萄糖約36%為型，64%為型。葡萄糖的完全氧化需要型到型的變旋反應(yīng)。葡萄糖變旋酶，可加速這一反應(yīng)，延長孵育時間可達到完成自發(fā)變旋過程。新配制的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液主要是型，故須放置2h以上(最好過夜)，待變旋平衡后方可應(yīng)用。,注意事項,.,計算：,葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液：5mmol/L血清葡萄糖（mmol/L）=AT/ASCS,參考值：,3.96.1mmol/L,.,本法測定葡萄糖非常特異，從原理反應(yīng)式中可知第一步是特異反應(yīng)，第二步特異性較差。誤差往往發(fā)生在反應(yīng)的第二步。一些還原性物質(zhì)如尿酸、維生素C、膽紅素和谷胱甘肽等，可與色原性物質(zhì)競爭過氧化氫，從而消耗反應(yīng)過程中所產(chǎn)生的過氧化氫，產(chǎn)生競爭性抑制，使測定結(jié)果偏低。但是對測定結(jié)果無顯著影響。,實驗誤差分析：,實驗9-2己糖激酶（HK）法測定血糖,原理：,NADPH在340nm有吸收峰，其吸光度增加與標(biāo)本中的葡萄糖濃度成正比。,評價：本法特異性高，靈敏度高，干擾因素少，適用于自動化分析，為葡萄糖測定的參考方法，但是試劑較貴。,試劑盒配方,.,實驗操作,（2）混勻，置37水浴保溫10分鐘，在340nm波長處比色，比色皿光徑1cm、以蒸餾水調(diào)零，讀取各管吸光度。根據(jù)各管吸光度計算其血糖濃度。（3）結(jié)果計算,1）終點法（1）按下表操作,.,實驗操作,2）速率法以半自動生化分析儀為例（1）主要參數(shù)如下系數(shù)8.2孵育時間30s監(jiān)測時間60s波長340nm比色皿光徑1.0cm溫度37吸液量0.5mL（2）加樣（3）結(jié)果計算血清葡萄糖（mmol/L）=(A/T)8.2,注意事項及評價,試劑要求：各工具酶均需高純度產(chǎn)品。準(zhǔn)確度及精密度較高，適用于自動分析儀，但試劑較貴。己糖激酶法測定血糖不收輕度溶血、脂血、黃疸、尿酸、維生素C等干擾，但嚴(yán)重溶血的標(biāo)本會影響測定結(jié)果。罕見病癥病例，特別是IgM型中，血液葡萄糖測定結(jié)果不可靠。,.,不同檢測方法所提供的空腹正常血糖參考值存在差異。葡萄糖氧化酶法：3.96.1mmol/LFolin-Wu法：4.46.7mmol/L鄰-甲苯胺法：3.96.1mmol/L,.,葡萄糖氧化酶法：該法特異性高，反應(yīng)條件溫和，能反映血中葡萄糖的真實含量，且已推廣出試劑盒，廣泛應(yīng)用與臨床。己糖激酶法：特異性高，靈敏度高，干擾因素少，適用于自動化分析，為葡萄糖測定的參考方法，但是試劑較貴。Folin-Wu法：該法對葡萄糖無特異性，一切還原物質(zhì)均可產(chǎn)生同樣的反應(yīng)。鄰-甲苯胺法：該法涉及強酸、加熱等反應(yīng)條件，不便于大規(guī)模檢測，且鄰甲苯胺須蒸餾后使用，有毒性，臨床和科研上已很少采用。,血糖測定方法特點,測定方法無機化學(xué)