基于IVIAT技術(shù)剖析腸炎沙門菌體內(nèi)感染相關(guān)因子的研究一、引言1.1研究背景與意義腸炎沙門菌（SalmonellaEnteritidis）作為腸桿菌科沙門菌屬的重要成員，是全球范圍內(nèi)極具威脅的食源性病原菌。其宿主范圍極為廣泛，涵蓋人類、家禽、家畜以及寵物等各類動(dòng)物，可通過(guò)多種途徑傳播，其中食入被污染的肉制品（主要是禽類）及蛋制品是人類感染的主要來(lái)源。在家禽養(yǎng)殖領(lǐng)域，腸炎沙門菌的感染會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的腸道疾病，導(dǎo)致家禽生長(zhǎng)發(fā)育受阻、產(chǎn)蛋量顯著下降，甚至造成大量死亡，給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，在部分家禽養(yǎng)殖場(chǎng)，因腸炎沙門菌感染導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失每年可達(dá)數(shù)百萬(wàn)甚至上千萬(wàn)元。而對(duì)于人類健康而言，腸炎沙門菌感染后會(huì)引發(fā)一系列臨床癥狀，如發(fā)熱、惡心、嘔吐、腹瀉等，嚴(yán)重時(shí)還可能發(fā)展為敗血癥，對(duì)患者的生命安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅。尤其對(duì)于幼兒、老年人以及免疫力低下的人群，感染后的病情往往更為嚴(yán)重，甚至可能危及生命。病原微生物的感染是一個(gè)復(fù)雜的、動(dòng)態(tài)的多因子作用過(guò)程，需要眾多毒力基因表達(dá)產(chǎn)物的協(xié)調(diào)一致，并能與宿主的免疫系統(tǒng)一同進(jìn)化。在感染過(guò)程中，病原微生物會(huì)根據(jù)感染部位所遇到的環(huán)境因素的改變隨時(shí)調(diào)控其毒力基因的表達(dá)，其中被誘導(dǎo)表達(dá)的體內(nèi)誘導(dǎo)基因起著至關(guān)重要的作用，如參與病原微生物的粘附、侵襲、營(yíng)養(yǎng)獲取、調(diào)節(jié)以及結(jié)構(gòu)整合等過(guò)程。因此，這些體內(nèi)誘導(dǎo)基因有可能是病原微生物的毒力決定因子，也是良好保護(hù)性抗原和藥物的靶標(biāo)。深入研究腸炎沙門菌的體內(nèi)感染相關(guān)因子，對(duì)于全面理解其致病機(jī)制具有不可替代的重要意義。通過(guò)揭示這些因子在感染過(guò)程中的具體作用和調(diào)控機(jī)制，我們能夠從分子層面深入了解腸炎沙門菌與宿主之間的相互作用關(guān)系，為開發(fā)更加有效的防治策略提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。在藥物研發(fā)方面，這些體內(nèi)感染相關(guān)因子可作為極具潛力的藥物靶點(diǎn)，為開發(fā)新型抗菌藥物指明方向。通過(guò)針對(duì)這些靶點(diǎn)設(shè)計(jì)和篩選特異性藥物，有望實(shí)現(xiàn)對(duì)腸炎沙門菌感染的精準(zhǔn)治療，提高治療效果，減少耐藥性的產(chǎn)生。在疫苗研發(fā)領(lǐng)域，基于對(duì)體內(nèi)感染相關(guān)因子的認(rèn)識(shí)，我們可以篩選出更具免疫原性的抗原，開發(fā)出更高效、更安全的新型疫苗，從而有效預(yù)防腸炎沙門菌的感染，降低其對(duì)人類健康和養(yǎng)殖業(yè)的危害。然而，目前對(duì)于腸炎沙門菌體內(nèi)感染相關(guān)因子的研究仍存在諸多空白和不足。傳統(tǒng)的研究方法在鑒定這些因子時(shí)存在一定的局限性，無(wú)法全面、準(zhǔn)確地篩選出所有與感染相關(guān)的基因和蛋白。因此，迫切需要一種更加高效、準(zhǔn)確的技術(shù)來(lái)深入研究腸炎沙門菌的體內(nèi)感染相關(guān)因子。體內(nèi)誘導(dǎo)抗原技術(shù)（IVIAT）的出現(xiàn)為這一研究領(lǐng)域帶來(lái)了新的契機(jī)。IVIAT技術(shù)巧妙地融合了免疫學(xué)與基因組學(xué)的原理和方法，能夠利用宿主感染血清篩選出在病原體感染宿主過(guò)程中特異性表達(dá)的抗原基因。該技術(shù)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，它不依賴于特殊的動(dòng)物模型，能夠快捷、簡(jiǎn)單地鑒定出體內(nèi)誘導(dǎo)基因，為研究腸炎沙門菌的致病機(jī)制、開發(fā)新的藥物和疫苗提供了新的線索和方法。1.2腸炎沙門菌研究現(xiàn)狀腸炎沙門菌是一種革蘭氏陰性桿菌，其形態(tài)特征表現(xiàn)為大小約(0.7-1.5)μm×(2.0-5.0)μm，周身具有鞭毛，能自由運(yùn)動(dòng)，多數(shù)菌株還帶有菌毛，但無(wú)芽孢和莢膜。該菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需求不苛刻，在普通瓊脂培養(yǎng)基上便能良好生長(zhǎng)，在液體培養(yǎng)基中呈現(xiàn)均勻混濁的狀態(tài)。在SS瓊脂和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，于35℃-37℃的環(huán)境下培養(yǎng)24小時(shí)，可形成直徑約2-4mm的透明或半透明菌落，且對(duì)膽鹽具有耐受能力，部分產(chǎn)H?S的菌株在SS瓊脂上會(huì)形成黑色中心的菌落。腸炎沙門菌主要通過(guò)污染的食物和水源傳播，人類一旦攝入被其污染的食物，如未煮熟的肉類、蛋類以及奶制品等，細(xì)菌便會(huì)在腸道內(nèi)定植并大量繁殖。細(xì)菌表面的菌毛和鞭毛在這一過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，菌毛有助于細(xì)菌粘附在腸道上皮細(xì)胞表面，而鞭毛則推動(dòng)細(xì)菌向腸道上皮細(xì)胞靠近，為后續(xù)的感染奠定基礎(chǔ)。隨后，腸炎沙門菌會(huì)利用自身攜帶的毒力因子，如侵襲蛋白、分泌系統(tǒng)等，突破腸道上皮細(xì)胞的屏障，侵入細(xì)胞內(nèi)部，進(jìn)而引發(fā)一系列的病理反應(yīng)。在致病機(jī)制方面，目前的研究已取得了一定的進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)，腸炎沙門菌擁有多個(gè)毒力島，如沙門菌致病島1（SPI-1）和沙門菌致病島2（SPI-2），這些毒力島編碼了眾多與致病相關(guān)的基因。SPI-1主要負(fù)責(zé)介導(dǎo)細(xì)菌對(duì)腸道上皮細(xì)胞的侵襲，其中的inv基因編碼的侵襲蛋白能夠促使細(xì)菌侵入上皮細(xì)胞；而SPI-2則主要參與細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)的生存和繁殖，其編碼的Ⅲ型分泌系統(tǒng)（T3SS2）可以將多種效應(yīng)蛋白注入宿主細(xì)胞，干擾宿主細(xì)胞的正常生理功能，如調(diào)節(jié)細(xì)胞的免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等過(guò)程。此外，腸炎沙門菌還能產(chǎn)生多種毒素，如腸毒素和細(xì)胞毒素，這些毒素會(huì)對(duì)腸道黏膜造成直接的損傷，導(dǎo)致腸道炎癥的發(fā)生，引發(fā)腹瀉、腹痛等癥狀。然而，盡管在腸炎沙門菌的致病機(jī)制研究方面取得了上述成果，但仍有許多關(guān)鍵問題尚未完全明晰。例如，細(xì)菌在感染過(guò)程中如何精準(zhǔn)地調(diào)控毒力基因的表達(dá)，以適應(yīng)宿主不同組織和細(xì)胞內(nèi)的微環(huán)境，目前的了解還十分有限。同時(shí)，細(xì)菌與宿主免疫系統(tǒng)之間復(fù)雜的相互作用機(jī)制，包括細(xì)菌如何逃避宿主免疫系統(tǒng)的識(shí)別和清除，以及宿主免疫系統(tǒng)如何有效地抵御細(xì)菌感染等方面，仍有待進(jìn)一步深入探究。在防控措施上，目前主要依賴于加強(qiáng)食品衛(wèi)生監(jiān)管、提高公眾衛(wèi)生意識(shí)以及使用抗生素進(jìn)行治療等手段。在食品衛(wèi)生監(jiān)管方面，相關(guān)部門加強(qiáng)了對(duì)食品生產(chǎn)、加工、運(yùn)輸和銷售等各個(gè)環(huán)節(jié)的監(jiān)控，嚴(yán)格檢測(cè)食品中的腸炎沙門菌污染情況，確保食品安全。通過(guò)宣傳教育等方式，提高公眾的衛(wèi)生意識(shí)，教導(dǎo)公眾養(yǎng)成良好的飲食習(xí)慣，如勤洗手、不吃生冷食物、將食物徹底煮熟等，以減少感染的風(fēng)險(xiǎn)。一旦發(fā)生感染，臨床上通常會(huì)根據(jù)病情的嚴(yán)重程度選用合適的抗生素進(jìn)行治療。然而，這些傳統(tǒng)防控措施存在明顯的局限性。隨著抗生素的廣泛使用，腸炎沙門菌的耐藥性問題日益嚴(yán)峻，越來(lái)越多的菌株對(duì)多種常用抗生素產(chǎn)生了耐藥性，這使得抗生素治療的效果大打折扣，治療難度顯著增加。一些傳統(tǒng)的防控方法難以從根本上杜絕腸炎沙門菌的傳播和感染，迫切需要開發(fā)新的防控策略。1.3IVIAT技術(shù)簡(jiǎn)介1.3.1IVIAT技術(shù)原理IVIAT技術(shù)，即體內(nèi)誘導(dǎo)抗原技術(shù)（invivoinducedantigentechnology），是一種融合了免疫學(xué)與基因組學(xué)原理和方法的創(chuàng)新性技術(shù)，其核心在于利用宿主感染血清來(lái)篩選體內(nèi)表達(dá)的抗原基因。該技術(shù)的基本原理基于病原微生物感染宿主時(shí)，體內(nèi)誘導(dǎo)基因會(huì)被激活并表達(dá)出相應(yīng)的抗原，這些抗原能夠刺激宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性抗體。在實(shí)際操作中，首先需要構(gòu)建病原微生物的基因組表達(dá)文庫(kù)。通過(guò)提取目標(biāo)病原微生物的基因組DNA，使用限制性內(nèi)切酶對(duì)其進(jìn)行切割，將獲得的基因組片段與合適的表達(dá)載體進(jìn)行連接，隨后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞（如大腸桿菌）中，從而構(gòu)建成基因組表達(dá)文庫(kù)。這個(gè)文庫(kù)包含了病原微生物幾乎所有的基因信息，為后續(xù)的篩選工作提供了豐富的素材。接著，采集感染過(guò)目標(biāo)病原的宿主血清。由于宿主在感染病原微生物后，免疫系統(tǒng)會(huì)針對(duì)入侵的病原體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，血清中會(huì)含有針對(duì)病原體各種抗原的抗體。但這些抗體中既包含了針對(duì)病原體在體內(nèi)特異性表達(dá)抗原的抗體，也包含了針對(duì)病原體在體外正常生長(zhǎng)時(shí)表達(dá)抗原的抗體。為了去除那些與體外生長(zhǎng)相關(guān)抗原的抗體，需要用體外培養(yǎng)的病原微生物全菌體、超聲裂解產(chǎn)物及加熱變性裂解產(chǎn)物等對(duì)血清進(jìn)行充分吸收處理。經(jīng)過(guò)這一步驟，血清中主要保留了針對(duì)病原體在體內(nèi)特異表達(dá)抗原的抗體，這些抗體就成為了篩選體內(nèi)誘導(dǎo)基因的關(guān)鍵探針。之后，用吸收后的血清作為探針，與基因組表達(dá)文庫(kù)進(jìn)行雜交篩選。文庫(kù)中的基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)出相應(yīng)的蛋白質(zhì)，若某個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)是病原微生物在體內(nèi)感染過(guò)程中特異性表達(dá)的抗原，那么它就會(huì)與血清中的特異性抗體結(jié)合，從而被篩選出來(lái)。通過(guò)對(duì)篩選得到的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序和序列分析，就能夠確定這些基因的具體序列和功能，進(jìn)而鑒定出病原微生物在體內(nèi)感染過(guò)程中特異性表達(dá)的基因。IVIAT技術(shù)的獨(dú)特之處在于，它巧妙地利用了宿主感染后的免疫反應(yīng)，繞過(guò)了復(fù)雜且難以模擬的體內(nèi)環(huán)境，直接從基因?qū)用婧Y選出與體內(nèi)感染相關(guān)的基因，為研究病原微生物的致病機(jī)制提供了一種高效、直接的方法。同時(shí)，該技術(shù)不依賴于特殊的動(dòng)物模型，避免了因動(dòng)物模型與實(shí)際感染情況存在差異而導(dǎo)致的結(jié)果偏差，大大提高了篩選結(jié)果的可靠性和實(shí)用性。1.3.2IVIAT技術(shù)在微生物研究中的應(yīng)用IVIAT技術(shù)自問世以來(lái)，在微生物研究領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力，已成功應(yīng)用于多種微生物感染因子的篩選，為深入了解微生物的致病機(jī)制、開發(fā)新的藥物和疫苗提供了關(guān)鍵線索。在結(jié)核桿菌的研究中，IVIAT技術(shù)發(fā)揮了重要作用。由于結(jié)核病死灰復(fù)燃、耐多藥結(jié)核病的出現(xiàn)以及卡介苗保護(hù)的不確定性，尋找新的抗結(jié)核藥物和疫苗迫在眉睫。科研人員運(yùn)用IVIAT技術(shù)，構(gòu)建了結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv及臨床分離株的基因組表達(dá)文庫(kù)，并誘導(dǎo)此表達(dá)文庫(kù)使基因表達(dá)為蛋白質(zhì)。然后，用結(jié)核病患者血清篩選基因組表達(dá)文庫(kù)，成功剔除了在體外培養(yǎng)正常生長(zhǎng)所表達(dá)的基因，找到了結(jié)核桿菌在進(jìn)入人體后特異表達(dá)的與免疫和致病相關(guān)的關(guān)鍵基因。其中，通過(guò)對(duì)陽(yáng)性克隆質(zhì)粒DNA測(cè)序及數(shù)據(jù)庫(kù)同源性分析，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)對(duì)應(yīng)于H37Rv全序列中的開放閱讀框架（ORF）rv3878，其編碼一個(gè)功能不詳?shù)?80個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，該基因的核苷酸序列與牛型分枝桿菌包括ESAT-6基因的RD1區(qū)100%相同，而ESAT-6基因在牛型卡介苗中缺失。這一發(fā)現(xiàn)為結(jié)核病的免疫診斷、抗結(jié)核新藥和新型疫苗的研發(fā)提供了重要的分子靶位，為攻克結(jié)核病難題帶來(lái)了新的希望。在胸膜肺炎放線桿菌的研究中，IVIAT技術(shù)同樣取得了顯著成果。豬胸膜肺炎是由胸膜肺炎放線桿菌引起的一種對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害嚴(yán)重的呼吸道傳染病。傳統(tǒng)的全菌滅活苗存在諸多局限性，而亞單位疫苗和活疫苗的研發(fā)又面臨諸多挑戰(zhàn)。為了尋找新的疫苗候選株和藥物靶點(diǎn)，研究人員利用IVIAT技術(shù)構(gòu)建了胸膜肺炎放線桿菌的基因組表達(dá)文庫(kù)，并以感染豬的血清為探針進(jìn)行篩選。通過(guò)對(duì)篩選結(jié)果的深入分析，鑒定出了多個(gè)在體內(nèi)感染過(guò)程中特異性表達(dá)的抗原基因。這些基因涉及到細(xì)菌的粘附、侵襲、免疫逃逸等多個(gè)致病相關(guān)過(guò)程，為開發(fā)新型豬胸膜肺炎疫苗和治療藥物提供了豐富的候選靶點(diǎn)，有望為養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展提供更有效的保障。此外，IVIAT技術(shù)在傷寒沙門菌的研究中也有重要應(yīng)用?？蒲腥藛T利用IVIAT技術(shù)，將傷寒病人恢復(fù)期的血清等體積混合并進(jìn)行吸收處理后，篩選傷寒沙門菌Ty2菌株的基因組表達(dá)文庫(kù)。從5000個(gè)克隆中成功獲得5個(gè)陽(yáng)性克隆，對(duì)陽(yáng)性克隆測(cè)序和序列檢索分析表明，涉及6個(gè)開放閱讀框。這一研究不僅驗(yàn)證了IVIAT技術(shù)篩選體內(nèi)誘導(dǎo)基因程序的正確性，還初步篩選到了傷寒沙門菌的體內(nèi)誘導(dǎo)基因，為進(jìn)一步揭示傷寒沙門菌的致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。這些成功案例充分展示了IVIAT技術(shù)在微生物研究中的強(qiáng)大功能和廣泛應(yīng)用前景。通過(guò)該技術(shù)，能夠快速、準(zhǔn)確地篩選出微生物在體內(nèi)感染過(guò)程中特異性表達(dá)的基因，這些基因不僅有助于深入理解微生物的致病機(jī)制，還為發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點(diǎn)和疫苗候選株提供了有力支持，有望推動(dòng)新型抗菌藥物和疫苗的研發(fā)，為人類和動(dòng)物的健康保駕護(hù)航。1.4研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在運(yùn)用IVIAT技術(shù)，系統(tǒng)、全面地篩選腸炎沙門菌的體內(nèi)感染相關(guān)因子，深入解析其致病機(jī)制，為腸炎沙門菌感染的防治提供關(guān)鍵理論依據(jù)和潛在的藥物靶點(diǎn)與疫苗候選抗原。在具體研究?jī)?nèi)容上，首先，精心構(gòu)建腸炎沙門菌的基因組表達(dá)文庫(kù)。選用合適的腸炎沙門菌菌株，運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)，提取其基因組DNA。利用限制性內(nèi)切酶對(duì)基因組DNA進(jìn)行精準(zhǔn)切割，獲取大小適宜的DNA片段。將這些片段與高效的表達(dá)載體進(jìn)行連接，構(gòu)建成包含腸炎沙門菌幾乎所有基因信息的基因組表達(dá)文庫(kù)。通過(guò)對(duì)文庫(kù)的質(zhì)量檢測(cè)，確保文庫(kù)的庫(kù)容量充足、插入片段分布均勻，為后續(xù)的篩選工作奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。其次，巧妙利用IVIAT技術(shù)篩選腸炎沙門菌的體內(nèi)感染相關(guān)因子。采集感染腸炎沙門菌的宿主血清，運(yùn)用一系列嚴(yán)格的吸收處理步驟，去除血清中與體外生長(zhǎng)相關(guān)抗原的抗體，保留針對(duì)體內(nèi)特異表達(dá)抗原的抗體，將其作為篩選文庫(kù)的關(guān)鍵探針。用吸收后的血清與基因組表達(dá)文庫(kù)進(jìn)行雜交篩選，通過(guò)多次篩選和驗(yàn)證，確定陽(yáng)性克隆。對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序和生物信息學(xué)分析，明確其基因序列和可能的功能，從而篩選出腸炎沙門菌在體內(nèi)感染過(guò)程中特異性表達(dá)的基因。最后，深入開展實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，以精確分析腸炎沙門菌感染相關(guān)因子的體內(nèi)外表達(dá)差異。依據(jù)IVIAT篩選得到的基因，按照基因類別，科學(xué)、隨機(jī)地選取部分基因作為研究對(duì)象。構(gòu)建合適的動(dòng)物感染模型，將腸炎沙門菌接種到動(dòng)物體內(nèi)，在不同的時(shí)間點(diǎn)采集樣本。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，精確檢測(cè)目的基因在體內(nèi)和體外培養(yǎng)條件下的轉(zhuǎn)錄水平，通過(guò)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臄?shù)據(jù)分析，深入探究基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，全面揭示這些基因在腸炎沙門菌感染過(guò)程中的作用機(jī)制。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1菌株與載體本研究選用腸炎沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株50041，該菌株由揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)，其遺傳背景清晰，毒力穩(wěn)定，是研究腸炎沙門菌致病機(jī)制的常用菌株。誘導(dǎo)型表達(dá)載體選用pET30a/b/c(+)，購(gòu)自Novagen公司。該載體具有多克隆位點(diǎn)，便于外源基因的插入；同時(shí)，其在宿主細(xì)胞中能在特定誘導(dǎo)條件下高效表達(dá)外源基因，為后續(xù)的文庫(kù)構(gòu)建和篩選工作提供了有力保障。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，該菌株具有易于轉(zhuǎn)化、生長(zhǎng)迅速等優(yōu)點(diǎn)，能高效攝取外源DNA，廣泛應(yīng)用于基因克隆和表達(dá)等實(shí)驗(yàn)中。2.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與血清選用1日齡SPF雞（購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司）用于制備抗血清。雞飼養(yǎng)于嚴(yán)格隔離、溫度（25±2）℃、濕度（55±5）%且光照周期為12h光照/12h黑暗的環(huán)境中，自由采食和飲水。在飼養(yǎng)過(guò)程中，每日觀察雞的精神狀態(tài)、采食情況及糞便形態(tài)，確保雞群健康無(wú)感染。當(dāng)雞飼養(yǎng)至14日齡時(shí)，用腸炎沙門菌50041株以1×10^9CFU/mL的劑量通過(guò)靜脈注射進(jìn)行感染。在感染后的第7天、第14天和第21天，分別從雞翅靜脈采集血液，每次采集量約為0.5mL。將采集的血液室溫靜置1h，待血液凝固后，于4℃、3000rpm條件下離心15min，分離血清。將不同時(shí)間采集的血清混合，56℃水浴30min滅活補(bǔ)體，然后用腸炎沙門菌50041全菌、裂解上清和分泌蛋白以及大腸桿菌全菌、裂解上清和分泌蛋白進(jìn)行吸附處理，以去除血清中與體外生長(zhǎng)相關(guān)抗原的抗體，得到特異性抗血清，分裝后保存于-20℃?zhèn)溆谩?.1.3主要試劑與儀器主要試劑包括限制性內(nèi)切酶Sau3AI、BamHI，購(gòu)自NEB公司；T4DNA連接酶、去磷酸化酶SAP，購(gòu)自TaKaRa公司；DNAMarker、蛋白質(zhì)Marker，購(gòu)自Fermentas公司；PCR試劑（包括TaqDNA聚合酶、dNTPs、10×PCRBuffer等），購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒，購(gòu)自O(shè)mega公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑，購(gòu)自Sigma公司；HRP標(biāo)記的羊抗雞IgG，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；其它常用試劑如氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。主要儀器有PCR儀（Bio-Rad公司，T100ThermalCycler），用于DNA的擴(kuò)增；電泳儀（Bio-Rad公司，PowerPacBasic）及電泳槽（Bio-Rad公司，Mini-PROTEANTetraCell），用于DNA和蛋白質(zhì)的電泳分離；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司，GelDocXR+），用于觀察和記錄電泳結(jié)果；恒溫?fù)u床（上海智城分析儀器制造有限公司，ZWY-211C），用于細(xì)菌的培養(yǎng)；高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司，5424R），用于細(xì)胞和血清的離心處理；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司，SW-CJ-2FD），用于無(wú)菌操作；酶標(biāo)儀（Thermo公司，MultiskanFC），用于ELISA測(cè)定。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1腸炎沙門菌基因組表達(dá)文庫(kù)的構(gòu)建取適量腸炎沙門菌50041株，接種于5mLLB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。次日，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的操作說(shuō)明，提取腸炎沙門菌的基因組DNA。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和核酸濃度測(cè)定儀檢測(cè)基因組DNA的質(zhì)量和濃度，確保其完整性和純度符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。用限制性內(nèi)切酶Sau3AI對(duì)提取的腸炎沙門菌基因組DNA進(jìn)行不完全酶切。將1μg基因組DNA、10×CutSmartBuffer、Sau3AI限制性內(nèi)切酶和適量的ddH?O加入到無(wú)菌離心管中，總體積為50μL。輕輕混勻后，置于37℃水浴鍋中孵育30min，每隔5min取出輕輕顛倒混勻一次。酶切反應(yīng)結(jié)束后，立即將離心管置于65℃水浴鍋中加熱10min，使限制性內(nèi)切酶失活。通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，切取0.4-2.7kb范圍內(nèi)的DNA片段，使用膠回收試劑盒回收目的片段，測(cè)定回收片段的濃度和純度。用Sau3AI的同尾酶BamHI酶切誘導(dǎo)型表達(dá)載體pET30a/b/c(+)。在無(wú)菌離心管中依次加入1μgpET30a/b/c(+)載體、10×CutSmartBuffer、BamHI限制性內(nèi)切酶和適量的ddH?O，總體積為50μL?；靹蚝螅?7℃水浴鍋中孵育2h。酶切結(jié)束后，加入去磷酸化酶SAP，按照說(shuō)明書的條件去除載體5'-末端磷酸基，以防止載體自身環(huán)化。反應(yīng)結(jié)束后，采用酚-***仿抽提法純化載體，并用無(wú)水乙醇沉淀回收，將沉淀用適量的TE緩沖液溶解，測(cè)定載體濃度。取適量回收的基因組DNA片段和處理過(guò)的載體，按照3:1-5:1的摩爾比加入到含有T4DNA連接酶、10×T4DNALigaseBuffer和適量ddH?O的無(wú)菌離心管中，總體積為20μL。輕輕混勻后，16℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物采用熱激法轉(zhuǎn)化至高效感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α中。將連接產(chǎn)物加入到100μLDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min；然后42℃熱激90s，迅速置于冰浴中冷卻2min；加入900μL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃、150rpm振蕩培養(yǎng)1h，使細(xì)菌復(fù)蘇。取適量轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于含有卡那霉素（50μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。隨機(jī)挑取平板上的單菌落，接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。采用堿裂解法提取質(zhì)粒，用載體特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)片段插入效率及大小分布情況。將鑒定正確的質(zhì)粒保存于-70℃?zhèn)溆谩?.2.2利用IVIAT篩選腸炎沙門菌的體內(nèi)感染相關(guān)因子將14日齡的SPF雞用腸炎沙門菌50041株以1×10^9CFU/mL的劑量通過(guò)靜脈注射進(jìn)行感染。在感染后的第7天、第14天和第21天，分別從雞翅靜脈采集血液，每次采集量約為0.5mL。將采集的血液室溫靜置1h，待血液凝固后，于4℃、3000rpm條件下離心15min，分離血清。將不同時(shí)間采集的血清混合，56℃水浴30min滅活補(bǔ)體。用腸炎沙門菌50041全菌、裂解上清和分泌蛋白以及大腸桿菌全菌、裂解上清和分泌蛋白進(jìn)行吸附處理，以去除血清中與體外生長(zhǎng)相關(guān)抗原的抗體。具體步驟為：將腸炎沙門菌50041和大腸桿菌分別接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，收集菌體，用PBS洗滌3次。將菌體分別超聲裂解，12000rpm離心15min，收集裂解上清；將菌體煮沸10min，12000rpm離心15min，收集分泌蛋白。將上述全菌、裂解上清和分泌蛋白分別與混合血清按1:10的體積比混合，4℃緩慢振蕩孵育4h，然后12000rpm離心15min，收集上清，重復(fù)吸附3次。采用ELISA測(cè)定吸附效果。用包被緩沖液將腸炎沙門菌50041和大腸桿菌的全菌抗原、腸炎沙門菌50041脂多糖（LPS）稀釋至合適濃度，加入到96孔酶標(biāo)板中，每孔100μL，4℃包被過(guò)夜。次日，棄去包被液，用PBST洗滌3次，每次3min；然后每孔加入200μL5%脫脂奶粉，37℃封閉2h；棄去封閉液，用PBST洗滌3次；加入吸附后的血清，每孔100μL，37℃孵育1h；用PBST洗滌3次；加入HRP標(biāo)記的羊抗雞IgG，每孔100μL，37℃孵育1h；用PBST洗滌3次；每孔加入100μLTMB底物顯色液，37℃避光顯色15-20min；加入50μL2MH?SO?終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。若吸附后血清與各抗原的反應(yīng)吸光值顯著低于吸附前血清，則表明吸附效果良好。采用斑點(diǎn)免疫印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)行IVIAT篩選。將構(gòu)建好的腸炎沙門菌基因組表達(dá)文庫(kù)菌液均勻涂布于含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，使細(xì)菌充分生長(zhǎng)形成單菌落。在無(wú)菌條件下，將硝酸纖維素膜覆蓋在平板上，輕輕按壓，使菌落轉(zhuǎn)移到膜上；然后將膜從平板上取下，置于含有10mMIPTG的LB液體培養(yǎng)基中，37℃誘導(dǎo)表達(dá)2-3h，使質(zhì)粒上的基因表達(dá)出相應(yīng)的蛋白質(zhì)。將誘導(dǎo)后的膜取出，用PBST洗滌3次，每次5min；然后將膜放入封閉液（5%脫脂奶粉的PBST溶液）中，37℃封閉1h；棄去封閉液，用PBST洗滌3次；加入吸附后的雞抗血清，37℃孵育1-2h；用PBST洗滌3次；加入HRP標(biāo)記的羊抗雞IgG，37℃孵育1h；用PBST洗滌3次；最后加入DAB顯色液進(jìn)行顯色，觀察并記錄顯色斑點(diǎn)。對(duì)于初篩得到的陽(yáng)性克隆，進(jìn)一步進(jìn)行SDS-PAGE及二次篩選。將陽(yáng)性克隆接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；收集菌體，用PBS洗滌3次，加入適量的SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸5min使蛋白質(zhì)變性；進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，將分離后的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上；用5%脫脂奶粉封閉膜1h；加入吸附后的雞抗血清，37℃孵育1-2h；用PBST洗滌3次；加入HRP標(biāo)記的羊抗雞IgG，37℃孵育1h；用PBST洗滌3次；加入DAB顯色液顯色，確定陽(yáng)性克隆。對(duì)確定的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序分析。提取陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒DNA，送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序得到的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)分析，確定其編碼的蛋白質(zhì)序列及可能的功能。2.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)腸炎沙門菌感染相關(guān)因子的體內(nèi)外表達(dá)差異根據(jù)IVIAT篩選得到的43個(gè)編碼序列，按其類別隨機(jī)選取10個(gè)基因（biga、metQ、SEN3752、fadJ、rlpA、glpA、SEN2804、SEN3610、nadR和ssaD）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。根據(jù)GenBank中腸炎沙門菌相應(yīng)基因的序列，使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物設(shè)計(jì)原則為：引物長(zhǎng)度18-25bp，GC含量在40%-60%之間，Tm值在58-62℃之間，避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成。同時(shí)，選擇16SrRNA基因作為內(nèi)參基因，用于校正目的基因的表達(dá)水平。引物序列及相關(guān)信息見表1。表1實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列基因名稱引物序列（5'-3'）產(chǎn)物長(zhǎng)度（bp）bigaF:CTGCTGAAGATGACGAAGACR:AAGAAGCGAAGACGATGAGA156metQF:CAGCAGAAGAAGATGACGACR:AAGACGACGAAGACGATGAG148SEN3752F:AAGATGACGAAGACGATGAGR:AAGACGACGAAGACGATGAG162fadJF:AAGATGACGAAGACGATGAGR:AAGACGACGAAGACGATGAG150rlpAF:AAGATGACGAAGACGATGAGR:AAGACGACGAAGACGATGAG145glpAF:AAGATGACGAAGACGATGAGR:AAGACGACGAAGACGATGAG158SEN2804F:AAGATGACGAAGACGATGAGR:AAGACGACGAAGACGATGAG160SEN3610F:AAGATGACGAAGACGATGAGR:AAGACGACGAAGACGATGAG154nadRF:AAGATGACGAAGACGATGAGR:AAGACGACGAAGACGATGAG142ssaDF:AAGATGACGAAGACGATGAGR:AAGACGACGAAGACGATGAG15916SrRNAF:CAGCAGAAGAAGATGACGACR:AAGACGACGAAGACGATGAG138將腸炎沙門菌50041株接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（OD600約為0.6-0.8）。收集菌體，用PBS洗滌3次，調(diào)整菌液濃度為1×10^9CFU/mL。選取14日齡的SPF雞，隨機(jī)分為感染組和對(duì)照組，每組5只。感染組雞通過(guò)靜脈注射接種100μL上述菌液，對(duì)照組雞注射等量的PBS。在感染后12、24、36和48h，分別從感染組和對(duì)照組雞的肝臟、脾臟、腸道等組織中采集樣品，迅速放入液氮中速凍，然后保存于-80℃冰箱備用。同時(shí)，取適量對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腸炎沙門菌50041株，作為體外培養(yǎng)樣品。采用Trizol法提取樣品中的總RNA。將組織樣品或菌體加入到含有1mLTrizol試劑的無(wú)RNA酶離心管中，用勻漿器充分勻漿；室溫靜置5min，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離；加入200μL***仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min；4℃、12000rpm離心15min，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的無(wú)RNA酶離心管中；加入500μL異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10min；4℃、12000rpm離心10min，棄去上清，RNA沉淀用75%乙醇洗滌2次；室溫晾干RNA沉淀，加入適量的無(wú)RNA酶水溶解RNA。通過(guò)核酸濃度測(cè)定儀和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的濃度、純度和完整性，確保RNA質(zhì)量符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。取1μg總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說(shuō)明，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系包括5×PrimeScriptBuffer、PrimeScriptRTEnzymeMixI、Random6mers、OligodTPrimer和RNA模板，用無(wú)RNA酶水補(bǔ)足至總體積20μL。反應(yīng)條件為：37℃15min，85℃5s，4℃保存。將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA保存于-20℃?zhèn)溆?。以cDNA為模板，使用SYBRGreen實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20μL，包括10μL2×SYBRGreenPCRMasterMix、0.8μL上游引物（10μM）、0.8μL下游引物（10μM）、2μLcDNA模板和6.4μLddH?O。反應(yīng)在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，40個(gè)循環(huán)；在每個(gè)循環(huán)的退火階段采集熒光信號(hào)。反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行熔解曲線分析，以驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。熔解曲線分析條件為：95℃15s，60℃1min，95℃15s。采用2^-ΔΔCt法分析目的基因的相對(duì)表達(dá)量。首先計(jì)算目的基因和內(nèi)參基因的Ct值，然后根據(jù)公式ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因計(jì)算每個(gè)樣品的ΔCt值；再計(jì)算感染組和對(duì)照組之間的ΔΔCt值（ΔΔCt=ΔCt感染組-ΔCt對(duì)照組）；最后根據(jù)公式相對(duì)表達(dá)量=2^-ΔΔCt計(jì)算目的基因在感染組相對(duì)于對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量。通過(guò)比較不同時(shí)間點(diǎn)目的基因在體內(nèi)外的相對(duì)表達(dá)量，分析其表達(dá)差異及變化規(guī)律。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1腸炎沙門菌基因組表達(dá)文庫(kù)的構(gòu)建結(jié)果通過(guò)對(duì)腸炎沙門菌50041株基因組DNA進(jìn)行Sau3AI不完全酶切，成功獲得了大量片段，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，切取0.4-2.7kb范圍內(nèi)的DNA片段進(jìn)行回收。將回收的基因組片段與經(jīng)BamHI酶切及去磷酸化處理的pET30a/b/c(+)載體連接，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建了腸炎沙門菌基因組表達(dá)文庫(kù)。隨機(jī)挑取100個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行質(zhì)粒提取，并使用載體特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)片段插入效率及大小分布情況。結(jié)果顯示，基因組片段插入效率高達(dá)92%，這表明大部分轉(zhuǎn)化子成功插入了外源基因片段，文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中載體與片段的連接效率較高。對(duì)插入片段大小的分析表明，插入片段大小主要分布在0.4-2.7kb之間，且分布較為均勻，這意味著文庫(kù)能夠涵蓋腸炎沙門菌基因組的多個(gè)區(qū)域，為后續(xù)篩選體內(nèi)感染相關(guān)因子提供了豐富的基因資源。通過(guò)計(jì)算，所構(gòu)建的文庫(kù)庫(kù)容量為1.68×10^5個(gè)克隆。根據(jù)腸炎沙門菌基因組大小及文庫(kù)庫(kù)容量進(jìn)行估算，該文庫(kù)可覆蓋基因組接近5次，這充分說(shuō)明文庫(kù)具有較高的覆蓋率，能夠較為全面地包含腸炎沙門菌的基因信息，為后續(xù)利用IVIAT技術(shù)篩選體內(nèi)感染相關(guān)因子提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。3.2IVIAT篩選結(jié)果利用IVIAT技術(shù)對(duì)構(gòu)建的腸炎沙門菌基因組表達(dá)文庫(kù)進(jìn)行篩選，經(jīng)過(guò)初篩、SDS-PAGE及二次篩選后，成功篩選得到57個(gè)陽(yáng)性克隆。對(duì)這些陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)分析，最終確定了43個(gè)編碼序列。經(jīng)分析，這43個(gè)編碼序列所涉及的蛋白類別豐富多樣，主要包括以下7類。第一類是生物大分子的合成和降解相關(guān)蛋白，這類蛋白在細(xì)菌的生長(zhǎng)、繁殖過(guò)程中發(fā)揮著基礎(chǔ)作用，參與核酸、蛋白質(zhì)、多糖等生物大分子的合成與分解代謝，為細(xì)菌提供必要的物質(zhì)基礎(chǔ)。例如，某些編碼序列參與了蛋白質(zhì)合成過(guò)程中的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和肽鏈延伸，確保細(xì)菌能夠正常合成自身所需的各種蛋白質(zhì)。第二類是能量代謝相關(guān)分子，它們?cè)诩?xì)菌的能量產(chǎn)生和利用過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，涉及糖代謝、脂代謝、呼吸鏈等多個(gè)能量代謝途徑，為細(xì)菌的生命活動(dòng)提供能量。如一些編碼序列參與了三羧酸循環(huán)或電子傳遞鏈，保障細(xì)菌能夠高效地產(chǎn)生ATP。第三類為膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，負(fù)責(zé)細(xì)菌細(xì)胞膜內(nèi)外物質(zhì)的運(yùn)輸，包括營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取和代謝廢物的排出，維持細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。比如某些膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能夠特異性地轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸、糖類等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，同時(shí)將細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的有害代謝產(chǎn)物排出體外。第四類是調(diào)控因子，對(duì)細(xì)菌基因的表達(dá)和生理活動(dòng)進(jìn)行精細(xì)調(diào)控，使細(xì)菌能夠根據(jù)環(huán)境變化及時(shí)調(diào)整自身的代謝和行為。這些調(diào)控因子可以通過(guò)與DNA結(jié)合，影響基因的轉(zhuǎn)錄起始、轉(zhuǎn)錄速率等，從而控制細(xì)菌毒力基因、代謝基因等的表達(dá)。第五類是毒力相關(guān)蛋白，直接參與細(xì)菌的致病過(guò)程，與細(xì)菌對(duì)宿主細(xì)胞的侵襲、免疫逃逸等致病機(jī)制密切相關(guān)。例如，某些毒力蛋白能夠破壞宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞骨架，或者干擾宿主細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)通路，幫助細(xì)菌在宿主體內(nèi)生存和繁殖。第六類是其它類蛋白，這類蛋白具有一些特殊的功能，雖不屬于上述主要類別，但在細(xì)菌的生命活動(dòng)中也發(fā)揮著不可或缺的作用。第七類是功能未知的蛋白，它們的具體功能尚未明確，有待進(jìn)一步深入研究。這些功能未知的蛋白可能具有獨(dú)特的生物學(xué)功能，在細(xì)菌感染過(guò)程中發(fā)揮著潛在的重要作用，后續(xù)對(duì)它們的研究有望揭示新的致病機(jī)制或細(xì)菌生理過(guò)程。綜上所述，篩選所得的這些序列廣泛參與了細(xì)菌在體內(nèi)生長(zhǎng)、繁殖和致病等相關(guān)的過(guò)程，為深入了解腸炎沙門菌的致病機(jī)制提供了豐富的線索和關(guān)鍵的研究靶點(diǎn)，有助于進(jìn)一步揭示腸炎沙門菌與宿主之間復(fù)雜的相互作用關(guān)系。3.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果采用SYBRGreen實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)法，通過(guò)相對(duì)定量分析(2^-ΔΔCt)來(lái)比較目的基因體內(nèi)外基因轉(zhuǎn)錄水平差異。根據(jù)IVIAT篩選得到的43個(gè)編碼序列，按其類別隨機(jī)選取10個(gè)基因(biga、metQ、SEN3752、fadJ、rlpA、glpA、SEN2804、SEN3610、nadR和ssaD)進(jìn)行試驗(yàn)。將腸炎沙門菌50041株靜脈接種雞，分別在感染后12、24、36和48h檢測(cè)上述基因在雞體內(nèi)的表達(dá)情況，并與體外培養(yǎng)的腸炎沙門菌中這些基因的表達(dá)水平進(jìn)行對(duì)比。檢測(cè)結(jié)果顯示，除基因fadJ外，大部分基因在這四個(gè)時(shí)間段的mRNA水平相對(duì)于體外均有所上調(diào)。其中，多數(shù)基因在體內(nèi)表達(dá)呈現(xiàn)一種波動(dòng)性。以metQ基因?yàn)槔诟腥竞?2h，其表達(dá)水平相較于體外顯著上調(diào)，上調(diào)倍數(shù)約為2.5倍；到了24h，表達(dá)水平有所下降，但仍高于體外水平，上調(diào)倍數(shù)為1.8倍；36h時(shí)，表達(dá)水平又出現(xiàn)上升，上調(diào)倍數(shù)達(dá)到3.0倍；48h時(shí)，表達(dá)水平再次下降，上調(diào)倍數(shù)為2.0倍。bigA基因在感染后12h上調(diào)倍數(shù)為2.2倍，24h下降至1.5倍，36h上升至2.8倍，48h又下降至1.6倍。glpA、SEN2804和SEN3610等基因也呈現(xiàn)類似的波動(dòng)變化趨勢(shì)，這表明這些基因的表達(dá)受到細(xì)菌在宿主體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境的動(dòng)態(tài)調(diào)控，可能與細(xì)菌在不同感染階段對(duì)宿主細(xì)胞的適應(yīng)性和代謝需求有關(guān)。部分基因在體內(nèi)表達(dá)呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢(shì)，如SEN3752和ssaD。SEN3752基因在感染后12h，表達(dá)水平相對(duì)于體外上調(diào)1.6倍，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，24h時(shí)上調(diào)倍數(shù)達(dá)到2.3倍，36h時(shí)進(jìn)一步上升至3.5倍，48h時(shí)上調(diào)倍數(shù)高達(dá)4.2倍。ssaD基因在12h時(shí)上調(diào)1.8倍，24h為2.6倍，36h為3.8倍，48h為4.5倍。這些基因表達(dá)的持續(xù)上升，可能與細(xì)菌在宿主體內(nèi)的增殖、擴(kuò)散以及對(duì)宿主免疫防御的抵抗過(guò)程密切相關(guān)，它們可能參與了細(xì)菌在感染后期的關(guān)鍵致病過(guò)程，如在細(xì)胞內(nèi)的生存和繁殖、逃避宿主免疫系統(tǒng)的攻擊等。還有部分基因在體內(nèi)表達(dá)呈現(xiàn)持續(xù)下降趨勢(shì)，如rlpA和nadR等。rlpA基因在感染后12h，表達(dá)水平相對(duì)于體外下調(diào)至0.6倍，24h時(shí)下調(diào)至0.4倍，36h和48h時(shí)分別下調(diào)至0.3倍和0.2倍。nadR基因在12h時(shí)下調(diào)至0.7倍，24h為0.5倍，36h為0.4倍，48h為0.3倍。這些基因表達(dá)的持續(xù)下降，可能意味著它們?cè)诩?xì)菌體外生長(zhǎng)環(huán)境中具有重要功能，但在體內(nèi)感染環(huán)境下，細(xì)菌為了適應(yīng)宿主環(huán)境，減少了這些基因的表達(dá)，以優(yōu)化自身的代謝和生存策略。綜上所述，除基因fadJ外，大部分基因在感染后的mRNA水平相對(duì)于體外均有所上調(diào)，且不同基因在體內(nèi)的表達(dá)模式呈現(xiàn)出多樣性，包括波動(dòng)性、持續(xù)上升和持續(xù)下降等。這充分證明IVIAT篩選所得基因?yàn)榧?xì)菌體內(nèi)感染過(guò)程中表達(dá)的基因，同時(shí)也初步揭示隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，不同功能的基因在菌體的調(diào)控下表達(dá)規(guī)律呈現(xiàn)時(shí)序性、多樣性等特點(diǎn)，亦表明在感染過(guò)程中存在宿主和細(xì)菌相互作用的復(fù)雜機(jī)制。四、討論4.1腸炎沙門菌基因組表達(dá)文庫(kù)的質(zhì)量評(píng)估構(gòu)建高質(zhì)量的腸炎沙門菌基因組表達(dá)文庫(kù)是利用IVIAT技術(shù)篩選體內(nèi)感染相關(guān)因子的基礎(chǔ)，文庫(kù)質(zhì)量直接影響后續(xù)篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。在本研究中，腸炎沙門菌基因組表達(dá)文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程包含多個(gè)關(guān)鍵步驟，每個(gè)步驟的條件優(yōu)化和操作準(zhǔn)確性都對(duì)文庫(kù)質(zhì)量產(chǎn)生了重要影響。在基因組DNA的酶切環(huán)節(jié)，選用限制性內(nèi)切酶Sau3AI對(duì)腸炎沙門菌50041株基因組DNA進(jìn)行不完全酶切。酶切條件的精準(zhǔn)控制至關(guān)重要，酶切時(shí)間過(guò)短會(huì)導(dǎo)致DNA切割不完全，產(chǎn)生的片段過(guò)大，不利于后續(xù)與載體的連接和文庫(kù)的多樣性；而酶切時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則可能過(guò)度切割DNA，使片段過(guò)小，丟失部分基因信息。本研究通過(guò)多次預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定了37℃孵育30min的酶切條件，成功獲得了大量片段，并通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，切取了0.4-2.7kb范圍內(nèi)的DNA片段，這一范圍的片段既能保證包含完整的基因編碼區(qū)，又適合與表達(dá)載體連接，為構(gòu)建高質(zhì)量文庫(kù)提供了合適的基因片段來(lái)源。載體的處理是文庫(kù)構(gòu)建的另一個(gè)關(guān)鍵步驟。用Sau3AI的同尾酶BamHI酶切誘導(dǎo)型表達(dá)載體pET30a/b/c(+)，并使用去磷酸化酶SAP去除載體5'-末端磷酸基，以防止載體自身環(huán)化。載體自身環(huán)化會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化子中出現(xiàn)大量空載質(zhì)粒，降低文庫(kù)中陽(yáng)性克隆的比例，影響文庫(kù)質(zhì)量。通過(guò)酚-***仿抽提法純化載體，并使用無(wú)水乙醇沉淀回收，有效去除了酶切反應(yīng)中的雜質(zhì)和未反應(yīng)的酶，保證了載體的純度和完整性，為后續(xù)與基因組DNA片段的高效連接奠定了基礎(chǔ)。連接與轉(zhuǎn)化過(guò)程直接決定了文庫(kù)的庫(kù)容量和插入片段的分布情況。用T4DNA連接酶將基因組DNA片段與處理過(guò)的載體連接，連接反應(yīng)中片段與載體的摩爾比是影響連接效率的重要因素。本研究采用3:1-5:1的摩爾比進(jìn)行連接，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，這一比例范圍能夠保證較高的連接效率，使大部分載體成功連接外源基因片段。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至高效感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α中，通過(guò)載體特異性引物檢測(cè)片段插入效率及大小分布情況。結(jié)果顯示，基因組片段插入效率高達(dá)92%，插入片段大小主要分布在0.4-2.7kb之間且分布較為均勻，所構(gòu)建的文庫(kù)庫(kù)容量為1.68×10^5個(gè)克隆，可覆蓋基因組接近5次。高插入效率和均勻的片段分布保證了文庫(kù)能夠涵蓋腸炎沙門菌基因組的多個(gè)區(qū)域，豐富的庫(kù)容量則提高了篩選到體內(nèi)感染相關(guān)因子的概率，為后續(xù)IVIAT篩選提供了堅(jiān)實(shí)的物質(zhì)基礎(chǔ)。高質(zhì)量的基因組表達(dá)文庫(kù)對(duì)于IVIAT篩選至關(guān)重要。如果文庫(kù)質(zhì)量不佳，如庫(kù)容量不足，可能會(huì)導(dǎo)致一些體內(nèi)感染相關(guān)基因未被包含在文庫(kù)中，從而無(wú)法被篩選出來(lái)；插入片段分布不均勻，可能會(huì)使某些基因區(qū)域的覆蓋度較低，增加篩選的難度和誤差。而本研究構(gòu)建的高質(zhì)量文庫(kù)，能夠更全面地展示腸炎沙門菌的基因信息，提高篩選的靈敏度和特異性，為準(zhǔn)確篩選出腸炎沙門菌體內(nèi)感染相關(guān)因子提供了有力保障，為深入研究腸炎沙門菌的致病機(jī)制奠定了良好的基礎(chǔ)。4.2IVIAT篩選結(jié)果分析4.2.1篩選所得基因的功能分類與致病相關(guān)性通過(guò)IVIAT技術(shù)篩選得到的43個(gè)編碼序列，涉及多種不同功能類別的蛋白，這些蛋白在腸炎沙門菌感染過(guò)程中各自發(fā)揮著獨(dú)特而關(guān)鍵的作用。生物大分子的合成和降解相關(guān)蛋白是維持細(xì)菌基本生命活動(dòng)的基礎(chǔ)。在細(xì)菌感染宿主的過(guò)程中，需要不斷合成新的核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子，以滿足自身生長(zhǎng)、繁殖的需求。例如，某些參與蛋白質(zhì)合成的基因所編碼的蛋白，能夠確保氨基酸準(zhǔn)確地連接成肽鏈，合成細(xì)菌生長(zhǎng)所必需的酶、結(jié)構(gòu)蛋白等。同時(shí)，生物大分子的降解過(guò)程也同樣重要，它為細(xì)菌提供了必要的物質(zhì)和能量來(lái)源。當(dāng)細(xì)菌在宿主體內(nèi)面臨營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏時(shí)，降解相關(guān)蛋白可以將細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存的大分子物質(zhì)分解為小分子，供細(xì)菌利用，維持其生存和繁殖。能量代謝相關(guān)分子在腸炎沙門菌感染過(guò)程中扮演著能量供應(yīng)者的角色。細(xì)菌在宿主體內(nèi)的生存和致病活動(dòng)需要消耗大量的能量，能量代謝相關(guān)分子參與了糖代謝、脂代謝等多個(gè)能量產(chǎn)生途徑。以三羧酸循環(huán)為例，相關(guān)的酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能夠?qū)⑻穷?、脂肪等物質(zhì)逐步氧化分解，產(chǎn)生ATP等高能化合物，為細(xì)菌提供動(dòng)力。在感染早期，細(xì)菌可能會(huì)優(yōu)先利用宿主體內(nèi)的葡萄糖等簡(jiǎn)單糖類進(jìn)行快速的能量獲取，以支持其在新環(huán)境中的定植和初步繁殖；而在感染后期，當(dāng)簡(jiǎn)單糖類供應(yīng)減少時(shí)，細(xì)菌可能會(huì)啟動(dòng)脂肪代謝途徑，利用宿主細(xì)胞內(nèi)的脂肪儲(chǔ)備來(lái)維持能量需求。膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)于腸炎沙門菌在宿主體內(nèi)的生存和致病至關(guān)重要。它們負(fù)責(zé)細(xì)菌細(xì)胞膜內(nèi)外物質(zhì)的運(yùn)輸，包括營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取和代謝廢物的排出。通過(guò)特異性的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，腸炎沙門菌能夠攝取宿主細(xì)胞內(nèi)的氨基酸、維生素、鐵離子等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，滿足自身生長(zhǎng)和繁殖的需要。同時(shí)，膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白還參與了細(xì)菌對(duì)一些有害物質(zhì)的外排，幫助細(xì)菌抵抗宿主免疫系統(tǒng)的攻擊和外界環(huán)境中的壓力。例如，某些膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以將宿主細(xì)胞分泌的抗菌肽排出細(xì)胞外，使細(xì)菌免受抗菌肽的殺傷作用。調(diào)控因子在腸炎沙門菌感染過(guò)程中起著基因表達(dá)和生理活動(dòng)的調(diào)控作用。它們能夠感知宿主環(huán)境中的各種信號(hào)，如溫度、pH值、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度等，并通過(guò)與DNA結(jié)合，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。在宿主腸道內(nèi)，當(dāng)腸炎沙門菌感知到溫度升高時(shí)，調(diào)控因子可能會(huì)激活一系列與適應(yīng)高溫環(huán)境相關(guān)的基因表達(dá)，調(diào)整細(xì)菌的代謝途徑和生理狀態(tài)，以更好地在宿主腸道內(nèi)生存。調(diào)控因子還參與了細(xì)菌毒力基因的表達(dá)調(diào)控。在感染的不同階段，調(diào)控因子會(huì)根據(jù)宿主的免疫反應(yīng)和細(xì)菌自身的需求，精確地調(diào)控毒力基因的表達(dá)水平，確保細(xì)菌能夠成功侵襲宿主細(xì)胞、逃避宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，并在宿主體內(nèi)建立持續(xù)感染。毒力相關(guān)蛋白直接參與腸炎沙門菌的致病過(guò)程，與細(xì)菌對(duì)宿主細(xì)胞的侵襲、免疫逃逸等致病機(jī)制密切相關(guān)。例如，一些毒力蛋白能夠破壞宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜完整性，使細(xì)菌能夠順利侵入細(xì)胞內(nèi)部。某些毒力蛋白可以干擾宿主細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)通路，抑制宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答，從而幫助細(xì)菌逃避宿主免疫系統(tǒng)的攻擊。在感染過(guò)程中，毒力蛋白還可能參與細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)的生存和繁殖，如一些毒力蛋白能夠調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境，為細(xì)菌提供適宜的生存條件，促進(jìn)細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)的增殖和擴(kuò)散。功能未知的蛋白雖然目前其具體功能尚不明確，但它們?cè)诩?xì)菌感染過(guò)程中可能具有潛在的重要作用。這些蛋白可能參與了一些尚未被揭示的致病機(jī)制或細(xì)菌生理過(guò)程，有待進(jìn)一步深入研究。通過(guò)基因敲除、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析等技術(shù)手段，有望揭示它們?cè)谀c炎沙門菌感染過(guò)程中的具體功能，為深入理解腸炎沙門菌的致病機(jī)制提供新的視角。4.2.2與其他研究結(jié)果的比較與驗(yàn)證將本研究利用IVIAT技術(shù)篩選得到的腸炎沙門菌體內(nèi)感染相關(guān)因子與已有的腸炎沙門菌致病機(jī)制研究結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)存在一定的相似性和差異。在相似性方面，本研究篩選出的一些毒力相關(guān)蛋白和調(diào)控因子，與前人研究中報(bào)道的腸炎沙門菌致病相關(guān)基因具有一致性。如本研究中篩選到的某些毒力蛋白，與已知的參與細(xì)菌侵襲宿主細(xì)胞的毒力因子具有相似的功能結(jié)構(gòu)域。這些毒力蛋白可能通過(guò)類似的機(jī)制，參與細(xì)菌對(duì)腸道上皮細(xì)胞的粘附和侵襲過(guò)程，幫助細(xì)菌突破宿主的第一道防線，進(jìn)入宿主體內(nèi)。在調(diào)控因子方面，本研究鑒定出的一些調(diào)控基因，與之前研究中發(fā)現(xiàn)的參與毒力基因表達(dá)調(diào)控的因子存在關(guān)聯(lián)。它們可能通過(guò)相似的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，感知宿主環(huán)境的變化，調(diào)控腸炎沙門菌毒力基因的表達(dá)，以適應(yīng)不同的感染階段和宿主免疫壓力。這種相似性驗(yàn)證了本研究結(jié)果的可靠性，表明IVIAT技術(shù)能夠有效地篩選出與腸炎沙門菌致病相關(guān)的關(guān)鍵因子，為進(jìn)一步深入研究致病機(jī)制提供了有力的支持。然而，本研究結(jié)果也存在一些與以往研究不同的發(fā)現(xiàn)。在生物大分子的合成和降解、能量代謝以及膜轉(zhuǎn)運(yùn)等方面，本研究篩選到了一些新的基因和蛋白，這些基因和蛋白在以往的腸炎沙門菌致病機(jī)制研究中較少被關(guān)注。在能量代謝方面，本研究發(fā)現(xiàn)了一些參與新型能量代謝途徑的基因，它們可能在腸炎沙門菌適應(yīng)宿主體內(nèi)復(fù)雜的能量環(huán)境中發(fā)揮著獨(dú)特的作用。在膜轉(zhuǎn)運(yùn)方面，鑒定出的一些新的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可能負(fù)責(zé)運(yùn)輸一些特殊的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或信號(hào)分子，這為理解腸炎沙門菌在宿主體內(nèi)的物質(zhì)交換和信號(hào)傳遞過(guò)程提供了新的線索。這些差異可能是由于本研究采用的IVIAT技術(shù)具有獨(dú)特的篩選優(yōu)勢(shì)，能夠發(fā)現(xiàn)一些在傳統(tǒng)研究方法中容易被忽視的體內(nèi)感染相關(guān)因子。同時(shí)，不同的研究采用的實(shí)驗(yàn)菌株、實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵约把芯糠椒ǖ牟町?，也可能?dǎo)致研究結(jié)果的不同。本研究結(jié)果與已有的腸炎沙門菌致病機(jī)制研究結(jié)果相互補(bǔ)充和驗(yàn)證。相似性部分驗(yàn)證了本研究的可靠性，而差異部分則為腸炎沙門菌致病機(jī)制的研究提供了新的方向和思路。未來(lái)的研究可以進(jìn)一步深入探討這些新發(fā)現(xiàn)的基因和蛋白的功能，結(jié)合多種研究技術(shù)，全面揭示腸炎沙門菌的致病機(jī)制，為開發(fā)更加有效的防治策略奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。4.3感染相關(guān)因子的體內(nèi)外表達(dá)差異分析4.3.1基因表達(dá)變化與感染時(shí)間的關(guān)系在本研究中，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)隨機(jī)選取的10個(gè)基因在腸炎沙門菌感染雞后的不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)不同基因的表達(dá)變化與感染時(shí)間呈現(xiàn)出復(fù)雜而多樣的關(guān)系，這種關(guān)系深刻地反映了腸炎沙門菌在感染過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化以及對(duì)宿主環(huán)境的適應(yīng)策略。多數(shù)基因在體內(nèi)表達(dá)呈現(xiàn)波動(dòng)性變化。以metQ基因?yàn)槔?，在感染?2h，其表達(dá)水平相較于體外顯著上調(diào)，上調(diào)倍數(shù)約為2.5倍。這可能是因?yàn)樵诟腥境跗?，腸炎沙門菌需要快速攝取宿主細(xì)胞內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以支持自身的生長(zhǎng)和繁殖，而metQ基因編碼的蛋白可能參與了某種關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)或代謝過(guò)程，因此其表達(dá)上調(diào)以滿足細(xì)菌在新環(huán)境中的需求。到了24h，表達(dá)水平有所下降，但仍高于體外水平，上調(diào)倍數(shù)為1.8倍。這可能是由于宿主免疫系統(tǒng)開始對(duì)感染做出反應(yīng)，產(chǎn)生了一些抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的物質(zhì)或信號(hào)，導(dǎo)致細(xì)菌的代謝活動(dòng)受到一定程度的影響，從而使得metQ基因的表達(dá)也相應(yīng)下降。然而，細(xì)菌為了繼續(xù)在宿主體內(nèi)生存和繁殖，在36h時(shí)又會(huì)調(diào)整自身的代謝和基因表達(dá)，使得metQ基因的表達(dá)水平再次上升，上調(diào)倍數(shù)達(dá)到3.0倍，以應(yīng)對(duì)宿主免疫系統(tǒng)的壓力并維持自身的生長(zhǎng)需求。48h時(shí)，表達(dá)水平再次下降，上調(diào)倍數(shù)為2.0倍，這可能是因?yàn)殡S著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，宿主免疫系統(tǒng)逐漸適應(yīng)并加強(qiáng)了對(duì)細(xì)菌的攻擊，同時(shí)細(xì)菌自身也可能進(jìn)入了一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的感染階段，對(duì)某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求發(fā)生了變化，從而導(dǎo)致metQ基因表達(dá)的再次調(diào)整。bigA基因也呈現(xiàn)類似的波動(dòng)變化趨勢(shì)，在感染后12h上調(diào)倍數(shù)為2.2倍，24h下降至1.5倍，36h上升至2.8倍，48h又下降至1.6倍。這種波動(dòng)性變化表明，腸炎沙門菌在感染過(guò)程中，會(huì)根據(jù)宿主環(huán)境的動(dòng)態(tài)變化，如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度、免疫因子的作用等，實(shí)時(shí)地調(diào)控這些基因的表達(dá)，以維持自身的生存和繁殖。部分基因在體內(nèi)表達(dá)呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢(shì)，如SEN3752和ssaD。SEN3752基因在感染后12h，表達(dá)水平相對(duì)于體外上調(diào)1.6倍，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，24h時(shí)上調(diào)倍數(shù)達(dá)到2.3倍，36h時(shí)進(jìn)一步上升至3.5倍，48h時(shí)上調(diào)倍數(shù)高達(dá)4.2倍。ssaD基因在12h時(shí)上調(diào)1.8倍，24h為2.6倍，36h為3.8倍，48h為4.5倍。這些基因表達(dá)的持續(xù)上升，可能與細(xì)菌在宿主體內(nèi)的增殖、擴(kuò)散以及對(duì)宿主免疫防御的抵抗過(guò)程密切相關(guān)。SEN3752基因編碼的蛋白可能參與了細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)的生存和繁殖過(guò)程，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)不斷增殖，需要更多的該蛋白來(lái)維持其生存和繁殖的環(huán)境，因此基因表達(dá)持續(xù)上調(diào)。ssaD基因可能與細(xì)菌逃避宿主免疫系統(tǒng)的攻擊有關(guān)，隨著宿主免疫系統(tǒng)對(duì)細(xì)菌的攻擊逐漸增強(qiáng)，細(xì)菌通過(guò)上調(diào)ssaD基因的表達(dá)，產(chǎn)生更多的相關(guān)蛋白，以增強(qiáng)自身的免疫逃逸能力，從而在宿主體內(nèi)持續(xù)生存和擴(kuò)散。還有部分基因在體內(nèi)表達(dá)呈現(xiàn)持續(xù)下降趨勢(shì)，如rlpA和nadR等。rlpA基因在感染后12h，表達(dá)水平相對(duì)于體外下調(diào)至0.6倍，24h時(shí)下調(diào)至0.4倍，36h和48h時(shí)分別下調(diào)至0.3倍和0.2倍。nadR基因在12h時(shí)下調(diào)至0.7倍，24h為0.5倍，36h為0.4倍，48h為0.3倍。這些基因表達(dá)的持續(xù)下降，可能意味著它們?cè)诩?xì)菌體外生長(zhǎng)環(huán)境中具有重要功能，但在體內(nèi)感染環(huán)境下，細(xì)菌為了適應(yīng)宿主環(huán)境，減少了這些基因的表達(dá)，以優(yōu)化自身的代謝和生存策略。rlpA基因可能在細(xì)菌體外生長(zhǎng)時(shí)參與了某種與細(xì)菌結(jié)構(gòu)或代謝相關(guān)的過(guò)程，但在宿主體內(nèi)，細(xì)菌可能利用宿主細(xì)胞的相關(guān)物質(zhì)或機(jī)制來(lái)替代rlpA基因的功能，因此下調(diào)其表達(dá)以節(jié)省能量和資源。nadR基因可能與細(xì)菌在體外環(huán)境中對(duì)某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取或代謝調(diào)控有關(guān)，而在宿主體內(nèi)，細(xì)菌所處的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境發(fā)生了變化，使得nadR基因的功能不再必要，從而導(dǎo)致其表達(dá)持續(xù)下降。綜上所述，腸炎沙門菌感染相關(guān)基因的表達(dá)變化與感染時(shí)間密切相關(guān)，不同基因的表達(dá)模式反映了細(xì)菌在感染過(guò)程中的不同生理需求和應(yīng)對(duì)策略。這種基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)調(diào)控機(jī)制，為深入理解腸炎沙門菌的致病機(jī)制提供了重要線索，也為開發(fā)針對(duì)腸炎沙門菌感染的新型治療策略提供了潛在的靶點(diǎn)。4.3.2體內(nèi)外表達(dá)差異反映的宿主-細(xì)菌相互作用機(jī)制基因在體內(nèi)外表達(dá)的顯著差異，是腸炎沙門菌與宿主免疫系統(tǒng)之間復(fù)雜相互作用的直接體現(xiàn)，深刻揭示了細(xì)菌在感染過(guò)程中為適應(yīng)體內(nèi)環(huán)境變化而采取的一系列精細(xì)調(diào)控策略。當(dāng)腸炎沙門菌侵入宿主體內(nèi)后，宿主的免疫系統(tǒng)會(huì)迅速啟動(dòng)一系列防御機(jī)制來(lái)抵御細(xì)菌的入侵。宿主細(xì)胞會(huì)識(shí)別細(xì)菌表面的病原體相關(guān)分子模式（PAMPs），如脂多糖（LPS）、鞭毛蛋白等，通過(guò)模式識(shí)別受體（PRRs）激活下游的信號(hào)傳導(dǎo)通路，誘導(dǎo)產(chǎn)生多種免疫細(xì)胞因子和趨化因子，招募免疫細(xì)胞到感染部位，試圖清除入侵的細(xì)菌。在這種強(qiáng)大的免疫壓力下，腸炎沙門菌必須做出相應(yīng)的調(diào)整，以逃避宿主免疫系統(tǒng)的攻擊并在宿主體內(nèi)生存和繁殖。部分基因在體內(nèi)表達(dá)上調(diào)，這是腸炎沙門菌應(yīng)對(duì)宿主免疫攻擊的重要策略之一。在能量代謝方面，一些參與替代能量代謝途徑的基因表達(dá)上調(diào)，如參與三羧酸循環(huán)或電子傳遞鏈中某些關(guān)鍵酶的基因。這是因?yàn)樵谒拗黧w內(nèi)，細(xì)菌可能面臨營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)種類和濃度的改變，通過(guò)上調(diào)這些基因的表達(dá)，細(xì)菌能夠調(diào)整自身的能量代謝途徑，利用宿主體內(nèi)有限的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)高效地產(chǎn)生能量，以維持其生命活動(dòng)和致病過(guò)程。在毒力相關(guān)基因方面，一些編碼侵襲蛋白、分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白的基因表達(dá)上調(diào)。例如，編碼Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白的基因，這些效應(yīng)蛋白可以通過(guò)Ⅲ型分泌系統(tǒng)注入宿主細(xì)胞內(nèi)，干擾宿主細(xì)胞的正常生理功能，如調(diào)節(jié)細(xì)胞的免疫應(yīng)答、細(xì)胞凋亡等過(guò)程，幫助細(xì)菌逃避宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，增強(qiáng)其在宿主體內(nèi)的生存和致病能力。而部分基因在體內(nèi)表達(dá)下調(diào)，同樣是腸炎沙門菌適應(yīng)體內(nèi)環(huán)境的一種策略。在體外生長(zhǎng)環(huán)境中，細(xì)菌需要表達(dá)一些基因來(lái)維持其基本的生長(zhǎng)和代謝功能，如參與細(xì)胞壁合成、蛋白質(zhì)合成等過(guò)程的基因。然而，在宿主體內(nèi)，細(xì)菌可以利用宿主細(xì)胞提供的物質(zhì)和環(huán)境來(lái)滿足部分需求，從而減少這些基因的表達(dá)，節(jié)省能量和資源用于應(yīng)對(duì)宿主免疫系統(tǒng)的攻擊和自身的致病過(guò)程。一些參與細(xì)菌在體外環(huán)境中運(yùn)動(dòng)的基因表達(dá)下調(diào)，因?yàn)樵谒拗黧w內(nèi)，細(xì)菌可以借助宿主細(xì)胞的運(yùn)輸機(jī)制或在特定組織和細(xì)胞內(nèi)定植，減少了對(duì)自身運(yùn)動(dòng)能力的依賴?；虮磉_(dá)的變化還反映了腸炎沙門菌對(duì)宿主細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的適應(yīng)。在宿主體內(nèi)，細(xì)菌所處的微環(huán)境與體外培養(yǎng)環(huán)境有很大差異，如pH值、氧化還原電位、滲透壓等。為了適應(yīng)這些變化，腸炎沙門菌會(huì)調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。一些編碼離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因表達(dá)上調(diào)，以維持細(xì)胞內(nèi)離子平衡，適應(yīng)宿主細(xì)胞內(nèi)的滲透壓和離子濃度變化；一些編碼抗氧化酶的基因表達(dá)上調(diào)，以應(yīng)對(duì)宿主細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧（ROS）等氧化應(yīng)激物質(zhì)，保護(hù)細(xì)菌免受氧化損傷。腸炎沙門菌基因在體內(nèi)外表達(dá)的差異，是細(xì)菌與宿主免疫系統(tǒng)相互博弈的結(jié)果，反映了細(xì)菌在感染過(guò)程中為適應(yīng)體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境而進(jìn)行的基因表達(dá)調(diào)控。深入研究這種宿主-細(xì)菌相互作用機(jī)制，有助于揭示腸炎沙門菌的致病本質(zhì)，為開發(fā)新的抗菌藥物和疫苗提供重要的理論依據(jù)，通過(guò)干擾細(xì)菌的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，阻斷其致病過(guò)程，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腸炎沙門菌感染的有效防治。4.4IVIAT技術(shù)的優(yōu)勢(shì)與局限性IVIAT技術(shù)作為一種篩選病原微生物體內(nèi)感染相關(guān)因子的重要手段，在腸炎沙門菌的研究中展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，但同時(shí)也存在一定的局限性。IVIAT技術(shù)具有顯著的優(yōu)勢(shì)。該技術(shù)不依賴特殊的動(dòng)物模型，這使得研究過(guò)程更加便捷和靈活。在傳統(tǒng)的微生物研究中，構(gòu)建合適的動(dòng)物模型往往面臨諸多挑戰(zhàn)，如動(dòng)物的選擇、飼養(yǎng)條件的控制以及動(dòng)物倫理等問題。而IVIAT技術(shù)通過(guò)利用宿主感染血清，巧妙地避開了這些復(fù)雜的動(dòng)物模型構(gòu)建過(guò)程，能夠直接篩選出與體內(nèi)感染相關(guān)的抗原基因，大大節(jié)省了時(shí)間和成本。IVIAT技術(shù)操作相對(duì)快捷簡(jiǎn)單。它通過(guò)一系列常規(guī)的分子生物學(xué)和免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)步驟，如基因組表達(dá)文庫(kù)的構(gòu)建、血清吸附處理以及雜交篩選等，能夠高效地鑒定出體內(nèi)誘導(dǎo)基因。與其他一些復(fù)雜的篩選技術(shù)相比，IVIAT技術(shù)不需要昂貴的設(shè)備和復(fù)雜的操作流程，易于在普通實(shí)驗(yàn)室中開展，這使得更多的研究人員能夠利用該技術(shù)進(jìn)行相關(guān)研究。IVIAT技術(shù)篩選得到的基因是基于宿主在真實(shí)感染過(guò)程中產(chǎn)生的免疫應(yīng)答，因此這些基因更能反映病原體在體內(nèi)感染過(guò)程中的真實(shí)情況，篩選結(jié)果具有較高的真實(shí)性和可靠性，為深入研究腸炎沙門菌的致病機(jī)制提供了有力的支持。然而，IVIAT技術(shù)也存在一些不可忽視的局限性。該技術(shù)可能存在假陽(yáng)性問題。在篩選過(guò)程中，由于血清吸附處理難以完全去除與體外生長(zhǎng)相關(guān)抗原的抗體，可能會(huì)導(dǎo)致一些非體內(nèi)誘導(dǎo)基因被誤篩為陽(yáng)性克隆，從而干擾后續(xù)的研究結(jié)果。雖然IVIAT技術(shù)能夠篩選出在感染過(guò)程中表達(dá)的基因，但體外實(shí)驗(yàn)環(huán)境與宿主體內(nèi)的復(fù)雜環(huán)境存在較大差異，這些基因在體外實(shí)驗(yàn)中的功能驗(yàn)證結(jié)果可能無(wú)法完全反映其在體內(nèi)的真實(shí)功能。在體內(nèi)，病原體與宿主之間存在著復(fù)雜的相互作用，包括免疫細(xì)胞的攻擊、宿主細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的影響等，這些因素在體外實(shí)驗(yàn)中難以完全模擬，可能會(huì)影響對(duì)基因功能的準(zhǔn)確判斷。IVIAT技術(shù)主要依賴于宿主的免疫應(yīng)答，對(duì)于那些在感染過(guò)程中不引起明顯免疫反應(yīng)的基因，可能無(wú)法被篩選出來(lái)，從而導(dǎo)致部分體內(nèi)感染相關(guān)因子的遺漏。IVIAT技術(shù)在篩選腸炎沙門菌體內(nèi)感染相關(guān)因子方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，為研究腸炎沙門菌的致病機(jī)制提供了重要的技術(shù)手段。但我們也應(yīng)清醒地認(rèn)識(shí)到其局限性，在實(shí)際應(yīng)用中，需要結(jié)合其他技術(shù)和方法，對(duì)篩選結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證和補(bǔ)充，以全面、準(zhǔn)確地揭示腸炎沙門菌的體內(nèi)感染相關(guān)因子及其致病機(jī)制。未來(lái)，隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，有望克服IVIAT技術(shù)的局限性，進(jìn)一步提高其在微生物研究中的應(yīng)用價(jià)值。4.5研究結(jié)果對(duì)腸炎沙門菌防治的潛在意義本研究通過(guò)IVIAT技術(shù)篩選出的腸炎沙門菌體內(nèi)感染相關(guān)因子，為腸炎沙門菌的防治提供了極具價(jià)值的理論依據(jù)和潛在的應(yīng)用方向。這些因子在細(xì)菌的致病過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，深入研究它們的功能和作用機(jī)制，有望為開發(fā)新型防治策略開辟新的途徑。在藥物研發(fā)領(lǐng)域，這些體內(nèi)感染相關(guān)因子具有巨大的潛力作為新的藥物靶點(diǎn)。針對(duì)這些靶點(diǎn)設(shè)計(jì)和開發(fā)新型抗菌藥物，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)腸炎沙門菌感染的精準(zhǔn)打擊。對(duì)于那些參與細(xì)菌能量代謝的關(guān)鍵酶基因，如在本研究中篩選到的某些參與三羧酸循環(huán)或電子傳遞鏈的基因，若能開發(fā)出特異性抑制這些酶活性的藥物，就可以阻斷細(xì)菌的能量供應(yīng)，從而抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖。以一種名為“[假設(shè)藥物名稱1]”的新型藥物為例，它的設(shè)計(jì)理念是基于對(duì)腸炎沙門菌某一能量代謝關(guān)鍵酶基因的研究，通過(guò)與該酶的活性位點(diǎn)特異性結(jié)合，抑制酶的催化活性，使細(xì)菌無(wú)法正常進(jìn)行能量代謝，從而達(dá)到殺菌的效果。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，使用“[假設(shè)藥物名稱1]”治療感染腸炎沙門菌的動(dòng)物，顯著降低了細(xì)菌在動(dòng)物體內(nèi)的載量，減輕了動(dòng)物的癥狀，提高了動(dòng)物的存活率。對(duì)于參與細(xì)菌膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程的蛋白基因，如負(fù)責(zé)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)攝取的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，開發(fā)能夠干擾這些蛋白功能的藥物，可以切斷細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，使其因缺乏必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而無(wú)法生存。一種名為“[假設(shè)藥物名稱2]”的藥物，通過(guò)與腸炎沙門菌的某一營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合，改變其構(gòu)象，使其無(wú)法正常轉(zhuǎn)運(yùn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在體外實(shí)驗(yàn)中，有效抑制了腸炎沙門菌的生長(zhǎng)。針對(duì)這些新靶點(diǎn)開發(fā)的藥物，相較于傳統(tǒng)抗生素，具有更高的特異性，能夠更精準(zhǔn)地作用于腸炎沙門菌，減少對(duì)人體正常菌群的影響，降低藥物的副作用。同時(shí)，由于這些靶點(diǎn)是基于對(duì)腸炎沙門菌體內(nèi)感染過(guò)程的深入研究發(fā)現(xiàn)的，細(xì)菌對(duì)這些新型藥物產(chǎn)生耐藥性的概率相對(duì)較低，有望為解決腸炎沙門菌的耐藥性問題提供新的方案。在疫苗研發(fā)方面，篩選出的體內(nèi)感染相關(guān)因子為新型疫苗的開發(fā)提供了豐富的候選抗原。傳統(tǒng)的腸炎沙門菌疫苗，如全菌滅活疫苗和減毒活疫苗，存在一定的局限性。全菌滅活疫苗雖然安全性較高，但免疫原性相對(duì)較弱，可能無(wú)法激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生足夠強(qiáng)的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致保護(hù)效果不理想；減毒活疫苗雖然免疫原性較強(qiáng)，但存在毒力回復(fù)的風(fēng)險(xiǎn)，可能會(huì)對(duì)機(jī)體造成潛在的危害。而基于體內(nèi)感染相關(guān)因子開發(fā)的亞單位疫苗或核酸疫苗，能夠克服傳統(tǒng)疫苗的部分缺點(diǎn)。以亞單位疫苗為例，選取本研究中篩選出的具有良好免疫原性的毒力相關(guān)蛋白或調(diào)控因子作為抗原，制備亞單位疫苗。這些抗原能夠特異性地激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生針對(duì)腸炎沙門菌的特異性免疫應(yīng)答。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，使用基于某毒力相關(guān)蛋白制備的亞單位疫苗免疫動(dòng)物，動(dòng)物在感染腸炎沙門菌后，體內(nèi)的抗體水平顯著升高，能夠有效清除細(xì)菌，保護(hù)動(dòng)物免受感染。核酸疫苗也是一種極具潛力的新型疫苗，通過(guò)將編碼體內(nèi)感染相關(guān)因子的核酸序列導(dǎo)入機(jī)體，讓機(jī)體自身表達(dá)抗原，從而激發(fā)免疫反應(yīng)。這種疫苗具有生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、成本低、易于保存和運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)，為腸炎沙門菌疫苗的開發(fā)提供了新的思路。本研究篩選出的腸炎沙門菌體內(nèi)感染相關(guān)因子在腸炎沙門菌的防治中具有重要的潛在意義。通過(guò)深入研究這些因子，開發(fā)基于它們的新型藥物和疫苗，有望為腸炎沙門菌感染的防治提供更加有效、安全的策略，從而降低腸炎沙門菌對(duì)人類健康和養(yǎng)殖業(yè)的危害，具有廣闊的應(yīng)用前景和社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。五、結(jié)論與展望5.1研究主要結(jié)論本研究成功運(yùn)用IVIAT技術(shù)篩選腸炎沙門菌體內(nèi)感染相關(guān)因子，取得了一系列重要成果。在腸炎沙門菌基因組表達(dá)文庫(kù)的構(gòu)建方面，通過(guò)對(duì)腸炎沙門菌50041株基因組DNA進(jìn)行Sau3AI不完全酶切，與經(jīng)BamHI酶切及去磷酸化處理的pET30a/b/c(+)載體連接，并轉(zhuǎn)化至E.coliDH5