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香石竹組培繁殖技術(shù)研究摘要組織培養(yǎng)不僅能保持親本優(yōu)良性短期內(nèi)大量快速繁殖,且組培脫毒是病毒綜合防中的重要措施,外植體的取材最佳是健壯的莖尐或頂芽和莖端,用莖尖作外植體叢生芽發(fā)生率高,75%酒精30s,0.1%升汞6min較適宜于外植體消毒。采用單因素隨機(jī)變量法,初步研究6-BA、蔗糖、瓊脂、活性炭,KT等不同組培條件對(duì)香石竹玻璃化現(xiàn)象發(fā)生的影響,克服或價(jià)低,以期為獲得大量的香石竹組培苗及改善期質(zhì)量奠定了理論基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞:香石竹徑尖愈傷組織激素目錄研究背景……1.材料與方法……1.1材料來源…………………1.1.2試劑………1.1.3器具……1.2實(shí)驗(yàn)方法‥……………1.21MS培養(yǎng)基的準(zhǔn)備與配制……………1.22培養(yǎng)條件……………….1.23外植體的選擇………………1.24前期處理……………2正常有效消毒時(shí)間和外植體成活率……………….2.1不同的消毒時(shí)間對(duì)各外植體成活率及污染率的影響………….2.1.2外植體離體培養(yǎng)成活率及芽誘導(dǎo)率的影響................2.1.3五種培養(yǎng)基.....................2.1.4誘導(dǎo)繼代增殖培養(yǎng)………3.如何快速繁殖香石竹……………..3.1.1培養(yǎng)基篩選……3.1.2玻璃化苗…4.克服或價(jià)低玻璃苗,培育健壯、抗性強(qiáng)的香石竹組培苗…………..4.11影響玻璃化因素很多…4.12激數(shù)KT、6-BA等的用量,KT用量或濃度超過0.5ml/L………….5結(jié)論……………………….6參考文獻(xiàn)……………………
香石竹別名康乃馨[1-2],國石竹科石竹屬,多年生草本植物,其花色嬌艷且具芳香,可用來提取香精原,花期長(zhǎng),是世界四大鮮花之一[3],香石竹除了是觀賞和切花外,也是工、農(nóng)業(yè)必不可少的原材料。它原產(chǎn)于南歐,,其栽培面積和鮮花銷售在我國均占首位[4],由于我國在香石竹育種上相對(duì)落后,目前生產(chǎn)上用的種苗主要依賴國外進(jìn)口,價(jià)格高,導(dǎo)致生產(chǎn)成本高,大大影響種植者的經(jīng)濟(jì)效益。針對(duì)這一問題,所有人不難聯(lián)想到繁殖香石竹種苗的重要性,但香石竹不易用種子繁殖,易產(chǎn)生品種混雜,不能保持原品種優(yōu)良品質(zhì),生產(chǎn)中往往采用掰側(cè)芽扦插來擴(kuò)大繁殖,但存在以下缺點(diǎn):一是插穗來源不足,繁殖系數(shù)低、速度慢不能滿足市場(chǎng)需要;二是長(zhǎng)期扦插繁殖。使病毒嚴(yán)重積累,危害嚴(yán)重,致使切花質(zhì)量[5]下降。組織培養(yǎng)不僅能保持親本優(yōu)良性短期內(nèi)大量快速繁殖,且組培脫毒是病毒綜合防中的重要措施。所以這次實(shí)驗(yàn)是有關(guān)香石竹市場(chǎng)需求及暫時(shí)不需求且種苗又極少得趕緊取材進(jìn)行有效保種,一般取其頂芽[6-7]、莖段[7-9]作為外植體,進(jìn)行快速繁殖提供有效依據(jù),采用單因素隨機(jī)變量法,初步研究6-BA、蔗糖、瓊脂、活性炭,KT等不同組培條件對(duì)莖尐組培苗繼代培養(yǎng)過程中玻璃化現(xiàn)象發(fā)生及克服或價(jià)低,以期為獲得大量的香石竹組培苗及改善期質(zhì)量奠定了理論基礎(chǔ)。1材料與方法1.1材料來源材料來源于我公司在云南昆明香石竹種植基地引進(jìn)或種植資源圃采收的香石竹種苗或-莖尐,有粉紅,大紅,桃紅,黃色,白底藍(lán)邊,桃紅白邊等復(fù)色花邊,也有原來振東園藝有限公司的香石竹組培苗和上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所提供的地被香石竹植物元紅-中國紅也是狀元紅。1.1.2試劑:KT、NAA、6-BA、瓊脂(4-8g)、蔗糖(30g)、無菌水、蒸餾水,0.1%升汞,75%酒精等。1.1.3器具:鑷子、剪刀、無菌紙,手術(shù)刀,三件瓶或比較干凈的接種瓶,接種盆等接種工具、電子分析電平、燒杯(50、100、500、1000ml)、量筒(25、100、1000ml)、容量瓶(100、500、1000ml)、藥勺、玻璃棒、移液管(0.2、0.5、1、5、10ml)、移液槍1ml,電磁爐2000W、冰箱、滴管、吸耳球、PH測(cè)量?jī)x,超凈工作臺(tái)、酒精燈,加熱器等。1.2試驗(yàn)方法1.2.1MS培養(yǎng)基[10]的準(zhǔn)備及配制大量,肌醇,鐵鹽,微量元素,有機(jī),植物激素大量元素(ml)微量元素(ml)有機(jī)母液(ml)鐵鹽(ml)植物激素(ml)濃度:6-BA(3.0mg/l)KT(1mg/l)肌醇(ml)30(1)1156-BA0.5+KT0.51030(2)11106-BA0.6+KT0.31030(3)1156-BA0.51030(4)1156-BA21030(5)115010實(shí)驗(yàn)前把該用的培養(yǎng)基配制好,無菌水,接種或凈瓶用到的器材該滅菌的都準(zhǔn)備好。注意:肌醇一般是要另外分開來獨(dú)自配成濃縮液,因?yàn)樗容^難溶,取10克肌醇,用500ML純凈水溶解,最后定容1L。鐵鹽一般先稱7.46克Na2-EDTA·2H2O用400ML的純凈水溶解并慢慢加熱,再稱5.7克的FeSO4·7H2O用400ML純凈水溶解,慢慢用玻璃棒不斷攪拌,加熱到90多度時(shí),再慢慢加入FeSO4·7H2O溶液使兩者混合,并不斷攪拌直到顏色顯示亮橙色或橙紅色后即可,最后定容1000ML。1.2.2培養(yǎng)條件培養(yǎng)基的pH值為5.8-6.1,按常規(guī)方法進(jìn)行滅菌,我們用的是臥式高壓鍋,壓力一般為0.11-0.13pa,溫度為121-126℃,滅菌一般20-40分鐘,滅培養(yǎng)基一般滅菌時(shí)間為20分鐘,接種器材40分鐘。肖玉蘭等[11]研究發(fā)現(xiàn),在香石竹試管苗的繼代培養(yǎng)中,較適宜的培養(yǎng)基為Ms+BA0.2-0.5g/l,10000~20000lx(太陽光最好)的強(qiáng)度,12h的光照時(shí)間,對(duì)消除香石竹繼代培養(yǎng)中的玻璃化現(xiàn)象有顯著效果。哈梅娟等[12]在防止香石竹試管苗玻璃化問題上,培養(yǎng)適宜溫度為22—27℃;光照強(qiáng)度為2000lx以上,光照時(shí)間為10~12h,我們培養(yǎng)室溫度為22-24℃,光照強(qiáng)度1600-2200lx;封口材料選擇通氣性好的材料,如選用帶網(wǎng)棉透氣孔的封口膜或蓋子,也可用棉塞等,采取這些措施能防止香石竹試管苗的玻璃化。.1.2.3外植體的選擇在組織培養(yǎng)中,外植體的選擇是一個(gè)不可忽視的問題,采用植株的不同部位接種發(fā)現(xiàn)分化率有很大的差異,見表1。表1不同部位叢生芽發(fā)生率植物名稱莖尖莖中莖基葉柄嫩葉香石竹60%30%10%00由表1可見,用莖尖作外植體叢生芽發(fā)生率高。消毒方法,1.2.4前期處理:用手把(莖尐)頂芽或帶腋芽的莖段剝掉一些葉片及莖芽頂端葉片切掉一段,外植體不宜太長(zhǎng)。洗衣粉浸泡10~15min,認(rèn)真洗刷并在自來水下流水沖洗2-3h,用流水洗凈殘留的洗衣粉。后期處理:在超凈工作臺(tái)上轉(zhuǎn)入無菌的廣口瓶中,采用5種消毒時(shí)間處理,先用無菌水清洗1-2,待用。(1)75%酒精20S,0.1%升汞5min;(2)75%酒精20S,0.1%升汞6min;(3)75%酒精30s,0.1%升汞6min;(4)75%酒精30s,0.1%升汞7min;(5)75%酒精20s,0.1升汞8min。每個(gè)處理中經(jīng)酒精浸泡后均用無菌水沖洗2-3次,每次1min,經(jīng)升汞消毒后用無菌水沖洗4-5次,每次1min,處理期間不斷搖晃廣口瓶,使外植體與消毒劑充分接觸,最好升汞淹沒外植體。接種到MS培養(yǎng)基中,觀察外植體存活及污染情況并找出適合最佳消毒方法。但當(dāng)外植體額數(shù)量比較大,品種比較多時(shí),注意品種不能混亂,每次數(shù)量不要太多,少量多次,以保消毒質(zhì)量,看好升汞的消毒最佳時(shí)間和使用效力,我們一般凈瓶一次數(shù)量、品種比較大、多,升汞又比較稀少,我們升汞一般使用N次,所以升汞使用到后面,升汞消毒時(shí)間會(huì)增加一點(diǎn)點(diǎn),同一品種我們一般可分2-3次(2-3批)不同時(shí)間,確保外植體的成活性和升汞等的消毒最佳或有效成果。2正常有效消毒時(shí)間和外植體成活率2.1不同的消毒時(shí)間對(duì)各外植體成活率及污染率的影響在5個(gè)消毒處理中,不論是對(duì)頂芽還是莖段芽,以處理(3)75%酒精30s,0.1%升汞6min的消毒時(shí)間萌發(fā)率最高,均在80%以上,處理(1)的萌發(fā)率最低,不到30%;處理(2)、(4)、(5)的萌發(fā)率偏低,在38.5%~68.8%,從經(jīng)濟(jì)方面考慮,既浪費(fèi)植物材料又消耗成本,達(dá)不到組培的萌發(fā)要求,因此不宜作為最佳的消毒處理。而且處理(2)在接種后15~25d,莖段芽死亡率達(dá)85以上,而頂芽死亡率接近100。這可能與消毒時(shí)間過短,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)污染進(jìn)一步顯現(xiàn),處理(4)、(5)在接種20d內(nèi)也出現(xiàn)生長(zhǎng)不良現(xiàn)象,這可能由于消毒時(shí)間過長(zhǎng),對(duì)外植體已經(jīng)造成一定傷害,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)傷害逐漸表現(xiàn)出來。筆者認(rèn)為該試驗(yàn)的成活率還比較低,據(jù)報(bào)道,在使用培養(yǎng)基一致的情況下,香石竹的誘導(dǎo)率可達(dá)100[13],所以在后續(xù)的研究中還有待增加更多的消毒處理以便提高成活率及控制污染率。2.1.2外植體離體培養(yǎng)成活率及芽誘導(dǎo)率的影響腋芽在莖段上的位置,取每段的一個(gè)腋芽培養(yǎng)在MSO基礎(chǔ)培養(yǎng)基上,25天后現(xiàn)接近枝條最頂端和緊接著枝條基部的芽發(fā)育最慢,而枝條中部的芽發(fā)育最快。2.1.3五種培養(yǎng)基的培養(yǎng)情況培養(yǎng)基號(hào)現(xiàn)象(1)愈傷組織產(chǎn)生,有芽(2)愈傷組織產(chǎn)生,有芽(3)愈傷組織產(chǎn)生,有芽,有少量根系(4)愈傷組織產(chǎn)生,有大量的芽(5)愈傷組織產(chǎn)生,有少量的芽,也有根系結(jié)果發(fā)現(xiàn)五種培養(yǎng)基上都長(zhǎng)出愈傷組織并有不同的分化,(4)愈傷組織比較大多,側(cè)芽也多,但玻璃化也厲害,(1)愈傷組織還行,苗壯也有芽,6-BA比KT易生芽,增殖效果好KT比6-BA易生根,生根效果好。2.1.4誘導(dǎo)繼代增殖培養(yǎng)香石竹組培許多資料中已有報(bào)道,選用其配方培養(yǎng),經(jīng)過一次繼代培養(yǎng)后出現(xiàn)嚴(yán)重玻璃苗現(xiàn)象,為此進(jìn)行了配方的調(diào)整,每個(gè)處理30瓶,第三次繼代接種后30d觀察,試驗(yàn)結(jié)果見表2。根據(jù)表中三項(xiàng)指標(biāo)綜合評(píng)判,繼代培養(yǎng)以MS+NAA0.02為最佳,單芽增殖率為1:3,經(jīng)過4次~5次繼代培養(yǎng)無玻璃苗現(xiàn)象,生根之前的增殖培養(yǎng)以MS+6BA0.1+NAA0.02為最佳,增殖率為1:4,10瓶繼代培養(yǎng)中僅有一瓶中有個(gè)別玻璃苗。表2不同配方對(duì)香石竹芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方g/L單芽增殖倍數(shù)30瓶中出現(xiàn)玻璃苗數(shù)生長(zhǎng)情況cmMS+6-BA1.5+NAA0.1524-27葉片卷曲,株高3.5左右MS+6-BA1.5+NAA0.05524葉色黃株高3.5左右MS+6-BA1.5+NAA0.02524葉片不舒展,玻璃苗多MS+6-BA1+NAA0.02518葉片不舒展,玻璃苗多MS+6-BA0.5+NAA0.0249葉片不舒展,玻璃苗多MS+6-BA0.1+NAA0.0243葉片正常,玻璃苗少M(fèi)S+NAA0.0230葉片生長(zhǎng)正常MS20葉片較小,基部有黃葉 3.如何快速繁殖香石竹3.1.1培養(yǎng)基篩選彭信海等[14]通過對(duì)培養(yǎng)基的篩選得出MS+0.25mg/LBA的培養(yǎng)效果較為理想,能使芽的繁殖系數(shù)穩(wěn)定達(dá)到5~6倍。并且在MS+0.25mg/LBA中加入5mg/L多效唑?qū)τ跍p少香石竹試管苗玻璃化現(xiàn)象效果最好。沈?qū)帠|等[15]通過研究生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)香石竹莖尖誘導(dǎo)形成芽的影響得知,最佳的濃度比例為1:2(NAA:6-BA或KT),最佳組合為0.5mg/LNAA和1.0mg/L6-BA。韓玉琴[16]對(duì)康乃馨莖尖培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)的研究結(jié)果表明,適宜的芽增殖培養(yǎng)MS+2.0mg/L6-BA+0.2~0.5mg/LNAA+3%糖;生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.1~O.5mg/LNAA。沈?qū)帠|等探討了香石竹試管苗增殖過程中,不同的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、碳源、水質(zhì)對(duì)增殖效果的影響,結(jié)果表明,在0.5mg/LNAA和1.0mg/L6-BA的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合下,試管苗增殖效果好、苗壯,增殖率達(dá)4.7。張衛(wèi)芳等[17]研究表明,在培養(yǎng)基MS+1.0mg/L6-BA時(shí),對(duì)香石竹誘導(dǎo)芽萌動(dòng)較好,在MS+0.5mg/L6-BA+0.1mg/LNAA的培養(yǎng)基上繼代增殖培養(yǎng)效果最好,在MS+1.0mg/LNAA的培養(yǎng)基上生根效果較好。劉麗娜等[18]發(fā)明公開了一種適宜香石竹莖段誘導(dǎo)芽的培養(yǎng)基組合物,特別指出MS培養(yǎng)基加0.05~1.20mg/L6-BA,對(duì)莖段誘導(dǎo)芽有效,其中MS+1.0mg/L6-BA效果最好,指明了植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA對(duì)香石竹莖段誘導(dǎo)芽有促進(jìn)的作用。施建羽[19]以香石竹莖尖為試驗(yàn)材料,研究不同濃度激素配比對(duì)試管苗的生根量及根長(zhǎng)的影響,結(jié)果表明,試管苗在培養(yǎng)基MS+1.0mg/LNAA中平均根量最多有33.31根,平均根長(zhǎng)最長(zhǎng)的是在MS+1.0mg/LIBA培養(yǎng)基中,達(dá)0.47Cm。不同研究法案、目的還有繼代次數(shù)等不一樣,所選的培養(yǎng)基就不同,得到最佳效果也就有所差異,6-BA是有利于新芽的誘導(dǎo),但不是越多越好,繼代不能次次用,另外節(jié)位不太明顯,節(jié)位太短,KT可能傾向根系和節(jié)位,主要是拔節(jié),誘導(dǎo)出新芽稀少,但是香石竹再次繁殖或繼代每個(gè)節(jié)位可以作為一個(gè)生長(zhǎng)點(diǎn),我增殖一般用MS+6-BA0.5+KT0.5+NAA0.01;IBA和NAA它們一般用作生根時(shí)多,IBA主根系壯長(zhǎng),NAA主根系不壯但很多也不太長(zhǎng),我們一般選用根系多,組培苗拿出去大棚煉苗方便易活,生根:1/2MS+NAA0.23.1.2玻璃化苗郭達(dá)初等[20]探討了香石竹組織培養(yǎng)系統(tǒng)和玻璃化問題,結(jié)果表明,培養(yǎng)基中添加10~15mg/LCCC或0.5~1.0mg/LPP可導(dǎo)致嫩梢矮化、粗壯,減少玻璃化。彭揚(yáng)等[21]馴采用微莖尖組培技術(shù),大量繁育香石竹無病毒生產(chǎn)用苗株,在增殖培養(yǎng)中選用不加激素的MS培養(yǎng)基或MS+6-BA0.1,小容積容器及透氣封口膜處理容器瓶口,均可有效降低培養(yǎng)過程中的玻璃化株率。周莉娟等[22]用莖尖培養(yǎng)的方法或通過無菌播種,再利用帶葉莖段進(jìn)行快速繁殖試驗(yàn),并通過調(diào)整培養(yǎng)條件尋找克服玻璃化的試驗(yàn)方法,得知,在未出現(xiàn)嚴(yán)重玻璃化之前,適當(dāng)降低激素特別是細(xì)胞分裂素類激素的用量可以減少玻璃苗的出現(xiàn),但對(duì)于已經(jīng)玻璃化的苗,調(diào)整激素用量則收效甚微;增加瓊脂用量也有利于控制玻璃苗的出現(xiàn),一般7.0~10g/L即可,我對(duì)瓊脂用量8g/L,培養(yǎng)基剛好不算很硬,香石竹就生長(zhǎng)緩慢一點(diǎn)點(diǎn),不太明顯。高疆生等[23]以香石竹為試驗(yàn)材料,通過更換棉塞,增加瓊脂濃度,降低6-BA濃度,及在培養(yǎng)基中添加不同濃度的青霉素等方法來克服玻璃化現(xiàn)象,結(jié)果表明,這些措施對(duì)克服試管苗玻璃化均有效果,尤以添加青霉素效果最佳,正常苗誘導(dǎo)率達(dá)95%。4.克服或價(jià)低玻璃苗,培育健壯、抗性強(qiáng)的香石竹組培苗4.11影響玻璃化因素很多,健壯的香石竹苗,我們選用云南發(fā)來的或新引進(jìn)(國外引進(jìn)),因?yàn)樵颇系暮0胃?,晝夜溫差大,適合培育抗性強(qiáng)種苗。另外香石竹組培苗轉(zhuǎn)接或繼代很多代后就會(huì)出現(xiàn)玻璃化,出現(xiàn)少量都趕快采取措施,別等來不及再亡羊補(bǔ)牢。蔗糖選用:增殖培養(yǎng)基30g/L最適宜,生根培養(yǎng)基20g/L也還好,瓊脂4-10/L,有玻璃化苗了瓊脂可用8g/L,這樣培養(yǎng)基不會(huì)太硬也不軟,瓊脂在培養(yǎng)基種不僅具有支撐培養(yǎng)苗平衡的作用,也影響培養(yǎng)基中可利用的水分。瓊脂濃度就低時(shí),培養(yǎng)基可利用水分過多,不利于培養(yǎng)基中滲透壓平衡,影響苗的生長(zhǎng)和分化,新生幼苗呈水浸狀,導(dǎo)致玻璃化現(xiàn)象嚴(yán)重,瓊脂濃度過高,培養(yǎng)基內(nèi)可利用水分少,營(yíng)養(yǎng)物資難以被培養(yǎng)的組織吸收利用,芽分化力減弱,增殖系數(shù)較低。4.12激數(shù)KT、6-BA等的用量,KT用量或濃度超過0.5ml/L,香石竹組培苗的拔節(jié)很長(zhǎng),苗系長(zhǎng),增殖系數(shù)不高,玻璃化也厲害,6-BA濃度也是不能太高,濃度超過1ml/L時(shí),香石竹組培苗節(jié)位太緊湊,不好按節(jié)位繼代,玻璃化也很厲害,6-BA濃度為0.5ml/L時(shí),香石竹的增殖系數(shù)最高,玻璃化苗率較低,我一般增殖用MS+6-BA0.5ml/L+KT0.5ml/L+NAA0.01ML/L,生根MS+NAA0.2ml/L,出現(xiàn)香石竹苗有玻璃化時(shí)可以在里面加活性炭,增殖培養(yǎng)基不能放太多,增殖放0.5g/L,生根培養(yǎng)基放活性炭4g/L?;钚蕴烤哂形叫?,在培養(yǎng)基中適量的活性炭能減少一些有害物質(zhì)的影響。相同激數(shù)濃度條件下,附加活性炭的培養(yǎng)基與未附加活性炭的培養(yǎng)基相比,其組培苗玻璃化率明顯降低,差異顯著。我用同樣的激數(shù)濃度,MS+6-BA0.5ml/L+KT0.5ml/L+NAA0.01ML/L,一個(gè)加了活性炭一個(gè)未加,加了活性炭的一瓶可以繼代三瓶或三瓶以上,未加活性炭的一瓶只能繼代一瓶或兩瓶母苗繼代三瓶。5結(jié)論正確選擇具有品種典型性的優(yōu)良單株作為母株,通過選拔優(yōu)良個(gè)體進(jìn)行莖尖培養(yǎng)以長(zhǎng)期保存優(yōu)良品種的種性,建立優(yōu)良的香石竹繁育體系。用莖尖培養(yǎng)脫去病毒、真菌、細(xì)菌感染獲得原原種(核心種苗nuclearstock),拿去海拔高,晝夜溫差大的地方像云南等地露天繁殖,自然生長(zhǎng),嚴(yán)格病蟲害控制、病原快速檢測(cè)、合理肥水等技術(shù)措施,建立無菌環(huán)境、原原種、原種、繁殖用種栽培管理技術(shù)體系,并為組培提供健壯、抗性強(qiáng)的外植體,根據(jù)香石竹市場(chǎng)需求采用單因素隨機(jī)變量法,調(diào)整6-BA,KT,活性炭,瓊脂等不同組培條件,并克服或減少玻璃化苗率,快速繁育健壯優(yōu)良抗性強(qiáng)的香石竹組培苗。
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