生物工業(yè)下游加工技術

第四章微生物細胞破碎第一節(jié)細胞壁的組成與結構第二節(jié)常用破碎方法第三節(jié)破碎率的測定與破碎技術的研究方向

第一節(jié)細胞壁的組成與結構細胞壁（cellwall）是細胞的外層，在細胞膜的外面，細胞壁之厚薄常因組織、功能不同而異。植物、真菌、藻類和原核生物（除了支原體與L形細菌（缺壁細菌））都具有細胞壁，而動物細胞不具有細胞壁。細胞壁本身結構疏松，外界可通過細胞壁進入細胞中，細胞壁具有全透性。細胞壁分為3層，即胞間層（中層）、初生壁和次生壁。胞間層把相鄰細胞粘在一起形成組織。細菌的細胞壁結構圖

根據(jù)細菌細胞壁的構造和化學組成不同，可將其分為G+細菌與G-細菌。G+細菌的細胞壁較厚（20～80nm），但化學組成比較單一，只含有90％的肽聚糖和10％的磷壁酸；但G-細菌的細胞壁較?。?0～15nm），卻有多層構造（肽聚糖和脂多糖層等），其化學成分中除含有肽聚糖以外，還含有一定量的類脂質和蛋白質等成分。此外，兩者在表面結構上也有顯著不同。革蘭氏陽性菌和陰性菌

細胞壁的比較細菌破碎的主要阻力來自于肽聚糖的網(wǎng)狀結構，其網(wǎng)狀結構的致密程度和強度取決于多糖鏈上所存在的肽健數(shù)量和其交聯(lián)的程度。交聯(lián)程度越大，網(wǎng)狀結構就越致密，破碎的難度也就越大。各種微生物細胞壁的結構與組成微生物革蘭氏陽性菌革蘭氏陰性菌酵母菌霉菌壁厚/nm20-8010-13100-300100-250層次單層多層多層多層主要組成肽聚糖（40-90%）多糖胞壁酸蛋白質脂多糖（1%-4%）肽聚糖(5-10%)脂蛋白脂多糖（11%-22%）磷脂蛋白質葡聚糖（30%-40%）甘露聚糖（30%）蛋白質(6%-8%)脂類（8.5%-13.5%）多聚糖（80-90%）脂類蛋白質酵母菌細胞酵母菌形態(tài)酵母菌細胞結構周質空間原生質膜多糖甘露糖蛋白周質蛋白酵母細胞壁破碎的阻力主要取決于壁結構交聯(lián)的緊密程度和它的厚度。霉菌霉菌的細胞壁結構霉菌的細胞壁主要由多糖組成，其次含有少量的蛋白質和脂類。其中絕大多數(shù)的多糖壁是由幾丁質和葡聚糖構成的，幾丁質與纖維素結構很類似。由于霉菌細胞壁中含有纖維狀結構，其強度比細菌和酵母菌的細胞壁有所提高。細胞壁結構與細胞破碎為了破碎細胞，必須克服的主要阻力是連接細胞壁網(wǎng)狀結構的共價鍵。了解細胞壁的組成和結構，就可以用合適的溶菌酶和化學試劑，以及在使用多種酶活化學試劑相結合時確定其使用的順序。第二節(jié)常用破碎方法分類作用機理適應性機珠磨法固體剪切作用可達較高破碎率，可較大規(guī)模操作，大分子目的產(chǎn)物易失活，漿液分離困難。械高壓勻漿法超聲破碎法液體剪切作用液體剪切作用可達較高破碎率，可大規(guī)模操作，不適合絲狀菌和革蘭氏陽性菌對酵母菌效果較差，破碎過程升溫劇烈，不適合大規(guī)模操作法X-press法固體剪切作用破碎率高，活性保留率高，對冷凍敏感的目的產(chǎn)物不適應非酶溶法酶分解作用具有高度專一性，條件溫和，漿液易分離，溶酶價格高，通用性差機化學滲透法改變細胞膜的滲透性械滲透壓法反復凍結-融化破碎率較低，常與其他方法結合使用法凍結融化法反復凍結-融化破碎率較低，不適合對冷凍敏感的目的產(chǎn)物

干燥法改變細胞膜滲透性條件變化劇烈，易引起大分子物質失活珠磨法珠磨法是一種有效的細胞破碎法。其工作原理是：進入珠磨機的細胞懸浮液與極小的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑（直徑<1mm）一起快速攪拌或研磨，研磨劑、珠子與細胞之間的互相剪切、碰撞，使細胞破碎，釋放出內含物。在珠液分離器的協(xié)助下，珠子被滯留在破碎室內，漿液流出從而實現(xiàn)連續(xù)操作。珠磨機結構示意圖珠磨機實物圖高壓勻漿法高壓勻漿法是大規(guī)模細胞破碎的常用方法，所用設備是高壓勻漿器。原理：利用高壓使細胞懸浮液通過針型閥，由于突然減壓和高速沖擊撞擊環(huán)使細胞破裂。在工業(yè)規(guī)模的細胞破碎中，對于酵母等難破碎的及高濃度的細胞，常采用多次循環(huán)的操作方法。高壓勻漿法一般來說，酵母菌較細菌難破碎，處于靜止狀態(tài)的細胞較處于快速生長狀態(tài)的細胞難破碎，在復合培養(yǎng)基上培養(yǎng)的細胞比在簡單合成培養(yǎng)基上培養(yǎng)的細胞較難破碎。不易采用高壓勻漿法的微生物細胞：團狀或絲狀真菌（易造成堵塞），較小的革蘭氏陽性菌，以及含有包涵體的基因工程菌，因為包涵體質地堅硬，易損傷勻漿閥。包涵體：在某些生長條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細胞內，或被膜包裹或形成無膜裸露結構，這種水不溶性的結構稱為包涵體（InclusionBodies，IB）。其形成原因主要因為在重組蛋白的表達過程中缺乏某些蛋白質折疊的輔助因子或環(huán)境不適，無法形成正確的次級鍵等原因形成的。高壓勻漿法與珠磨法的比較高壓勻漿法：操作參數(shù)少，易確定，適合大規(guī)模操作。高壓勻漿需配備換熱器進行級間冷卻。一次操作即可達到較高的破碎率。不適合于絲狀真菌及含有包涵體的基因工程菌。珠磨法：操作參數(shù)多，憑經(jīng)驗估計。夾套冷卻控溫難度大。兼具破碎和冷卻雙重功能，減少了產(chǎn)物失活的可能性。適合于各種微生物細胞的破碎。酶溶法利用酶反應，分解破壞細胞壁上的特殊鍵，從而達到破壁的目的。該方法可分為外加酶法和自溶法兩種。外加酶法中，常用的酶有溶菌酶、葡聚糖酶，蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽鍵內切酶、殼多糖酶等。細胞壁溶解酶是這幾種酶的復合物。廣東省微生物所生產(chǎn)一種lywallzyme（溶壁酶），是復合酶，適合真菌和酵母細胞壁的溶解。外加酶法主要用于實驗室規(guī)模釋放細胞內的目的產(chǎn)物，還可用于剝離細胞壁，將原生質體進行融合。溶酶法的優(yōu)點：選擇性釋放產(chǎn)物，條件溫和，核酸泄出量少，細胞外形完整。缺點：酶價格高，不適合大規(guī)模應用；通用性差，不同菌種需選擇不同的酶，且不易確定最佳的溶解條件；存在產(chǎn)物抑制，如甘露糖對蛋白酶有抑制作用，導致胞內物質釋放率低。自溶法是一種特殊的酶溶方式，其所需的溶胞酶是由微生物本身產(chǎn)生的。影響自溶過程的主要因素有溫度、時間、pH、激活劑和細胞代謝途徑等。微生物細胞的自溶法常采用加熱法或干燥法。例如對谷氨酸生產(chǎn)菌，可加入Na2CO3和NaHCO3，配成pH10的緩沖液，再配3%的細胞懸浮液，加熱至70C，保溫攪拌20min，菌體即可自溶。缺點：對不穩(wěn)定的微生物，易引起所需蛋白質的變性；此外，自溶后細胞懸浮液粘度增大，過濾速率下降。化學滲透法某些化學試劑可以改變細胞壁或膜的通透性（滲透性），從而使得胞內物質有選擇地滲透出來，這種處理方式稱為化學滲透法?；瘜W滲透試劑：（1）表面活性物質：TritonX-100，能結合并溶解磷脂，破壞內膜的磷脂雙分子層。(2)EDTA螯合劑：EDTA，革蘭氏陰性菌的外層膜通?？慷r陽離子結合脂多糖和蛋白質來維持。EDTA螯合離子后，大量的脂多糖將脫落，使細胞壁外層膜出現(xiàn)洞穴。這些區(qū)域由內層膜的磷脂來填補，從而導致內層膜通透性增強?；瘜W滲透劑（3）有機溶劑：甲苯，能被吸收進入細胞壁中的類脂，使細胞膜溶脹，進而使細胞破碎。（4）變性劑：鹽酸胍和脲是常用的變性劑。它們與水中氫鍵作用，削弱溶質分子間的疏水作用，使疏水性化合物溶于水溶液。幾種試劑合理地搭配使用能有效地提高胞內物質的釋放率。。不同細胞可采用的化學滲透

處理方式細胞類別變性劑清潔劑有機溶劑酶抗生素生物試劑螯合劑革蘭氏陰性菌******革蘭氏陽性菌***酵母菌******植物細胞****巨噬細胞***化學滲透法的優(yōu)缺點優(yōu)點：（1）對產(chǎn)物釋放具有一定選擇性。（2）細胞外形保持完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分離和進一步提取。缺點：（1）通用性差，某種試劑只能作用于某些特定類型的細胞。（2）時間長，效率低，一般胞內物質釋放率不超過50%。（3）有些化學試劑有毒性，在其后的產(chǎn)物提取精制過程中，需設法分離除去。X-press法是將濃縮的菌體懸浮液冷卻至-25?C形成冰晶體，利用500MPa以上的高壓沖擊，使冷凍細胞從高壓閥小孔中擠出。細胞破碎是由于冰晶體的磨損，使包埋在冰中的微生物變形而引起的。此法適應范圍廣、破碎率高、細胞碎片粉碎程度低、目標產(chǎn)物活性保留率高。但此法不適用于對冷凍敏感的生活物質。滲透壓法是一種較溫和的細胞破碎法。將細胞放在高滲透壓的介質（甘油或蔗糖溶液）中，達到平衡后，轉入到滲透壓低的緩沖液或純水中，由于滲透壓的突然變化，水迅速進入細胞內，引起細胞溶脹，甚至破碎，使得內容物釋放出來。僅適用于細胞壁較為脆弱的細胞，或者細胞壁預先用酶處理，或者在培養(yǎng)過程中價位某些抑制劑（如抗生素），使得細胞壁有缺陷，強度減弱。反復凍結-融化法將細胞放在低溫下突然冷凍而在室溫下緩慢融化，反復多次而達到破壁作用。原理：由于冷凍，一方面使細胞膜的疏水鍵結構破裂，從而增加細胞的親水性能；另一方面，胞內水結晶，使細胞內外溶液濃度變化，引起細胞膨脹而破裂。此法只適用于細胞壁較脆弱的菌體，破碎率較低，常需反復多次。此外，凍融過程中可能引起某些蛋白質變性。干燥法可采用多種方法使細胞干燥，如氣流干燥、真空干燥、噴霧干燥和冷凍干燥等。通過干燥使細胞膜的結合水分喪失，從而改變細胞的滲透性。當采用丙酮、丁醇或緩沖液等對干燥細胞進行處理時，胞內物質就容易被抽提出來。氣流干燥主要適用于酵母菌。氣流干燥時部分酵母可能產(chǎn)生自溶，所以較冷凍干燥和噴霧干燥更容易提取。真空干燥多用于細菌，冷凍干燥多用于較不穩(wěn)定的生化物質。干燥法條件變化劇烈，容易引起蛋白質或其他活性物質變性。第三節(jié)破碎率的測定與破碎技術的研究方向1、直接測定法2、目的產(chǎn)物測定法3、導電率測定法直接測定法采用適當?shù)姆椒?，計?shù)破碎前后的細胞數(shù)即可直接計算出細胞破碎率?？捎蔑@微鏡或電子微粒計算器直接計數(shù)。破碎后的細胞可采用染色的方法與未受損的完整細胞區(qū)分開來。如采用革蘭氏染色法染色酵母破碎液，未受損的細胞呈紫色，而受損害的細胞呈亮紅色。目的產(chǎn)物測定法（間接法）細胞破碎后，通過測定破碎液中目的產(chǎn)物的釋放量來估算破碎率。通過將破碎后的細胞懸浮液用離心法分離細胞碎片，測定上清液中目的產(chǎn)物（如蛋白質或酶）的含量或活性，并與100%破碎率所獲得的標準數(shù)值比較，計算其破碎率。導電率測定法利用破碎前后導電率的變化來測定細胞破碎程度的快速方法。原理：細胞破碎后，大量帶電荷的內含物被釋放到水相，使導電率上升。導電率隨著破碎率的增加而呈線性增加。正式測定前應預先采用其他方法制定標準曲線。破碎技術的研究方法1.多種破碎方法相結合；2.與上游過程相結合；3.與下游過程相結合；多種破碎方法相結合化學法與酶法取決于細胞壁膜的化學組成，而機械法取決于細胞結構的機械強度。在實際操作中，可先用化學法或酶法對細胞進行處理，破壞細胞壁膜的某些物質組成，使壁膜的機械強度下降，隨后再用機械法處理，即可大大提高細胞的破碎率。與上游過程相結合（1）培養(yǎng)過程控制：在發(fā)酵培養(yǎng)后期，加入能抑制細胞壁物質合成的抑制劑（如青霉素），導致新分裂的細胞其細胞壁存在缺陷，有些胞內產(chǎn)物不經(jīng)破碎便可直接滲透出來。（2）寄主細胞的選擇：選擇較易破壁的菌種作為宿主細胞，如革蘭氏陰性菌（大腸桿菌）。與上游過程相結合（3）包涵體的形成。寄主細胞破碎后，包涵體可用密度梯度離心機收集。收集的包涵體用變性劑溶解，再除去變性劑即可得到恢復活性的蛋白質產(chǎn)品。（4）克隆噬菌體溶解基因：在細胞內引進噬菌體基因，培養(yǎng)結束后，控制一定條件（如溫度等），激活噬菌體基因，使細胞自內向外溶解，釋放出內含物。與上游過程相結合耐高溫產(chǎn)品的基因表達：如果產(chǎn)品能表達成耐高溫型（如高溫淀粉酶），雜蛋白仍然保持原特性，那么就可在較高溫度下將產(chǎn)品與雜質分開，既節(jié)省了冷卻費用，又簡化了分離