乙型肝炎病毒感染小鼠模型構(gòu)建及應(yīng)用的深度解析一、引言1.1研究背景乙型肝炎病毒（HepatitisBvirus，HBV）感染是一個全球性的公共衛(wèi)生問題，嚴重威脅著人類的健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計，全球約有2.57億慢性HBV感染者，每年約有88.7萬人死于HBV相關(guān)疾病，如肝硬化和肝細胞癌。在中國，雖然經(jīng)過多年的努力，乙肝的防控取得了顯著成效，但乙肝病毒攜帶者數(shù)量仍較為龐大。2024年全國乙肝普查結(jié)果顯示，我國乙肝病毒（HBV）感染者達7500萬，乙肝表面抗原（HBsAg）流行率為5.86%。HBV相關(guān)肝病的死亡率占全球的近30%，每年有30.8萬人死亡，且死亡率隨年齡增長而升高，同時，我國超過80%的肝癌和乙肝相關(guān)。目前，臨床上用于治療慢性乙肝的藥物主要包括核苷（酸）類似物（NAs）和α干擾素（IFN-α）。這些藥物雖然能在一定程度上控制病毒復(fù)制，減緩疾病進程，但無法徹底清除病毒，實現(xiàn)慢性乙型肝炎的完全治愈。主要原因在于現(xiàn)有藥物難以清除HBV感染細胞后形成的共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA），它是HBV復(fù)制的關(guān)鍵模板，持續(xù)存在于肝細胞核中，使得病毒難以被徹底根除。深入研究HBV的感染機制、致病過程以及開發(fā)更有效的治療方法，迫切需要合適的實驗?zāi)Ｐ汀游锬Ｐ驮卺t(yī)學(xué)研究中具有不可替代的作用，它們能夠模擬人類疾病的發(fā)生發(fā)展過程，為研究疾病機制、篩選和評價藥物療效提供重要的工具。在HBV研究領(lǐng)域，理想的動物模型應(yīng)能高度模擬人類HBV感染的病理生理過程，包括病毒的進入、復(fù)制、持續(xù)感染以及免疫應(yīng)答等環(huán)節(jié)。小鼠作為最常用的實驗動物之一，具有繁殖周期短、成本低、易于操作和遺傳背景清晰等諸多優(yōu)點。然而，小鼠不能自然感染HBV，這限制了其在HBV研究中的應(yīng)用。為了克服這一障礙，科研人員通過各種技術(shù)手段，如轉(zhuǎn)基因技術(shù)、人源化小鼠構(gòu)建技術(shù)以及病毒載體介導(dǎo)的基因遞送技術(shù)等，致力于建立能夠支持HBV感染和復(fù)制的小鼠模型。這些小鼠模型的建立，為HBV研究提供了新的途徑和方法，有助于深入探討HBV的生物學(xué)特性、感染機制以及宿主免疫應(yīng)答等關(guān)鍵問題，推動乙肝治療藥物和疫苗的研發(fā)進程。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在乙肝病毒感染小鼠模型的構(gòu)建研究方面，國內(nèi)外科研人員已取得了一系列重要成果，但也面臨著諸多挑戰(zhàn)和問題。在國外，早在20世紀80年代，科研人員就開始嘗試構(gòu)建HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型。通過將HBV基因組整合到小鼠基因組中，使小鼠能夠表達HBV相關(guān)抗原和蛋白，如HBsAg、HBeAg等。這種模型在一定程度上模擬了HBV感染的部分特征，為研究HBV的基因表達和復(fù)制機制提供了基礎(chǔ)。然而，由于小鼠缺乏HBV特異性受體，HBV無法自然進入小鼠肝細胞，因此該模型不能完全模擬HBV的感染過程，也無法研究HBV感染的早期步驟。隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，人源化小鼠模型逐漸成為研究熱點。人源化小鼠模型是通過將人肝細胞或肝臟組織移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，使小鼠能夠支持HBV的感染和復(fù)制。其中，F(xiàn)ah-/-Rag2-/-Il2rg-/-小鼠模型是一種較為常用的人源化小鼠模型。該模型的自體肝細胞會發(fā)生進行性、不可逆轉(zhuǎn)的損傷，且這種肝損傷可通過藥物NTBC進行選擇性控制；同時，Rag2-/-Il2rg-/-聯(lián)合缺陷使小鼠的T、B細胞及自然殺傷細胞發(fā)育受阻，對植入的人肝細胞不發(fā)生免疫排斥。因此，免疫缺陷的Fah-/-Rag2-/-Il2rg-/-小鼠移植的人肝細胞能獲得生長優(yōu)勢，人肝嵌合率可高達95%，已報道人肝嵌合的Fah-/-Rag2-/-Il2rg-/-小鼠能感染HBV和HCV。然而，該模型也存在一些局限性，如小鼠的免疫缺陷狀態(tài)可能會影響宿主對HBV的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致與人類自然感染HBV的免疫反應(yīng)存在差異；此外，人肝細胞的移植過程較為復(fù)雜，且移植后的肝細胞存活率和功能穩(wěn)定性有待進一步提高。腺相關(guān)病毒（AAV）載體介導(dǎo)的小鼠模型也是近年來研究的重點之一。通過將HBV基因組包裝到AAV載體中，然后將其注射到小鼠體內(nèi)，可使HBV在小鼠肝臟中實現(xiàn)高效轉(zhuǎn)導(dǎo)和復(fù)制。例如，李鋒團隊利用AAV-HBV小鼠模型，深入研究了慢性HBV感染及評估抗病毒治療的效果，為乙肝治療藥物的研發(fā)提供了重要的實驗依據(jù)。AAV因其穩(wěn)定性和低致病性，已被廣泛應(yīng)用于基因治療領(lǐng)域，為HBV研究帶來了新的突破。但該模型也面臨著一些問題，如AAV載體的免疫原性可能會影響實驗結(jié)果，且長期使用AAV載體可能會導(dǎo)致小鼠體內(nèi)產(chǎn)生針對AAV的抗體，從而影響后續(xù)實驗的進行。在國內(nèi)，相關(guān)研究也在積極開展并取得了顯著進展。2012年，李文輝團隊鑒定到了HBV入胞的功能性受體——牛磺膽酸鈉共轉(zhuǎn)運多肽（NTCP），這一發(fā)現(xiàn)極大地促進了基于人肝癌細胞的HBV感染細胞模型的建立和HBV分子生物學(xué)的研究，為構(gòu)建更接近真實感染情況的小鼠模型奠定了基礎(chǔ)。2019年，鄧宏魁等團隊篩選到原代人肝細胞（PHH）長期培養(yǎng)所需的5種小分子化合物（5C），實現(xiàn)了體外PHHs延長培養(yǎng)及支持HBV感染至4周以上，為HBV感染機制的研究提供了更穩(wěn)定的細胞模型，也為人源化小鼠模型中肝細胞的來源和功能維持提供了新的思路。夏宇塵教授研究組則通過使用AAV系統(tǒng)將復(fù)制缺陷的線性乙肝病毒基因組遞送進小鼠肝臟，經(jīng)過宿主ATR介導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)途徑修復(fù)形成HBVcccDNA，進而建立了病毒持續(xù)復(fù)制慢性肝炎模型。該模型可通過病毒表面抗原的表達指示HBVcccDNA的形成，并可用于抗病毒藥物的臨床前評估。然而，目前這些模型仍然受到無法模擬真實的病毒生命周期、培育困難、高成本和HBV感染后次優(yōu)免疫反應(yīng)等條件的限制。此外，國內(nèi)學(xué)者還在不斷探索新的模型構(gòu)建方法和技術(shù)，如利用噬菌體ΦC31整合介導(dǎo)的分子內(nèi)重組技術(shù)制備與天然cccDNA高度相似的HBVcircle，可在小鼠肝臟內(nèi)啟動病毒復(fù)制和抗原表達；通過將不同肝分化狀態(tài)的HepaRG細胞移植到免疫缺陷小鼠中，開發(fā)基于HepaRG的人肝嵌合小鼠模型，支持HBV持續(xù)24周的感染；以及通過移植人骨髓間充質(zhì)干細胞，構(gòu)建肝臟和免疫細胞雙重人源化的小鼠模型，模擬HBV自然感染誘發(fā)的慢乙肝肝硬化的發(fā)病過程等。這些研究為乙肝病毒感染小鼠模型的構(gòu)建和完善提供了更多的選擇和可能性，但也都存在各自的局限性，需要進一步優(yōu)化和改進。1.3研究目的與意義本研究旨在通過深入探索和優(yōu)化現(xiàn)有技術(shù)，建立一種更加理想的乙型肝炎病毒感染小鼠模型。該模型需能夠高度模擬人類HBV感染的自然過程，包括病毒的進入、復(fù)制、持續(xù)感染以及宿主的免疫應(yīng)答等關(guān)鍵環(huán)節(jié)。具體而言，研究將運用基因編輯技術(shù)，如CRISPR/Cas9系統(tǒng)，精確修飾小鼠的相關(guān)基因，使其表達人源的HBV受體，如?；悄懰徕c共轉(zhuǎn)運多肽（NTCP），以實現(xiàn)HBV對小鼠肝細胞的有效感染。同時，結(jié)合細胞移植技術(shù)，將人源肝細胞或肝臟類器官移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，構(gòu)建人源化肝臟嵌合小鼠模型，進一步完善HBV感染的微環(huán)境，從而更真實地反映HBV在人體內(nèi)的感染和致病機制。本研究的意義重大。從基礎(chǔ)研究角度來看，該模型將為深入剖析HBV的生物學(xué)特性和感染機制提供有力工具。通過在小鼠模型上進行實驗，科研人員能夠更加系統(tǒng)地研究HBV的生命周期，包括病毒的吸附、侵入、脫殼、基因組復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯以及病毒粒子的組裝和釋放等過程，揭示HBV與宿主細胞之間的相互作用機制，為理解HBV的致病機制提供關(guān)鍵線索。在藥物研發(fā)領(lǐng)域，該模型將發(fā)揮不可替代的作用。目前，乙肝治療藥物的研發(fā)面臨諸多挑戰(zhàn)，其中一個重要原因就是缺乏能夠準確評估藥物療效和安全性的動物模型。本研究建立的小鼠模型可以用于篩選和評價新型抗HBV藥物，包括小分子化合物、核酸藥物、免疫調(diào)節(jié)劑等，為新藥的研發(fā)提供可靠的實驗依據(jù)，加速藥物研發(fā)進程，提高研發(fā)效率，有望推動乙肝治療藥物的創(chuàng)新和突破。此外，該模型還有助于研究HBV感染與宿主免疫應(yīng)答之間的關(guān)系，探索免疫治療的新策略。通過分析小鼠模型在HBV感染過程中的免疫細胞活化、細胞因子分泌以及免疫記憶形成等方面的變化，為開發(fā)基于免疫調(diào)節(jié)的乙肝治療方法提供理論支持和實驗基礎(chǔ)，為實現(xiàn)乙肝的功能性治愈乃至徹底治愈帶來新的希望。綜上所述，建立理想的乙型肝炎病毒感染小鼠模型對于深入研究HBV的發(fā)病機制、開發(fā)新型治療藥物以及推動乙肝防治事業(yè)的發(fā)展具有重要的科學(xué)價值和現(xiàn)實意義。二、乙型肝炎病毒與小鼠模型基礎(chǔ)理論2.1乙型肝炎病毒特性乙型肝炎病毒（HBV）在分類上歸屬于嗜肝DNA病毒科正嗜肝DNA病毒屬，是引起乙型肝炎的病原體。其病毒顆粒在電子顯微鏡下呈現(xiàn)三種不同形態(tài)，分別為大球形顆粒（Dane顆粒）、小球形顆粒和管形顆粒。大球形顆粒是具有感染性的完整HBV顆粒，直徑約42nm，呈球形且具有雙層結(jié)構(gòu)。它由包膜和核衣殼構(gòu)成，包膜含有HBsAg、糖蛋白等成分，核心顆粒內(nèi)包含核心蛋白（HBcAg）、環(huán)狀雙股HBV-DNA以及HBV-DNA多聚酶。這種結(jié)構(gòu)使得Dane顆粒能夠完成病毒的感染、復(fù)制等一系列生物學(xué)過程。小球形顆粒直徑約22nm，主要由HBsAg形成中空顆粒，不含有DNA和DNA多聚酶，因此不具備傳染性。管形顆粒則是由小球形顆粒串聯(lián)聚合而成，直徑與小球形顆粒相同，長度約在100-500nm之間，其成分同樣是與病毒包膜相同的脂蛋白，也不具備感染性。HBV的基因組結(jié)構(gòu)獨特而精密，由不完全的環(huán)狀雙鏈DNA組成，長鏈為負鏈，含約3200個堿基，短鏈為正鏈，其長度可變?；蚪M中包含4個開放讀碼框（ORF），均位于負鏈上，分別為S區(qū)、C區(qū)、P區(qū)和X區(qū)。S區(qū)又進一步分為前S1、前S2及S三個編碼區(qū)，分別編碼包膜上的前S1蛋白、前S2蛋白及HBsAg。其中，前S蛋白具有很強的免疫原性，在HBV的嗜肝性方面發(fā)揮重要作用，主要通過與肝細胞受體之間的識別和介導(dǎo)來實現(xiàn)。C區(qū)分為前C基因和C基因，分別編碼HBeAg和HBcAg。從前C基因開始編碼的蛋白質(zhì)經(jīng)過加工后分泌到細胞外即為HBeAg，從C基因開始編碼的蛋白質(zhì)則為HBcAg。P區(qū)是最長的讀碼框架，編碼一個大分子堿性多肽，分子量約為90KD，該多肽含有多種功能蛋白，在HBV的復(fù)制過程中起著關(guān)鍵作用。X基因編碼X蛋白（HBxAg），HBxAg具有反式激活作用，能夠激活HBV本身的、其他病毒的或細胞的多種調(diào)控基因，進而促進HBV或其他病毒（如艾滋病病毒）的復(fù)制。HBV的傳播途徑主要包括血液傳播、母嬰傳播和性傳播。在血液傳播方面，主要的接觸方式有與患者共用不潔的注射器、紋身、輸注被污染的血制品等。隨著對輸血管理的日益嚴格，輸血傳播已較為罕見，但通過皮膚和黏膜微小創(chuàng)傷而被感染的情況仍不容忽視，如文身、文眉、吸毒、使用未經(jīng)消毒的醫(yī)療器械、共用剃須刀和牙具等。母嬰傳播曾經(jīng)是HBV最重要的傳播途徑，出生于HBsAg/HBeAg陽性母親的嬰兒，HBV感染率高達95％，大部分在分娩過程中感染，約5％-15％可能系宮內(nèi)感染。不過，在我國開展新生兒乙型肝炎疫苗免疫規(guī)劃后，母嬰傳播途徑已在很大程度上被成功阻斷。在性傳播方面，在歐美國家，性接觸傳播是成人HBV的重要傳播途徑，與HBV感染者發(fā)生無防護的性接觸，特別是有多個性伴侶者、男男同性性行為者，感染危險性較高。需要注意的是，HBV不會通過呼吸道及消化道傳播，與HBV攜帶者共同生活、學(xué)習(xí)、工作，屬于無血液暴露接觸，一般不會被傳染。HBV的致病機制較為復(fù)雜。當(dāng)HBV侵入人體后，會進入肝細胞進行復(fù)制，然后釋放到血液中，在肝細胞表面留下特異性病毒抗原，這些抗原會結(jié)合肝細胞膜，改變肝細胞表面的抗原特性。當(dāng)病毒從肝臟進入血液時，會刺激機體的免疫系統(tǒng)，使淋巴細胞致敏，B細胞產(chǎn)生特異性抗體。致敏T淋巴細胞能夠識別和攻擊附著有病毒抗原的肝細胞。一方面，特異性抗體與血液中的病毒發(fā)生反應(yīng)；另一方面，與附著病毒抗原的肝細胞膜發(fā)生反應(yīng)，在消除病毒的同時，也會損害被感染的肝細胞，導(dǎo)致肝細胞變性和壞死。此外，HBV感染人體后的發(fā)病機制還涉及免疫系統(tǒng)反應(yīng)、病毒蛋白的作用以及遺傳因素等。免疫系統(tǒng)在識別和清除病毒的過程中，若無法完全清除病毒，就會導(dǎo)致病毒在肝細胞中持續(xù)存在并不斷復(fù)制，進而造成肝臟損傷。病毒產(chǎn)生的一些蛋白質(zhì)也可能影響肝細胞的正常功能，引發(fā)肝臟損傷。同時，某些人天生具有的易感基因，可能會影響免疫系統(tǒng)對HBV的反應(yīng)，增加乙肝的發(fā)病風(fēng)險。長期的慢性炎癥會促使肝臟纖維化進展，進一步導(dǎo)致肝細胞再生和假小葉形成，最終發(fā)展至肝硬化，甚至肝癌。2.2小鼠模型在醫(yī)學(xué)研究中的優(yōu)勢在醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，小鼠模型憑借其多方面的獨特優(yōu)勢，成為科研工作者不可或缺的工具，在乙型肝炎病毒（HBV）研究中也具有重要意義。從遺傳背景角度來看，小鼠具有高度可控性和多樣性。目前，已經(jīng)培育出多種近交系、遠交群和轉(zhuǎn)基因小鼠品系。近交系小鼠，如C57BL/6、BALB/c等，其基因純合度極高，個體之間遺傳背景幾乎完全一致。這使得在實驗中，因遺傳因素導(dǎo)致的個體差異被降至最低，實驗結(jié)果的重復(fù)性和可靠性大大提高?？蒲腥藛T可以準確地研究特定基因在HBV感染過程中的作用，排除遺傳背景干擾。轉(zhuǎn)基因小鼠品系則為研究HBV相關(guān)基因的功能提供了有力手段。通過將HBV的相關(guān)基因?qū)胄∈蠡蚪M，可構(gòu)建出能表達HBV蛋白的小鼠模型，用于研究HBV蛋白對小鼠肝臟生理功能和病理變化的影響。例如，HBV轉(zhuǎn)基因小鼠能夠穩(wěn)定表達HBsAg、HBeAg等抗原，為研究機體對這些抗原的免疫應(yīng)答機制提供了良好的模型。小鼠的繁殖周期短也是其顯著優(yōu)勢之一。小鼠性成熟早，一般6-8周齡即可達到性成熟，妊娠期短，約為19-21天，每胎產(chǎn)仔數(shù)較多，可達6-12只。這使得在短時間內(nèi)能夠獲得大量具有相同遺傳背景的實驗小鼠，滿足大規(guī)模實驗的需求。在HBV研究中，科研人員可以快速繁殖構(gòu)建好的HBV感染小鼠模型，進行藥物篩選、療效評估等實驗，大大縮短了研究周期。例如，在評估一種新型抗HBV藥物的療效時，可以利用小鼠繁殖快的特點，在短時間內(nèi)獲得足夠數(shù)量的實驗小鼠，分組進行藥物干預(yù)實驗，快速觀察藥物對HBV感染小鼠的治療效果。成本低是小鼠作為實驗?zāi)Ｐ偷挠忠煌怀鰞?yōu)勢。與其他大型實驗動物相比，小鼠的飼養(yǎng)成本、實驗操作成本等都相對較低。小鼠體型小，所需的飼養(yǎng)空間小，飼料消耗少。在實驗操作方面，小鼠的采血、給藥等操作相對簡便，不需要復(fù)雜的設(shè)備和技術(shù)。這使得科研機構(gòu)和實驗室能夠在有限的經(jīng)費條件下，開展大量的實驗研究。在HBV研究中，較低的實驗成本使得更多的科研人員能夠參與到相關(guān)研究中，促進研究的廣泛開展。例如，一些小型科研團隊可以利用有限的資金，飼養(yǎng)足夠數(shù)量的小鼠進行HBV感染機制的初步探索研究。此外，小鼠與人類在生理和病理方面具有一定的相似性。雖然小鼠和人類在體型、壽命等方面存在差異，但在許多基本的生理過程和疾病發(fā)生機制上具有相似之處。在肝臟生理功能方面，小鼠的肝臟同樣承擔(dān)著物質(zhì)代謝、解毒等重要功能，其肝細胞的結(jié)構(gòu)和功能與人類肝細胞有一定的相似性。在HBV感染相關(guān)的病理過程中，小鼠模型也能在一定程度上模擬人類的疾病表現(xiàn)。通過構(gòu)建合適的小鼠模型，可以研究HBV感染引起的肝臟炎癥、纖維化等病理變化，為理解人類乙肝的發(fā)病機制提供參考。例如，在人源化肝臟嵌合小鼠模型中，移植的人肝細胞能夠支持HBV的感染和復(fù)制，小鼠會出現(xiàn)類似人類乙肝患者的肝臟病理改變，如肝細胞損傷、炎癥細胞浸潤等。三、乙型肝炎病毒感染小鼠模型構(gòu)建方法3.1轉(zhuǎn)基因小鼠模型轉(zhuǎn)基因小鼠模型是通過將HBV的相關(guān)基因?qū)胄∈蠡蚪M中，使其能夠表達HBV蛋白，從而模擬HBV感染的某些特征。這種模型在研究HBV的基因表達、復(fù)制機制以及病毒與宿主相互作用等方面具有重要價值。下面將介紹兩種常見的轉(zhuǎn)基因小鼠模型構(gòu)建方法及其應(yīng)用。3.1.1末端冗余的1.3HBV-DNA轉(zhuǎn)基因小鼠末端冗余的1.3HBV-DNA轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建原理基于分子生物學(xué)中的基因重組和轉(zhuǎn)基因技術(shù)。HBV基因組具有獨特的結(jié)構(gòu)，在構(gòu)建過程中，科研人員選取含有末端冗余的1.3倍HBV基因組DNA片段。這一特定的DNA片段包含了HBV完整的開放閱讀框（ORF），能夠編碼HBV病毒復(fù)制和組裝所需的各種蛋白質(zhì)，如HBsAg、HBeAg、HBcAg以及病毒聚合酶等。通過顯微注射技術(shù)，將精心處理后的這一DNA片段直接注入小鼠受精卵的原核內(nèi)。受精卵在合適的體外培養(yǎng)條件下發(fā)育至桑葚胚或囊胚階段后，移植到假孕母鼠的輸卵管或子宮內(nèi)。隨著胚胎的生長發(fā)育，整合了外源HBV-DNA的小鼠逐漸誕生。這些小鼠的基因組中穩(wěn)定地整合了末端冗余的1.3HBV-DNA，使其具備了表達HBV相關(guān)蛋白和產(chǎn)生病毒顆粒的能力。這種模型在HBV研究中具有重要的應(yīng)用價值。在病毒顆粒產(chǎn)生方面，該轉(zhuǎn)基因小鼠能夠高水平地產(chǎn)生病毒顆粒。通過對小鼠肝臟組織和血清的檢測分析，發(fā)現(xiàn)其病毒顆粒的產(chǎn)生水平與自然感染HBV的情況具有一定的相似性。研究表明，這些小鼠血清中可檢測到高濃度的HBsAg、HBeAg以及完整的病毒顆粒。對小鼠肝臟組織進行電鏡觀察，能夠清晰地看到成熟的病毒粒子形態(tài)，包括具有雙層結(jié)構(gòu)的Dane顆粒以及小球形顆粒和管形顆粒。這些病毒顆粒的產(chǎn)生為進一步研究HBV的組裝、釋放機制提供了良好的實驗材料。在感染性驗證方面，將轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生的病毒接種于黑猩猩體內(nèi)證實其有感染性。黑猩猩作為與人類親緣關(guān)系較近的靈長類動物，具有與人類相似的HBV感染易感性和免疫反應(yīng)機制。當(dāng)將轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生的病毒接種到黑猩猩體內(nèi)后，黑猩猩出現(xiàn)了類似于人類急性乙肝感染的癥狀和免疫反應(yīng)。血清學(xué)檢測顯示，黑猩猩血清中HBsAg、HBeAg等指標(biāo)呈陽性，肝臟組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)肝細胞出現(xiàn)炎癥、壞死等病理改變。這一實驗結(jié)果有力地證明了末端冗余的1.3HBV-DNA轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生的病毒具有感染性，為研究HBV的感染過程和致病機制提供了重要的實驗依據(jù)。3.1.2重癥聯(lián)合免疫缺陷轉(zhuǎn)基因小鼠重癥聯(lián)合免疫缺陷（Severecombinedimmunodeficiency，SCID）小鼠是一種具有嚴重免疫缺陷的小鼠品系，其T細胞和B細胞的發(fā)育存在障礙，幾乎完全喪失了細胞免疫和體液免疫功能。在構(gòu)建重癥聯(lián)合免疫缺陷轉(zhuǎn)基因小鼠時，首先選取SCID小鼠作為受體。然后，通過基因工程技術(shù)將HBV的相關(guān)基因?qū)隨CID小鼠的基因組中。常用的方法包括利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體或轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)等將HBV基因?qū)胄∈笈咛ジ杉毎‥S細胞），再通過胚胎嵌合技術(shù)將修飾后的ES細胞注入SCID小鼠的囊胚中，使其發(fā)育為含有HBV基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。也可以直接將HBV基因通過顯微注射等方法導(dǎo)入SCID小鼠的受精卵中，培育出轉(zhuǎn)基因小鼠。這種小鼠模型在HBV研究中發(fā)揮著獨特的作用。在病毒復(fù)制和表達方面，由于SCID小鼠的免疫缺陷狀態(tài)，其對HBV的免疫清除能力極弱，使得病毒能夠在小鼠體內(nèi)持續(xù)復(fù)制和表達。研究發(fā)現(xiàn)，在這種轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟組織中，能夠檢測到高水平的HBVDNA和各種HBV抗原，如HBsAg、HBeAg、HBcAg等。通過實時定量PCR技術(shù)對肝臟組織中的HBVDNA進行定量分析，發(fā)現(xiàn)其拷貝數(shù)在感染后的較長時間內(nèi)保持較高水平。免疫組化和免疫熒光實驗也顯示，肝細胞中廣泛表達HBV抗原，表明病毒在肝臟中持續(xù)活躍地復(fù)制和表達。在疾病發(fā)展研究方面，當(dāng)在過繼同系小鼠的脾細胞后，可觀察到肝臟及血清中病毒被清除，并發(fā)展為慢性肝炎。同系小鼠的脾細胞中含有免疫活性細胞，如T淋巴細胞、B淋巴細胞等。將其過繼到重癥聯(lián)合免疫缺陷轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)后，這些免疫細胞能夠識別并攻擊HBV感染的肝細胞，從而導(dǎo)致肝臟及血清中的病毒被清除。在這個過程中，小鼠的肝臟會出現(xiàn)一系列的病理變化，逐漸發(fā)展為慢性肝炎。肝臟組織病理學(xué)檢查顯示，肝細胞出現(xiàn)炎癥細胞浸潤、氣球樣變、壞死以及纖維化等典型的慢性肝炎病理特征。通過對肝臟組織中炎癥因子、纖維化相關(guān)指標(biāo)的檢測分析，進一步揭示了慢性肝炎的發(fā)展機制。這種模型為研究HBV感染后的免疫應(yīng)答過程、慢性肝炎的發(fā)病機制以及抗病毒治療提供了重要的研究平臺。3.2人源化小鼠模型人源化小鼠模型是通過將人源細胞或組織移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，使其能夠支持HBV的感染和復(fù)制，從而更真實地模擬人類HBV感染的過程。這類模型在研究HBV的感染機制、宿主免疫應(yīng)答以及藥物研發(fā)等方面具有重要價值。下面將介紹兩種常見的人源化小鼠模型。3.2.1Trimera小鼠模型Trimera小鼠模型的構(gòu)建是一項復(fù)雜且精細的實驗操作，其原理基于對小鼠免疫系統(tǒng)的改造以及人肝組織的移植。首先，選擇BALB/c小鼠作為基礎(chǔ)實驗動物。利用射線輻射處理技術(shù)，對BALB/c小鼠進行全身照射。射線輻射能夠破壞小鼠自身的免疫系統(tǒng)，使其免疫功能受到抑制，為后續(xù)的細胞和組織移植創(chuàng)造條件。通常使用的射線源包括X射線或γ射線，照射劑量和時間需嚴格控制，以確保小鼠免疫系統(tǒng)被有效破壞，同時又能維持小鼠的基本生命體征。在射線輻射處理后，將SCID/NOD小鼠的骨髓細胞注射到BALB/c小鼠體內(nèi)。SCID/NOD小鼠具有嚴重的聯(lián)合免疫缺陷，其T細胞、B細胞和自然殺傷細胞的功能均存在缺陷。通過注射SCID/NOD小鼠的骨髓細胞，能夠在一定程度上重建BALB/c小鼠的免疫系統(tǒng)，但這種重建后的免疫系統(tǒng)仍存在諸多缺陷，對移植的外源組織的免疫排斥反應(yīng)較弱。骨髓細胞的注射過程需要嚴格遵循無菌操作原則，通過尾靜脈或其他合適的途徑將骨髓細胞緩慢注入小鼠體內(nèi)。隨后，在腎被膜下植入外源性HBV感染的人肝活體組織。這一步驟是構(gòu)建Trimera小鼠模型的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。人肝活體組織的獲取需要嚴格的倫理審批和規(guī)范的操作流程，通常從手術(shù)切除的肝臟組織中選取健康且未被其他病原體污染的部分。在植入前，需對人肝活體組織進行處理，切成合適大小的組織塊，并進行HBV感染處理。感染過程可通過將組織塊與含有高滴度HBV的血清或病毒液孵育來實現(xiàn)。然后，在無菌條件下，通過手術(shù)將感染HBV的人肝活體組織小心地植入BALB/c小鼠的腎被膜下。手術(shù)過程需精細操作，避免對小鼠的腎臟和其他器官造成損傷。移植后，約1個月時，85％的小鼠可觀察到HBV感染。通過對小鼠血清和肝臟組織的檢測分析，可發(fā)現(xiàn)病毒血癥持續(xù)約20d。在血清學(xué)檢測中，能夠檢測到HBsAg、HBeAg等病毒標(biāo)志物的陽性表達。利用實時定量PCR技術(shù)對血清中的HBVDNA進行定量分析，可確定病毒血癥的程度和持續(xù)時間。對肝臟組織進行病理學(xué)檢查和免疫組化分析，可觀察到肝細胞內(nèi)存在HBV抗原的表達，以及肝細胞的損傷和炎癥反應(yīng)等病理改變。然而，該模型也存在一些局限性。移植到腎被膜下的人肝細胞存活較少，這可能是由于腎被膜下的微環(huán)境并非完全適合人肝細胞的生長和存活。人肝細胞維持活性的時間短，限制了對HBV感染長期過程的研究。建模過程相對復(fù)雜，涉及多個步驟和技術(shù)，對實驗人員的操作技能和實驗條件要求較高，這也在一定程度上限制了該模型的廣泛應(yīng)用。3.2.2NOD/SCID小鼠模型NOD/SCID小鼠模型的構(gòu)建過程同樣涉及多個關(guān)鍵步驟和技術(shù)，旨在創(chuàng)建一個能夠支持HBV感染和復(fù)制的小鼠模型。首先，選擇NOD/SCID小鼠作為宿主動物。NOD/SCID小鼠具有嚴重的免疫缺陷，其天然免疫和適應(yīng)性免疫功能均受到顯著抑制，這使得它們對移植的人源細胞和組織的免疫排斥反應(yīng)大大降低，為后續(xù)的肝細胞移植和HBV感染提供了有利條件。將原代人類肝細胞移植在NOD/SCID小鼠腎囊內(nèi)。原代人類肝細胞的獲取需要嚴格的倫理審批和規(guī)范的操作流程，通常從肝臟手術(shù)切除標(biāo)本或捐贈的肝臟中分離得到。在移植前，需對原代人類肝細胞進行培養(yǎng)和鑒定，確保其活性和功能正常。移植過程通過手術(shù)進行，在無菌條件下，小心地將原代人類肝細胞植入NOD/SCID小鼠的腎囊內(nèi)。手術(shù)操作需精細，避免對小鼠的腎臟和其他器官造成損傷，同時要確保肝細胞能夠在腎囊內(nèi)成功定植和存活。為了促進移植的人肝細胞生長，應(yīng)用c-Met激動性抗體。c-Met是肝細胞生長因子（HGF）的受體，c-Met激動性抗體能夠模擬HGF的作用，激活c-Met信號通路，從而促進肝細胞的增殖和存活。在移植肝細胞后，通過腹腔注射或其他合適的途徑給予c-Met激動性抗體。抗體的劑量和給藥時間需根據(jù)實驗設(shè)計和小鼠的反應(yīng)進行優(yōu)化，以確保能夠有效促進肝細胞的生長，同時避免不良反應(yīng)的發(fā)生。在肝細胞成功移植并生長后，接種HBV。HBV的接種可通過尾靜脈注射含有高滴度HBV的血清或病毒液來實現(xiàn)。接種后，通過對小鼠血清和肝臟組織的檢測分析，可觀察到高拷貝的HBV-DNA。利用實時定量PCR技術(shù)對血清和肝臟組織中的HBVDNA進行定量分析，能夠準確測定病毒的復(fù)制水平。免疫組化和免疫熒光實驗可用于檢測肝細胞內(nèi)HBV抗原的表達，以及觀察肝細胞的病理變化。該模型在HBV、HDV重疊感染研究中具有重要價值。當(dāng)對感染HBV的小鼠注射來自黑猩猩的HDV陽性血清后，小鼠血清可檢測到HDV-RNA并且保持至少4周。這為研究HDV的生命周期以及HBV、HDV重疊感染的機制提供了可能。通過對小鼠血清和肝臟組織中HDV相關(guān)標(biāo)志物的檢測，如HDVRNA、HDV抗原等，結(jié)合HBV的檢測結(jié)果，能夠深入研究兩種病毒在小鼠體內(nèi)的相互作用、復(fù)制過程以及對肝臟病理的影響。該模型也為開發(fā)針對HBV、HDV重疊感染的治療方法提供了重要的實驗平臺，有助于篩選和評價潛在的治療藥物和治療策略。3.3移植人肝組織的小鼠模型（以HBV三聚體小鼠模型為例）以HBV三聚體小鼠模型為代表的移植人肝組織小鼠模型，為乙型肝炎病毒（HBV）研究開辟了新路徑，其構(gòu)建過程蘊含著精妙的生物學(xué)原理與復(fù)雜的實驗操作。首先，選用BALB/c小鼠作為基礎(chǔ)實驗對象。對BALB/c小鼠進行全身致命性照射是關(guān)鍵的起始步驟。這一操作通常借助高能量射線，如X射線或γ射線來實現(xiàn)。射線的能量和照射劑量需經(jīng)過精確計算和嚴格控制，目的是徹底破壞小鼠自身的免疫系統(tǒng)。在這個過程中，射線會作用于小鼠體內(nèi)的免疫細胞，包括T淋巴細胞、B淋巴細胞以及其他參與免疫反應(yīng)的細胞，使其失去正常的免疫功能。這種免疫清除為后續(xù)的免疫重構(gòu)和人肝細胞移植創(chuàng)造了必要條件，避免小鼠自身免疫系統(tǒng)對移植的外源細胞產(chǎn)生排斥反應(yīng)。完成全身致命性照射后，緊接著用SCID小鼠骨髓細胞進行免疫重構(gòu)。SCID小鼠的骨髓細胞中含有多種造血干細胞和祖細胞。這些細胞具有分化和發(fā)育成各種免疫細胞的潛能。將SCID小鼠骨髓細胞通過合適的途徑，如尾靜脈注射或骨髓移植等方式，引入經(jīng)過照射的BALB/c小鼠體內(nèi)。在小鼠體內(nèi)的微環(huán)境中，這些骨髓細胞會逐漸分化和發(fā)育，重新構(gòu)建起小鼠的免疫系統(tǒng)。由于SCID小鼠本身存在嚴重的免疫缺陷，其骨髓細胞發(fā)育而來的免疫系統(tǒng)也相對不完善，對移植的人肝細胞的免疫耐受性較好。最后，將已經(jīng)感染了HBV的人肝細胞移植到鼠肝內(nèi)。人肝細胞的獲取需要嚴格遵循倫理規(guī)范和操作流程，通常從肝臟手術(shù)切除標(biāo)本或捐贈的肝臟中分離得到。在感染HBV時，可將人肝細胞與含有高滴度HBV的血清或病毒液在適宜的條件下進行孵育，使HBV能夠感染人肝細胞。然后，通過精細的手術(shù)操作，將感染HBV的人肝細胞移植到經(jīng)過免疫重構(gòu)的BALB/c小鼠肝臟內(nèi)。手術(shù)過程中，需要確保肝細胞能夠準確地植入肝臟，并在肝臟內(nèi)成功定植和存活。在成功構(gòu)建模型后，大約80％的鼠會出現(xiàn)病毒血癥。通過對小鼠血清的檢測分析，利用實時定量PCR技術(shù)可以檢測到HBVDNA的存在，從而確定病毒血癥的發(fā)生。然而，該模型存在一些局限性。血漿中病毒滴度比較低，這可能是由于移植的人肝細胞數(shù)量有限，或者小鼠體內(nèi)的微環(huán)境對病毒復(fù)制存在一定的限制。病毒血癥維持時間僅20d，這限制了對病毒長期感染過程的研究。不過，盡管存在這些不足，在短期觀察抗病毒的療效方面，該模型仍是可行的?？梢栽诓《狙Y發(fā)生的這20天內(nèi)，對小鼠進行抗病毒藥物的干預(yù)實驗。通過檢測小鼠血清中的HBVDNA水平、病毒抗原表達以及肝臟組織的病理變化等指標(biāo)，評估抗病毒藥物的療效。3.4水動力學(xué)法構(gòu)建急性感染模型水動力學(xué)法構(gòu)建急性感染模型的原理基于流體動力學(xué)原理和基因轉(zhuǎn)染技術(shù)。當(dāng)向小鼠尾靜脈快速、高負荷地注射含完整HBV基因組的1.5倍真核表達質(zhì)粒（pHBV1.5）時，由于注射速度快、劑量大，大量的質(zhì)粒溶液在短時間內(nèi)進入小鼠血液循環(huán)系統(tǒng)。這種高濃度的質(zhì)粒溶液在血管內(nèi)形成了一個高壓力的流體環(huán)境，使得質(zhì)粒能夠突破血管內(nèi)皮細胞的屏障，迅速進入肝臟組織。在肝臟細胞內(nèi)，質(zhì)粒利用細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯機制，表達HBV的各種基因，從而實現(xiàn)HBV在小鼠體內(nèi)的感染和復(fù)制。以向小鼠尾靜脈注射含完整HBV基因組的1.5倍真核表達質(zhì)粒（pHBV1.5）為例，具體的造模方法如下。首先，準備健康的BALB/c小鼠，體重一般在18-22g之間，實驗前需適應(yīng)性飼養(yǎng)3-5天，以確保小鼠狀態(tài)穩(wěn)定。然后，將pHBV1.5質(zhì)粒用無菌生理鹽水稀釋至合適的濃度，一般為1-2μg/μl。在注射過程中，使用1ml注射器連接27G針頭，將小鼠固定在操作臺上，使其尾部伸直。用酒精棉球擦拭小鼠尾靜脈，使其血管擴張，便于注射。以較快的速度（一般在5-8秒內(nèi)）將1-2ml的質(zhì)粒溶液經(jīng)尾靜脈注入小鼠體內(nèi)。注射后，將小鼠放回飼養(yǎng)籠，觀察其狀態(tài)。這種模型具有獨特的特點。從病毒表達和復(fù)制方面來看，注射后第6天，可通過MEIA檢測血清HBsAg、HBeAg的水平，此時可發(fā)現(xiàn)pHBV1.5注射組小鼠血清HBsAg、HBeAg為陽性；通過RT-PCR檢測肝組織HBVprec/cmRNA轉(zhuǎn)錄的水平，可觀察到肝組織表達HBeAg。這表明HBV基因能夠在小鼠體內(nèi)成功表達和復(fù)制。在模擬人類感染方面，該模型在一定程度上克服了由于HBV宿主范圍極窄給人們研究帶來的極大限制，其病毒表達和免疫應(yīng)答模式與人類的HBV急性感染類似，為研究HBV急性感染的發(fā)病機制和免疫應(yīng)答過程提供了有效的工具。在應(yīng)用該模型時，也有一些注意事項。必須嚴格按照規(guī)定的方法，向尾靜脈快速、高負荷地注射含1.5倍的HBV真核表達質(zhì)粒進行造模。注射速度和劑量的控制非常關(guān)鍵，如果注射速度過慢或劑量不足，可能導(dǎo)致質(zhì)粒無法有效進入肝臟組織，從而無法成功建立模型。在實驗過程中，要密切觀察小鼠的狀態(tài)，避免小鼠因注射操作而出現(xiàn)意外死亡或其他不良反應(yīng)。在實驗結(jié)束后，對小鼠的處理也需遵循動物實驗倫理規(guī)范，確保動物的福利。3.5腺相關(guān)病毒載體介導(dǎo)的慢性肝炎模型腺相關(guān)病毒（AAV）載體介導(dǎo)的慢性肝炎模型的構(gòu)建是基于AAV獨特的生物學(xué)特性和基因遞送能力。AAV是一種非致病性的單鏈DNA病毒，具有良好的穩(wěn)定性和低免疫原性，能夠?qū)⑼庠椿蚋咝нf送至靶細胞。在構(gòu)建該模型時，首先需要構(gòu)建重組AAV載體。科研人員通過基因工程技術(shù)，將復(fù)制缺陷的線性乙肝病毒（HBV）基因組插入到AAV載體中。這種線性HBV基因組雖然存在復(fù)制缺陷，但在進入小鼠肝臟細胞后，能夠通過宿主細胞的相關(guān)機制進行修復(fù)和轉(zhuǎn)化。將構(gòu)建好的AAV-HBV載體通過尾靜脈注射等方式遞送入小鼠肝臟。尾靜脈注射是一種常用的給藥途徑，能夠使載體迅速進入血液循環(huán)系統(tǒng)，并隨血流到達肝臟組織。進入肝臟細胞后，AAV載體將線性HBV基因組釋放到細胞核內(nèi)。在細胞核中，線性HBV基因組會通過宿主細胞的ATR（Ataxia-TelangiectasiaandRad3-relatedprotein）介導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)途徑進行修復(fù)。在這個過程中，線性HBV基因組的兩端會發(fā)生連接，從而形成共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）。cccDNA是HBV復(fù)制的關(guān)鍵模板，它能夠穩(wěn)定地存在于肝細胞核中，持續(xù)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生HBV的各種RNA，進而翻譯出HBV的蛋白質(zhì)，如HBsAg、HBeAg、HBcAg等。這些蛋白質(zhì)參與病毒粒子的組裝和釋放，使得病毒能夠在小鼠體內(nèi)持續(xù)復(fù)制，從而建立起慢性肝炎模型。在細胞實驗中，將該載體轉(zhuǎn)染進Huh7細胞中可以在細胞培養(yǎng)上清中檢測到正常表達的HBeAg，但未能檢測到HBsAg和新產(chǎn)生的病毒粒子。然而，將該載體進行病毒包裝后分別感染HepG2和AML12細胞不僅能在細胞培養(yǎng)上清中檢測到HBeAg、HBsAg和新產(chǎn)生的病毒粒子，還能在細胞核中檢測到形成的cccDNA。這表明該載體在不同細胞系中的感染和復(fù)制能力存在差異，且在特定細胞系中能夠成功形成cccDNA。動物實驗結(jié)果表明，通過尾靜脈給小鼠注射AAV-HBV1.04病毒后可以在小鼠血清中檢測到病毒抗原表達和病毒粒子且長期存在，在其肝細胞中可以檢測到HBVcccDNA的形成并長期存在。這表明該系統(tǒng)在小鼠肝細胞中可以支持HBVcccDNA的形成。研究人員使用多種經(jīng)典的cccDNA鑒定方法（T5外切酶消化，85℃熱處理/+EcoRI和PCR）對cccDNA進行了鑒定，并通過ChIP實驗驗證了該cccDNA的染色質(zhì)化和轉(zhuǎn)錄激活功能與自然感染形成的cccDNA相同。這一系列實驗充分證明了該模型中cccDNA的真實性和功能性。該模型在抗病毒藥物評價中具有重要應(yīng)用價值。研究人員使用抗病毒藥物進行了驗證，結(jié)果顯示，恩替卡韋（ETV）可以顯著抑制小鼠血清中和肝細胞中的HBVDNA水平，且不影響血清中抗原和肝細胞中cccDNA水平。Poly(I:C)可以顯著抑制血清中抗原水平、肝細胞中的蛋白表達水平和HBVDNA水平。這表明該AAV-HBV1.04小鼠模型適用于抗病毒藥物的評價。通過在該模型上進行藥物實驗，可以觀察藥物對HBV復(fù)制、抗原表達以及cccDNA水平的影響，從而評估藥物的療效和作用機制，為抗病毒藥物的研發(fā)和篩選提供重要的實驗依據(jù)。四、模型評估與檢測指標(biāo)4.1血清學(xué)指標(biāo)檢測血清學(xué)指標(biāo)檢測在評估乙型肝炎病毒（HBV）感染小鼠模型的感染狀態(tài)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其中血清HBsAg、HBeAg水平的檢測尤為重要，常采用微粒子酶免疫分析法（MEIA）進行檢測。MEIA檢測血清HBsAg、HBeAg水平的過程較為復(fù)雜且精細。以檢測HBsAg為例，首先將待檢測的小鼠血清樣本加入到已包被有抗HBsAg抗體的反應(yīng)杯中。血清中的HBsAg會與包被抗體特異性結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物。隨后，加入帶有堿性磷酸酶標(biāo)記的抗HBsAg抗體。這種標(biāo)記抗體能夠與已結(jié)合在包被抗體上的HBsAg進一步結(jié)合，形成雙抗體夾心結(jié)構(gòu)。經(jīng)過洗滌步驟，去除未結(jié)合的物質(zhì)。然后，加入化學(xué)發(fā)光底物，如4-甲基傘形酮磷酸鹽（4-MUP）。在堿性磷酸酶的催化作用下，4-MUP被水解，產(chǎn)生具有熒光的4-甲基傘形酮。通過檢測熒光強度，利用標(biāo)準曲線即可定量分析出血清中HBsAg的含量。檢測HBeAg的原理與之類似，同樣是基于抗原-抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)，通過標(biāo)記抗體和化學(xué)發(fā)光底物的作用，實現(xiàn)對HBeAg水平的定量檢測。這些指標(biāo)對于判斷模型的感染狀態(tài)具有重要意義。HBsAg是乙肝病毒的外殼蛋白，其本身不具有傳染性，但它的存在常被視為HBV感染的重要標(biāo)志。在小鼠模型中，若血清檢測到HBsAg陽性，表明小鼠已被HBV感染，且病毒在體內(nèi)進行了一定程度的復(fù)制和表達。HBsAg水平的高低還能在一定程度上反映病毒的復(fù)制活躍程度。較高水平的HBsAg通常意味著病毒在體內(nèi)大量復(fù)制，感染處于較為活躍的階段。HBeAg是一種可溶性蛋白抗原，是HBV活動性復(fù)制和具有傳染性的重要標(biāo)志。在小鼠模型中，檢測到HBeAg陽性，進一步證實了HBV在小鼠體內(nèi)的活躍復(fù)制，且提示病毒具有較強的傳染性。同時，HBeAg水平的變化也與疾病的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。在感染初期，HBeAg水平可能迅速升高，隨著感染的進展，若機體的免疫系統(tǒng)能夠有效應(yīng)對，HBeAg水平可能逐漸下降。因此，動態(tài)監(jiān)測HBeAg水平，有助于了解HBV在小鼠體內(nèi)的感染進程和機體的免疫應(yīng)答情況。綜合檢測血清HBsAg、HBeAg水平，能夠全面、準確地評估小鼠模型的HBV感染狀態(tài)，為后續(xù)研究HBV的致病機制、藥物療效評估等提供重要的實驗依據(jù)。4.2基因轉(zhuǎn)錄水平檢測RT-PCR（逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)）是檢測肝組織HBVprec/cmRNA轉(zhuǎn)錄水平的常用技術(shù)，其原理基于RNA的逆轉(zhuǎn)錄和DNA的聚合酶鏈式反應(yīng)。在HBV感染的小鼠肝組織中，HBVprec/c基因會轉(zhuǎn)錄生成相應(yīng)的mRNA。RT-PCR技術(shù)首先利用逆轉(zhuǎn)錄酶，以mRNA為模板合成互補DNA（cDNA）。這一過程中，逆轉(zhuǎn)錄酶以mRNA為模板，按照堿基互補配對原則，將脫氧核苷酸連接成cDNA鏈。然后，以合成的cDNA為模板，在DNA聚合酶的作用下，通過引物的引導(dǎo)，進行PCR擴增。引物是根據(jù)HBVprec/c基因的特定序列設(shè)計的，能夠特異性地結(jié)合到cDNA上，啟動DNA聚合酶的擴增反應(yīng)。在PCR擴增過程中，經(jīng)過多次變性、退火和延伸循環(huán)，使目標(biāo)cDNA片段得以大量擴增。通過對擴增產(chǎn)物的檢測和分析，就可以間接反映肝組織中HBVprec/cmRNA的轉(zhuǎn)錄水平。具體步驟如下：首先進行肝組織RNA的提取。取新鮮的小鼠肝組織，迅速放入液氮中冷凍保存，以防止RNA降解。實驗時，將肝組織從液氮中取出，放入含有RNA提取試劑（如Trizol試劑）的勻漿器中，在冰上充分研磨，使組織細胞破碎，釋放出RNA。然后按照RNA提取試劑的操作說明，進行兩相分離、RNA沉淀、清洗和干燥等步驟，最終獲得純凈的RNA。提取的RNA保存于-80℃冰箱備用。接著進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中，加入提取的RNA、逆轉(zhuǎn)錄酶、引物（隨機引物或寡聚dT引物）、dNTPs以及逆轉(zhuǎn)錄緩沖液等。引物能夠與RNA結(jié)合，為逆轉(zhuǎn)錄酶提供起始合成cDNA的位點。逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板，將dNTPs連接成cDNA鏈。反應(yīng)條件通常為37℃孵育60分鐘，然后85℃加熱5分鐘使逆轉(zhuǎn)錄酶失活。反應(yīng)結(jié)束后，得到的cDNA可用于后續(xù)的PCR擴增。最后進行PCR擴增。在PCR反應(yīng)體系中，加入逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到的cDNA、DNA聚合酶、引物（針對HBVprec/c基因設(shè)計的特異性引物）、dNTPs以及PCR緩沖液等。特異性引物能夠特異性地結(jié)合到cDNA上的HBVprec/c基因區(qū)域，啟動DNA聚合酶的擴增反應(yīng)。PCR擴增的條件一般為95℃預(yù)變性5分鐘，然后進行35-40個循環(huán)的95℃變性30秒、55-60℃退火30秒、72℃延伸30-60秒，最后72℃延伸5-10分鐘。擴增結(jié)束后，通過瓊脂糖凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行檢測。將擴增產(chǎn)物與DNA分子量標(biāo)準一起加入到瓊脂糖凝膠的加樣孔中，在電場的作用下，DNA片段會在凝膠中遷移。由于不同大小的DNA片段在凝膠中的遷移速度不同，經(jīng)過電泳后，會在凝膠上形成不同位置的條帶。在紫外燈下觀察凝膠，若出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的條帶，則表明擴增成功，且條帶的亮度與HBVprec/cmRNA的轉(zhuǎn)錄水平呈正相關(guān)。RT-PCR檢測肝組織HBVprec/cmRNA轉(zhuǎn)錄水平在評估病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄活性方面具有重要作用。HBVprec/cmRNA的轉(zhuǎn)錄水平直接反映了病毒在肝組織中的轉(zhuǎn)錄活性。較高的轉(zhuǎn)錄水平意味著病毒的轉(zhuǎn)錄過程活躍，有更多的mRNA被合成，進而可能會翻譯出更多的病毒蛋白，促進病毒的復(fù)制和組裝。通過檢測HBVprec/cmRNA的轉(zhuǎn)錄水平，可以及時了解病毒在小鼠體內(nèi)的復(fù)制狀態(tài)。在研究抗病毒藥物的療效時，若藥物能夠抑制病毒的復(fù)制，那么通常會觀察到HBVprec/cmRNA轉(zhuǎn)錄水平的下降。動態(tài)監(jiān)測轉(zhuǎn)錄水平的變化，還可以分析病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄活性隨時間的變化趨勢，為研究HBV的感染機制和疾病發(fā)展過程提供重要依據(jù)。4.3cccDNA檢測與鑒定cccDNA是乙肝病毒復(fù)制的關(guān)鍵模板，在乙肝病毒感染小鼠模型的研究中，對其進行準確檢測與鑒定至關(guān)重要。目前，有多種經(jīng)典的cccDNA鑒定方法被廣泛應(yīng)用。Southernblot是cccDNA檢測公認較為準確的方法之一，其原理基于核酸分子凝膠電泳遷移率差異。在實驗過程中，首先提取小鼠肝臟組織中的核酸，然后通過凝膠電泳將不同形式的HBV核酸，如松弛環(huán)狀DNA（rcDNA）、線性雙鏈DNA（lineardsDNA）和cccDNA進行分離。由于不同形式的核酸在凝膠中的遷移率不同，cccDNA因其超螺旋結(jié)構(gòu)在凝膠中遷移速度與其他形式核酸存在差異，從而能夠被區(qū)分出來。之后，將凝膠中的核酸轉(zhuǎn)移到固相支持物（如尼龍膜）上，再用特異性的探針與目標(biāo)cccDNA進行雜交。通過放射自顯影或化學(xué)發(fā)光等檢測手段，可檢測出cccDNA的存在及含量。該方法檢測結(jié)果準確可靠，能夠直觀地區(qū)分不同形式的HBV核酸，為cccDNA的鑒定提供了有力的證據(jù)。然而，其分析靈敏度較低，對于低含量的cccDNA檢測效果不佳。操作過程復(fù)雜，需要進行核酸提取、電泳、轉(zhuǎn)膜、雜交等多個步驟，耗時較長，對實驗技術(shù)要求較高，這在一定程度上限制了其在高通量藥物篩選和臨床實踐中的應(yīng)用。基于核酸擴增的方法，如選擇性qPCR，在cccDNA檢測中也具有重要地位。其準確檢測的核心問題是要避免其他形式的HBVDNA（尤其是rcDNA）的干擾。在檢測cccDNA時，研究人員通過設(shè)計特異性的引物和探針，利用PCR技術(shù)對cccDNA進行擴增和定量分析。引物和探針的設(shè)計針對cccDNA的特定序列，使其能夠特異性地與cccDNA結(jié)合，而不與其他形式的HBVDNA發(fā)生反應(yīng)。通過優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，如退火溫度、引物濃度等，可提高檢測的特異性和靈敏度。與Southernblot相比，選擇性qPCR具有更高的靈敏度，能夠檢測到低含量的cccDNA。操作相對簡便，可實現(xiàn)高通量檢測，適用于大規(guī)模的樣本分析。臨床上目前最為常見的檢測cccDNA的方法就是通過肝臟穿刺后采用選擇性qPCR來檢測cccDNA拷貝數(shù)。微滴-數(shù)字PCR（droplet-digitalPCR，ddPCR）系統(tǒng)是近年來發(fā)展起來并用于cccDNA檢測的新技術(shù)。該方法通過將樣本制備成數(shù)以萬計的液滴，每個液滴獨立進行PCR反應(yīng)。在反應(yīng)過程中，含有可探測熒光信號的目標(biāo)序列（即cccDNA）的液滴被標(biāo)記為陽性事件，如果液滴反應(yīng)中沒有信號，則記錄陰性事件。分析結(jié)果包含了數(shù)千乃至上萬個反應(yīng)，構(gòu)成一個泊松分布，隨后計算陽性和陰性微滴的數(shù)量，從而以數(shù)字格式對cccDNA進行定量分析。2018年，Huang等人采用基于探針的ddPCR方法實現(xiàn)了慢乙肝患者血清、單細胞和組織樣本中cccDNA的檢測，且靈敏度和特異性均有出色表現(xiàn)，大大提升了cccDNA的檢測下限。該方法能夠?qū)崿F(xiàn)對cccDNA的絕對定量，無需標(biāo)準曲線，避免了傳統(tǒng)定量PCR中因標(biāo)準曲線不準確帶來的誤差。對低豐度的cccDNA檢測具有優(yōu)勢，能夠檢測到極低含量的cccDNA，為乙肝病毒感染的早期診斷和病情監(jiān)測提供了更精準的手段。滾環(huán)擴增PCR也是一種特殊的用于cccDNA檢測的方法。由于cccDNA在HBVDNA中所占的比例很小，傳統(tǒng)檢測方法可能難以準確檢測。Zhong等人設(shè)計了滾環(huán)擴增（RCA）與實時PCR相結(jié)合的方法。該研究利用Phi29DNA聚合酶設(shè)計了4組針對多個結(jié)合位點的RCA引物。Phi29DNA聚合酶在RCA中能夠選擇性地擴增環(huán)狀模板分子，即cccDNA。這一步驟的加入顯著提高了HBVcccDNA檢測的敏感性，獲得了更高效的擴增效果。通過RCA對cccDNA進行預(yù)擴增，可增加cccDNA的含量，再結(jié)合實時PCR進行定量分析，能夠更準確地檢測cccDNA。該方法還將經(jīng)典方法中忽略的整合HBVDNA的影響降到最低，提高了檢測的準確性。在驗證cccDNA的染色質(zhì)化和轉(zhuǎn)錄激活功能方面，ChIP實驗發(fā)揮著重要作用。染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實驗基于特異性抗體識別目標(biāo)蛋白與DNA形成的復(fù)合物原理。首先，使用甲醛等交聯(lián)劑固定小鼠肝臟細胞內(nèi)的蛋白-DNA相互作用，保持其在細胞裂解和染色質(zhì)碎裂過程中的結(jié)合狀態(tài)。然后將染色質(zhì)碎裂成適當(dāng)大小的片段，一般通過超聲波將染色質(zhì)碎裂到200-500bp的理想片段大小，超聲條件需精確控制，以保證DNA片段大小分布的一致性。接著，通過特異性抗體結(jié)合目標(biāo)蛋白（如與cccDNA結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子等）-DNA復(fù)合物，并利用磁珠或蛋白A/G柱吸附抗體-蛋白-DNA復(fù)合物。經(jīng)過一系列洗滌步驟去除非特異性結(jié)合或未結(jié)合的成分。最后，解除交聯(lián)并提取純化的DNA，通過qPCR等方法分析目標(biāo)序列（即cccDNA相關(guān)序列）的富集情況。如果在ChIP實驗中檢測到與cccDNA相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子等蛋白與特定DNA序列（如cccDNA的啟動子區(qū)域）結(jié)合，且結(jié)合后的DNA序列能夠通過qPCR檢測到明顯的富集，則說明cccDNA發(fā)生了染色質(zhì)化，并且具有轉(zhuǎn)錄激活功能。ChIP實驗不僅可以驗證已知蛋白-DNA相互作用，而且可以發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)結(jié)合位點，為研究cccDNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制提供了重要工具。在乙肝病毒感染小鼠模型的研究中，通過ChIP實驗驗證cccDNA的染色質(zhì)化和轉(zhuǎn)錄激活功能，有助于深入了解乙肝病毒的復(fù)制和致病機制。4.4肝臟病理組織學(xué)檢查肝臟病理組織學(xué)檢查是評估乙型肝炎病毒（HBV）感染小鼠模型肝臟病變的重要手段，對于深入了解HBV感染的致病機制以及評價模型的有效性具有關(guān)鍵意義。在進行肝臟病理組織學(xué)檢查時，首先需進行肝臟組織切片的制備。取感染HBV的小鼠肝臟組織，迅速放入4%多聚甲醛溶液中進行固定。多聚甲醛能夠使組織中的蛋白質(zhì)等生物大分子發(fā)生交聯(lián)，從而穩(wěn)定組織的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，防止其在后續(xù)處理過程中發(fā)生變形或降解。固定時間一般為12-24小時，以確保組織充分固定。固定后的肝臟組織經(jīng)過梯度乙醇脫水處理，依次經(jīng)過70%、80%、90%、95%和100%的乙醇溶液浸泡，每個濃度的浸泡時間根據(jù)組織大小和質(zhì)地而定，一般為1-2小時。乙醇脫水的目的是去除組織中的水分，為后續(xù)的石蠟包埋做準備。脫水后的組織再經(jīng)過二甲苯透明處理，二甲苯能夠溶解乙醇并使組織透明，便于石蠟的滲透。透明時間一般為30-60分鐘。最后將組織放入融化的石蠟中進行包埋，包埋后的組織冷卻凝固，形成石蠟塊。使用切片機將石蠟塊切成厚度為4-5μm的薄片，將薄片貼附在載玻片上，用于后續(xù)的染色和觀察。染色是肝臟病理組織學(xué)檢查的關(guān)鍵步驟之一，其中蘇木精-伊紅（HE）染色是最常用的染色方法。蘇木精是一種堿性染料，能夠使細胞核染成藍紫色。伊紅是一種酸性染料，能夠使細胞質(zhì)染成粉紅色。在染色過程中，將貼附有肝臟組織切片的載玻片依次放入蘇木精染液中染色5-10分鐘，使細胞核著色。然后用自來水沖洗切片，去除多余的蘇木精染液。接著將切片放入伊紅染液中染色3-5分鐘，使細胞質(zhì)著色。染色后的切片經(jīng)過梯度乙醇脫水和二甲苯透明處理后，用中性樹膠封片。封片后的切片在光學(xué)顯微鏡下進行觀察。在光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織切片時，可以觀察到多種病理變化。正常肝臟組織具有清晰的肝小葉結(jié)構(gòu)，肝細胞排列整齊，呈多邊形，細胞核大而圓，位于細胞中央，細胞質(zhì)豐富，呈嗜酸性。肝血竇位于肝細胞索之間，寬窄均勻，形態(tài)規(guī)則。而在HBV感染的小鼠肝臟組織中，可觀察到肝細胞出現(xiàn)不同程度的損傷。肝細胞氣球樣變是常見的病理變化之一，表現(xiàn)為肝細胞體積增大，細胞質(zhì)疏松，呈氣球樣外觀。肝細胞壞死也較為常見，包括點狀壞死、灶狀壞死等。點狀壞死表現(xiàn)為單個肝細胞的壞死，灶狀壞死則表現(xiàn)為多個肝細胞的壞死聚集在一起。炎癥細胞浸潤也是HBV感染肝臟的常見病理變化，主要表現(xiàn)為淋巴細胞、單核細胞等炎癥細胞在肝組織內(nèi)聚集。炎癥細胞浸潤的部位可以在匯管區(qū)、肝小葉內(nèi)等。在匯管區(qū)，炎癥細胞可圍繞膽管和血管周圍浸潤；在肝小葉內(nèi)，炎癥細胞可圍繞壞死的肝細胞浸潤。這些病理變化對于評估模型的感染和病變程度具有重要意義。肝細胞氣球樣變和壞死的程度可以反映HBV對肝細胞的損傷程度。損傷程度越嚴重，肝細胞氣球樣變和壞死的數(shù)量就越多。炎癥細胞浸潤的程度和范圍則可以反映機體對HBV感染的免疫反應(yīng)強度。免疫反應(yīng)越強，炎癥細胞浸潤的程度就越嚴重，范圍就越廣泛。通過對肝臟病理組織學(xué)檢查結(jié)果的分析，可以全面了解HBV感染小鼠模型的肝臟病變情況，為研究HBV的致病機制、評估藥物療效等提供重要的形態(tài)學(xué)依據(jù)。五、模型應(yīng)用實例分析5.1在乙肝病毒感染機制研究中的應(yīng)用以某科研團隊利用人源化肝臟嵌合小鼠模型研究HBV慢性化機制的實驗為例，該團隊構(gòu)建了Fah-/-Rag2-/-Il2rg-/-人源化肝臟嵌合小鼠模型，這種模型的自體肝細胞會發(fā)生進行性、不可逆轉(zhuǎn)的損傷，且其免疫缺陷狀態(tài)使得對植入的人肝細胞不發(fā)生免疫排斥，人肝嵌合率可高達95%，能夠有效支持HBV的感染和復(fù)制。實驗過程中，將HBV陽性血清通過尾靜脈注射的方式接種到該模型小鼠體內(nèi)。在接種后的不同時間點，采集小鼠的血清和肝臟組織進行檢測分析。通過實時定量PCR技術(shù)檢測血清和肝臟組織中的HBVDNA水平，發(fā)現(xiàn)病毒在小鼠體內(nèi)持續(xù)復(fù)制，且在較長時間內(nèi)維持較高的病毒載量。利用免疫組化和免疫熒光技術(shù)檢測肝臟組織中的HBV抗原表達，結(jié)果顯示肝細胞中廣泛表達HBsAg、HBeAg和HBcAg。進一步對小鼠的免疫應(yīng)答進行分析，發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)的T細胞和B細胞功能存在一定的缺陷。T細胞的活化和增殖受到抑制，細胞因子的分泌水平也明顯降低。B細胞產(chǎn)生的特異性抗體水平較低，無法有效清除病毒。研究人員認為，這種免疫應(yīng)答的異?？赡苁菍?dǎo)致HBV在小鼠體內(nèi)持續(xù)感染并慢性化的重要原因之一。在肝臟病理變化方面，隨著感染時間的延長，小鼠肝臟出現(xiàn)了明顯的炎癥細胞浸潤、肝細胞壞死和纖維化等病理改變。炎癥細胞主要包括淋巴細胞、單核細胞和巨噬細胞等，它們在肝臟組織中聚集，釋放炎癥因子，導(dǎo)致肝細胞損傷。肝細胞壞死表現(xiàn)為肝細胞的凋亡和壞死，嚴重影響了肝臟的正常功能。纖維化程度逐漸加重，肝臟組織中的膠原纖維增多，導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)和功能的進一步破壞。通過對該模型的研究，揭示了HBV慢性化的一些關(guān)鍵機制。HBV在人源化肝臟嵌合小鼠體內(nèi)能夠持續(xù)感染和復(fù)制，主要是由于小鼠的免疫缺陷狀態(tài)導(dǎo)致機體無法有效清除病毒。免疫應(yīng)答的異常使得病毒能夠逃避機體的免疫監(jiān)視，在肝細胞內(nèi)持續(xù)存在并不斷復(fù)制。肝臟的炎癥反應(yīng)和纖維化進程則是HBV慢性感染的重要病理表現(xiàn)，它們相互作用，進一步加重了肝臟的損傷，促進了疾病的進展。該研究充分展示了人源化肝臟嵌合小鼠模型在揭示HBV感染機制方面的重要作用。這種模型能夠高度模擬人類HBV感染的病理生理過程，為深入研究HBV的慢性化機制提供了有力的工具。通過在該模型上進行實驗，科研人員可以更全面、深入地了解HBV與宿主之間的相互作用，為開發(fā)有效的治療策略提供重要的理論依據(jù)。5.2在抗病毒藥物篩選與評價中的應(yīng)用在抗病毒藥物篩選與評價領(lǐng)域，乙型肝炎病毒（HBV）感染小鼠模型發(fā)揮著舉足輕重的作用。以腺相關(guān)病毒（AAV）載體介導(dǎo)的慢性肝炎模型為例，研究人員進行了一系列嚴謹?shù)膶嶒炘O(shè)計來篩選和評價抗病毒藥物。研究人員選取了健康的BALB/c小鼠，隨機分為實驗組和對照組，每組各若干只。實驗組小鼠通過尾靜脈注射的方式接種AAV-HBV載體，以建立慢性肝炎模型。對照組小鼠則注射等量的生理鹽水或不含有HBV基因組的AAV載體。接種后，定期采集小鼠的血清和肝臟組織，檢測病毒相關(guān)指標(biāo)，如HBVDNA水平、HBsAg和HBeAg的表達量等，以確認模型的成功建立。待模型穩(wěn)定后，對實驗組小鼠進行抗病毒藥物干預(yù)。選取了多種具有潛在抗HBV活性的藥物，包括核苷（酸）類似物（如恩替卡韋）和免疫調(diào)節(jié)劑（如Poly(I:C)）。將這些藥物按照不同的劑量和給藥方式給予實驗組小鼠。恩替卡韋采用口服灌胃的方式給藥，每天一次，設(shè)置不同的劑量組，如低劑量組、中劑量組和高劑量組。Poly(I:C)則通過腹腔注射的方式給藥，每周給藥若干次，同樣設(shè)置不同的劑量組。對照組小鼠給予等量的生理鹽水或藥物溶劑。在藥物干預(yù)期間，定期采集小鼠的血清和肝臟組織，檢測病毒指標(biāo)。使用實時定量PCR技術(shù)檢測血清和肝臟組織中的HBVDNA水平，觀察藥物對病毒復(fù)制的抑制作用。采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）技術(shù)檢測血清中的HBsAg和HBeAg含量，評估藥物對病毒抗原表達的影響。通過這些檢測方法，研究人員發(fā)現(xiàn)恩替卡韋可以顯著抑制小鼠血清中和肝細胞中的HBVDNA水平。在高劑量恩替卡韋處理組中，血清HBVDNA水平在給藥后的數(shù)周內(nèi)迅速下降，且在整個實驗期間維持在較低水平。然而，恩替卡韋對血清中抗原和肝細胞中cccDNA水平的影響不明顯。這表明恩替卡韋主要通過抑制病毒的逆轉(zhuǎn)錄過程，減少HBVDNA的合成，從而發(fā)揮抗病毒作用，但對cccDNA的清除效果不佳。Poly(I:C)的實驗結(jié)果顯示，它可以顯著抑制血清中抗原水平、肝細胞中的蛋白表達水平和HBVDNA水平。在Poly(I:C)處理組中，血清HBsAg和HBeAg含量在給藥后逐漸降低，肝細胞中HBV相關(guān)蛋白的表達也明顯減少。這說明Poly(I:C)能夠激活機體的免疫應(yīng)答，增強免疫系統(tǒng)對HBV的識別和清除能力，從而發(fā)揮抗病毒作用。該AAV-HBV小鼠模型在抗病毒藥物篩選與評價中具有重要價值。它能夠在體內(nèi)模擬HBV的慢性感染過程，為研究抗病毒藥物的作用機制和療效提供了真實的實驗環(huán)境。通過該模型，研究人員可以快速篩選出具有潛在抗HBV活性的藥物，并對其療效進行初步評估。這有助于縮短抗病毒藥物的研發(fā)周期，提高研發(fā)效率，為乙肝的治療提供更多有效的藥物選擇。同時，該模型還可以用于研究藥物的聯(lián)合治療方案，探索不同藥物之間的協(xié)同作用，為優(yōu)化乙肝治療策略提供實驗依據(jù)。5.3在乙肝免疫機制研究中的應(yīng)用某科研團隊利用HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型深入研究了機體對HBV的免疫應(yīng)答機制。該團隊選用了表達HBsAg和HBeAg的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠，這些小鼠的基因組中整合了HBV的相關(guān)基因，能夠持續(xù)表達HBV抗原。實驗過程中，對轉(zhuǎn)基因小鼠進行免疫刺激，如注射細胞因子或免疫佐劑。通過流式細胞術(shù)分析小鼠脾臟和肝臟中的免疫細胞，研究人員發(fā)現(xiàn)CD4+T細胞和CD8+T細胞的活化和增殖情況發(fā)生了明顯變化。在免疫刺激后，CD4+T細胞和CD8+T細胞的數(shù)量增加，且其表面的活化標(biāo)志物表達上調(diào)。進一步分析細胞因子的分泌情況，利用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）技術(shù)檢測小鼠血清和肝臟組織中的細胞因子水平，發(fā)現(xiàn)Th1型細胞因子（如IFN-γ、IL-2等）的分泌顯著增加，而Th2型細胞因子（如IL-4、IL-10等）的分泌相對減少。研究人員認為，這種細胞因子分泌模式的改變可能與機體對HBV的免疫應(yīng)答類型有關(guān)。Th1型細胞因子主要參與細胞免疫應(yīng)答，能夠增強巨噬細胞的活性，促進T細胞的活化和增殖，從而有助于清除病毒感染的細胞。Th2型細胞因子則主要參與體液免疫應(yīng)答，能夠促進B細胞的活化和抗體的產(chǎn)生。在HBV感染過程中，機體可能需要通過增強細胞免疫應(yīng)答來有效清除病毒。該研究還發(fā)現(xiàn)，免疫刺激能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性的細胞毒性T淋巴細胞（CTL）反應(yīng)。通過細胞毒性實驗，檢測CTL對HBV感染細胞的殺傷活性，結(jié)果顯