基于CHO細胞的單抗生產（第一版）

汪洋2018/0222:512/40CHO細胞的構建CHO細胞的表達CHO細胞表達后的產物純化目錄22:513/40第一節(jié)CHO細胞的構建生物類似藥的開發(fā)周期表引言22:515/40在獲取一種蛋白之前，先要找到該蛋白的基因序列，我們知道了它的名字，就可以到數(shù)據庫里進行搜索。有很多免費的數(shù)據庫資源，比如NCBI。找到蛋白，再找到它的DNA序列。

然后針對這段序列設計引物，找到模板或基因組，用PCR的方法擴增出來把擴增出來的基因放到載體上，通過一定的方式如電刺激使得載有可表達目標蛋白的載體進入到細胞內部由于轉入細胞核的質粒有很小的概率（億分之一）整合進宿主的基因組中，所以可以用加壓篩選的手段（主要有抗生素）將這種細胞篩選出來并擴大培養(yǎng)，這樣就得到了可以穩(wěn)定表達目標蛋白的細胞株工程細胞構建的流程概述細胞株篩選一般流程宿主細胞載體篩選CHO細胞系宿主的一般來源FUT8（α-1,6巖藻糖轉移酶基因），負責將巖藻糖加入抗體的N-糖鏈上，形成巖藻糖修飾

（專利日本BioWa制藥，預計2028.07.09）。去除巖藻糖修飾可以增強百倍以上的ADCC作用。2.crispr/cas9原理是：crRNA（CRISPR-derivedRNA）通過堿基配對與tracrRNA（trans-activatingRNA）結合形成tracrRNA/crRNA復合物，此復合物引導核酸酶Cas9蛋白在與crRNA配對的序列靶位點剪切雙鏈DNA。而通過人工設計這兩種RNA，可以改造形成具有引導作用的sgRNA（singleguideRNA），足以引導Cas9對DNA的定點切割。3.鋅指核糖核酸酶（ZFN）由一個DNA識別域和一個非特異性核酸內切酶構成。宿主細胞選擇的一般原則Regulatory-HostcelllineIND提供CHO已知具有明顯的致瘤性，一般可不再檢測宿主細胞選擇的一般原則載體的一般性構成主要構件：IRES起始位點Promoters啟動子Enhancer增強子Signalpeptide信號肽mAbSequence單克隆抗體序列Terminator

終止子

Resistance

markers抗性標記

Expressionpromotingelement促穩(wěn)定表達件載體的一般性構成1、IRES：即內部核糖體進入位點，是一段核酸序列，它的存在能夠使蛋白質翻譯起始不依賴于5‘帽結構，從而使直接從信使RNA（mRNA）中間起始翻譯成為可能。通常來講，真核生物翻譯只能從mRNA的5‘端開始，因為翻譯起始必須依賴于5’端的帽子結構。2、Promoters：即啟動子，控制基因表達（轉錄）的起始時間和表達的程度，啟動子本身并不控制基因活動，而是通過與稱為轉錄因子（transcriptionfactor）的這種蛋白質（proteins）結合而控制基因活動的

抗體序列需使用強啟動子如SV40啟動子等

而抗性基因需要使用削弱的啟動子3、Enhancer：即增強子，是指能夠使基因轉錄頻率明顯增加的DNA序列。增強子主要存在于真核生物基因組中。

增強子能大大增強啟動子的活性。增強子具有特異性載體的一般性構成

4、Signalpeptide：即信號肽（引導新合成的蛋白質向分泌通路轉移的短肽鏈）

不同的產物可能需要不同的信號肽，抗體一般可使用人血白蛋白信號肽，獲得較高表達量，且能被完全切除

一般需要進行信號肽預測優(yōu)化，選擇合適的信號肽，

在蛋白質分泌到胞外之前正常情況下會被完全切除

信號肽假說認為，信號肽的功能是引導多肽到達內質網內腔，同時信號肽酶水解，加工完成后分泌到胞外5、mAbSequence

人源化IgG1恒定區(qū)（CH和CL）有EM和DL兩個版本，區(qū)別是兩個位點的氨基酸有突變Biosimilar:檢索原研藥專利獲得VH和VL序列，并購買原研藥進行序列分析比對，進行序列驗證Category

1

of

Therapeutic

Biological

Products:①Hybridomatechnique雜交瘤篩選②Phagedisplay噬菌體展示載體的一般性構成6、Terminator

：終止子，是給予RNA聚合酶轉錄終止信號的DNA序列。在一個操縱元中至少在構基因群最后一個基因的后面有一個終止子。7、Expressionpromotingelement:即促表達元件

例：UCOE:全稱為泛染色質開放元件（UbiquitousChromatinOpeningElement），加在外源基因啟動子5’端上游，是一個小的DNA片段，源于看家基因的無甲基化CpG島。研究表明，UCOE能有效防止基因沉默，不論整合到染色質什么位置，目的基因都能持續(xù)穩(wěn)定、高水平地表達。

MerckKGaA專利，預計2019.07.20到期

載體的構建的一般性原則構建完的細胞篩選非擴增基因擴增基因：在一定程度上表達量隨篩選壓力而增加可選其中一種或選其中任意兩種，使用兩種需要關注HC和LC比例（LC形成二聚體可以分泌到胞外）篩選方法Fluorescence-ActivatedCellSorting(FACS)-BasedScreening基于熒光激活細胞分選(FACS)技術的篩選方法ClonePix/CellXpressTM

克隆篩選及細胞表達系統(tǒng)Limitingdilution有限稀釋法

篩選方法Fluorescence-ActivatedCellSorting(FACS)-BasedScreening

ThecoldcapturemethodusedinFACSwherefluorescentlylabeledantibodiesbindtosecreted

將待測的細胞經熒光染料(FITC、PE和PerCP等）或熒光標記物特異性染色,用特定波長的激光束照射,激發(fā)熒光。前向角光散射(forwardanglelightscatter,FSC)和側向角光散射(sideanglelightscatter,

SSC)分別表征細胞的相對大小和內部顆粒度,相對熒光強度值能反映細胞目標的相對表達水平光源篩選方法ClonePix

Semisolidmedia篩選方法Limitingdilution有限稀釋法(limitingdilutioncloning,LDC)是一種通過梯度稀釋以獲得單克隆的方法。它的應用范圍廣,對于大多數(shù)細胞類型,如雜交瘤細胞、CHO細胞及干細胞等都有較好的克隆分離效果。LDC的操作過程大致分為接種(鋪板)、篩選和擴增。接種的細胞液經過逐級稀釋后加到96孔板中,每個孔所含的細胞個數(shù)理論上不大于1

有限稀釋法

ExpressionVectorHostcellTransfectionMinipoolStablepoolSmall-scalBioreactorMonoclonalSubclone一二SubcloneSmall-scalBioreactor轉染轉染①脂質體轉染法：陽離子脂質體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過靜電作用，將DNA分子包裹入內，形成DNA脂復合物，也能被表面帶負電的細胞膜吸附，再通過融合或細胞內吞進入細胞。由于脂質體對細胞有一定的毒性，所以轉染后需要更換培養(yǎng)基。如Lipofectamine?3000TransfectionReagent，一般用于瞬時轉染，因轉染后細胞活率較高，也有部分企業(yè)用于穩(wěn)轉。

②電穿孔轉染法：電流能夠可逆地擊穿細胞膜形成瞬時的水通路或膜上小孔促使DNA分子進入胞內，這種方法就是電穿孔。因使用便捷且轉染（入核）效率較高，

大部分企業(yè)使用電轉染。電轉染有兩種方案：方形波和指數(shù)波，根據實際情況選擇合適的波形進行優(yōu)化，選擇轉染效率和轉染后細胞活率較高的電轉條件。CHO細胞選用電轉較多。

③病毒感染：對于脂質體轉染與電穿孔轉染都無法成功轉染的細胞系建議用病毒感染，此法可以快速100%感染，檢測成功率高。因操作難度高，使用較少?？寺『Y選一、Minipool

轉染24H后,使用含有壓力的培養(yǎng)基，以一定細胞密度接種到96WP,培養(yǎng)14-20天，

挑選出只有單簇細胞生長且匯合度超過30%的孔，ELISA檢測表達量，挑選表達

量較高的若干個克隆

96WP24WP6WPELISATPPSF125接種F125進行Fed-Batch評估，檢測表達量和質量，選擇產量和質量最優(yōu)的3-5個克隆MonoclonalELISA、SDS(還原與非還原)表達量檢測還可用：Dot-blot、FortebioELISA克隆篩選二、Stablepool

轉染24H后,使用含有壓力的培養(yǎng)基，以一定細胞密度接種到T75或F125,加壓

一定時間（根據使用的篩選壓力），得到若干個Stablepool，用ELISA（或

FACS）檢測，選擇表達量（或陽性率和高表達）的1-2個Stablepool進行單

克隆化

Stablepool96WP24WPTPPSF125接種F125進行Fed-Batch評估，檢測表達量和質量，選擇產量和質量最優(yōu)的3-5個克隆Monoclonal以1-3個/孔鋪板96孔板進行單克隆化，一般不添加篩選壓力或者使用半壓6WPELISAELISAELISA、SDS(還原與非還原)單克隆在細胞克隆中，對培養(yǎng)的細胞來說，從原有的克隆中，再篩選出具有某種特性的細胞進行培養(yǎng)，就是亞克隆。亞克隆的目的是獲得單克隆CFDA-目前來說只要理論上證明是單克隆FDA-ClonalityLimitingdilution：classic<0.5cell/well2roundsCSI/CellMetric單克隆拍照系統(tǒng)FDA目前對于單克隆證明方法意見克隆性FISH不但可用于已知基因或序列的染色體定位，而且也可用于未克隆基因或遺傳標記及染色體畸變的研究。在基因定性、定量、整合、表達等方面的研究中頗具優(yōu)勢。篩選檢定細胞代次的規(guī)定細胞庫的相關法規(guī)要求細胞庫的相關法規(guī)要求1、程序性降溫儀：可編程降溫程序，能夠準確的達到設定的溫度，重復性。穩(wěn)定性好，適合于細胞建庫使用2、程序降溫盒：需在降溫盒夾層加入異丙醇，可實現(xiàn)-1℃/min，每個凍存盒一般可放16支，比較適用于實驗室規(guī)模標準的凍存程序：為降溫速率-1～-2℃/min；當溫度達-25℃以下時，可增至-5℃～-10℃/

min；到-100℃時，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱2h，然后放入-70℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內。細胞庫的相關法規(guī)要求凍存容器：（供應商:CBS、MVE、ThermoFisherScientific）普通液氮罐：直接凍存在液態(tài)液氮中，很容易引起交叉污染氣化液氮罐：液氮存于罐底部，通過底部液氮氣化維持溫度隔氮型液氮罐：液氮貯存于夾層中，與樣品完全隔離，取用安全且將交叉污染的可能降到最低細胞庫的相關法規(guī)要求細胞庫的檢定細胞庫檢定-CHO細胞檢測項目MCPWCPEOPC細胞鑒別++(+)細菌、真菌檢查+++分歧桿菌檢查+++支原體檢查(+)(+)(+)內、源病毒污染檢查細胞形態(tài)觀察及血吸附試驗+++體外不同細胞接種培養(yǎng)法+++動物和雞胚體內接種法+-+逆轉錄病毒檢查+-+種屬特異性病毒檢查（鼠源）(+)--牛源性病毒檢查(+)(+)(+)豬源性病毒檢查(+)(+)(+)其他特定病毒檢查(+)(+)(+)染色體檢查(+)(+)(+)成瘤性檢查(+)(+)-致瘤性檢查(+)(+)-(+)表示要根據細胞特性、傳代歷史、培養(yǎng)過程等情況要求的檢鏈項目。細胞庫的穩(wěn)定性考察細胞穩(wěn)定性研究儲存條件下的穩(wěn)定性傳代/擴增過程的穩(wěn)定性基因水平目的產物表達水平細胞自身穩(wěn)定性細胞庫的穩(wěn)定性考察儲存條件下穩(wěn)定性屬于原液放行檢定項目細胞庫的穩(wěn)定性考察傳代/擴增過程的穩(wěn)定性通過細胞構建減少表達雜質的案例CHOK1cellExpressionofantibodyAAcidicvariants:NMT14.0%

Basicvariants:NMT30.0%USPAcceptancecriteria

Acidicvariants:NMT35.0%

Basicvariants:NMT15.0%

Original

drugsAcidicvariants:NMT10.0%

Basicvariants:NMT10.0%游離巰基、半胱氨酸殘基N-末端谷氨酰胺環(huán)化甲硫氨酸的氧化天冬酰胺脫氨基作用和天冬氨酸異構化C-末端賴氨酸不完全截除糖基末端的唾液酸化抗體電荷異質性的主要成因堿性峰堿性峰堿性峰酸性峰酸性峰酸性峰重鏈C-末端賴氨酸不完全截除堿性峰羧肽酶是移除C-賴氨酸的酶可用弱陽離子層析檢測分析降低賴氨酸變體的策略：

降低細胞培養(yǎng)溫度

延長發(fā)酵時間

提高鋅離子濃度

降低銅離子濃度重鏈和輕鏈N-末端谷氨酰胺環(huán)化可被谷氨酰胺環(huán)化酶催化但在抗體儲存過程中，環(huán)化作用是自發(fā)的可用基于電荷的分析方法，如IEF、CEXpH4～6，pH升高環(huán)化減少pH6～8，pH升高環(huán)化增加在中性條件下環(huán)化作用最少降低谷氨酰胺環(huán)化的策略：

盡量選擇中性條件

控制溫度（高溫條件可加速環(huán)化）甲硫氨酸的氧化堿性峰主要位點：M252、M428檢測：先還原成HC+LC，聯(lián)苯層析柱加UV215nm加質譜降低甲硫氨酸氧化的策略：避免高溫、紫外線、叔丁基過氧化氫，溶氧不要過高堿性峰焦谷氨酸氨肽酶去環(huán)化，釋放自由氨基，可恢復基于Edman降解法的N-末端氨基酸測序糖基末端的唾液酸化酸性峰常發(fā)生在糖鏈末端半乳糖殘基上可用唾液酸酶去除，用IEF、CEX檢測抗體生產追求NeuAc

/NeuGc比例最大化最大化策略：+丁酸鈉，下調培養(yǎng)溫度NeuAc

/NeuGc測定方法：HPLC、MS、IEF唾液酸酶去除唾液酸前后的對比天冬酰胺脫氨基作用酸性峰可自發(fā)發(fā)生，無需酶催化檢測：人為加速脫氨基（37C，pH8）

之后用CEX，HIC降低脫氨基作用的策略：

盡量避免熱點序列Asn-Gly

降低培養(yǎng)溫度，適當下調pH游離巰基、半胱氨酸殘基酸性峰抗體的二硫鍵可能未配對或配錯對，導致抗體表面電荷分布的改變和酸性峰的出現(xiàn)用木瓜蛋白酶把完整抗體解離成Fab和Fc后，用RP-HPLC可檢測到游離巰基降低游離巰基、半胱氨酸殘基的策略：在培養(yǎng)基中加適量硫酸銅（氧化劑）有研究發(fā)現(xiàn)，單克隆抗體的C-末端殘留賴氨酸在靜脈注射至體內后，會被血清中的羧肽酶B快速降解，完整C-末端賴氨酸的半衰期約為62min。另有研究發(fā)現(xiàn)，從血清中獲得的抗體通常均缺少C-末端賴氨酸，也從另一方面證實了C-末端賴氨酸殘基在體內是受到限制的。KHAWLI等通過置換色譜法分別制備出酸堿變體，并對其進行評價，發(fā)現(xiàn)C-末端賴氨酸變體對抗體的效價、安全性均無影響。重鏈C-末端賴氨酸盡管C-末端賴氨酸變體對單克隆抗體的生物學活性無影響，但抗體的賴氨酸變體程度也反映了生產工藝的穩(wěn)定性和產品的一致性，尤其在生物類似藥的研發(fā)過程中和生產工藝改變后，更應對產品的賴氨酸變體進行檢測和評價。因此，在生產工藝的研發(fā)中，應嚴格監(jiān)控C-末端賴氨酸變體，并深入了解其與產品質量和安全性的關系。單克隆抗體大規(guī)模生產時，賴氨酸變體應控制在可行范圍內，并評估是否需作為在產品放行、穩(wěn)定性試驗和工藝改變時的一項檢測指標。第二節(jié)CHO細胞的表達22:5145細胞培養(yǎng)的基本要求細胞構成的基本元素：碳、氫、氧、氮、鈉、鉀、鈣、鎂、磷，合適的培養(yǎng)基是細胞培養(yǎng)的必要條件1.氨基酸：是細胞合成蛋白質的原料。所有細胞都需要12種必須氨基酸：纈氨酸、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精氨酸、胱氨酸。此外還需要谷氨酰胺，它在細胞代謝過程中有重要作用，所含的氮是核酸中嘌令和嘧啶合成的來源，同樣也是合成三、二、一磷酸酰苷所需要的基本物質。體外培養(yǎng)的各種培養(yǎng)基內都含有必需氨基酸。小花絮：經過幾萬年動物進化，自然選擇的結果，動物體內所有的氨基酸都左旋的，所以右旋的氨基酸是不能用于細胞培養(yǎng)的

22:5146細胞培養(yǎng)基單糖：培養(yǎng)中的細胞可以進行有氧與無氧酵解，六碳糖是主要能源。此外六碳糖也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。細胞對葡萄糖的吸收能力最高，半乳糖最低。

體外培養(yǎng)動物細胞時，幾乎所有的培養(yǎng)基或培養(yǎng)液中都以葡萄糖作為必含的能源物質。蛋白質的一級結構維系鍵是肽鍵，二級結構借氫鍵維系，三級結構維系鍵主要是非共價鍵（次級鍵）：氫鍵、疏水鍵、范德華力、離子鍵等，也可涉及二硫鍵。這些鍵的形成主要依靠C\H\O\N，所以糖和氨基酸是細胞培養(yǎng)基中最重要組成部分22:5147細胞培養(yǎng)基維生素：主要扮演輔酶、輔基的角色，必不可少。生物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素、維生素B12都是培養(yǎng)基常有的成分。22:5148細胞培養(yǎng)基無機離子與微量元素：細胞生長除需要鈉、鉀、鈣、鎂、氮和磷等基本元素，還需要微量元素，如鐵、鋅、硒、銅、錳、鉬、釩、硫等。微量元素雖然在細胞體內含量非常非常少，卻是蛋白質四級結構中非常重要的維系鍵形成的關鍵元素，對于藥物而言該四級結構控制著藥代、藥理相關的過程22:5149促生長因子及激素已證實：各種激素、生長因子對于維持細胞的功能、保持細胞的狀態(tài)（分化或未分化）具有十分重要的作用。有些激素對許多細胞生長有促生長作用，如胰島素，它能促進細胞利用葡萄糖和氨基酸。有些激素對某一類細胞有明顯促進作用，如氫化可的松可促進表皮細胞的生長，泌乳素有促進乳腺上皮細胞生長作用等。細胞培養(yǎng)基22:5150細胞培養(yǎng)的基本要求滲透壓：細胞必須生活在等滲環(huán)境中，大多數(shù)培養(yǎng)細胞對滲透壓有一定耐受性。人血漿滲透壓290mOsm/kg,可視為培養(yǎng)人體細胞的理想滲透壓。鼠細胞滲透壓在320mOsm/kg左右。對于大多數(shù)哺乳動物細胞，滲透壓在260－320mOsm/kg的范圍都適宜。pH、氣體也是細胞生存的必需條件之一，所需氣體豐要是氧和二氧化碳。氧參與三羧酸循環(huán)，產生能量供給細胞生長、增殖和合成各種成分。一些細胞在缺氧情況下，借糖酵解也可獲取能量，但多數(shù)細胞缺氧不能生存。在開放培養(yǎng)時，一般置細胞于95％空氣加5％二氧化碳的混合氣體環(huán)境中培養(yǎng)。二氧化碳既是細胞代謝產物，也是細胞所需成分，它主要與維持培養(yǎng)基的pH有直接關系。動物細胞大多數(shù)需要輕微的堿性條件，pH值約在7．2~7．4℃在細胞生長過程中，隨細胞數(shù)量的增多和代謝活動的加強，二氧化碳不斷被釋放，培養(yǎng)液變酸，PH值發(fā)生變化。由于NaHCO3容易分解為二氧化碳，很不穩(wěn)定，致使緩沖系統(tǒng)難以精確地控制。故這一緩沖系統(tǒng)適合密閉培養(yǎng)。22:5151CHO細胞性質中華倉鼠卵巢細胞（CHO）是治療性重組蛋白工業(yè)化生產的主要宿主細胞。較于其他細胞類型，CHO細胞是治療性蛋白生產的主要宿主細胞的原因如下：（1）能在化學成分限定和無血清懸浮培養(yǎng)中穩(wěn)定生長，（2）在人類致病病毒應答方面表現(xiàn)出合理的安全性，（3）能夠表達與人相似的翻譯后修飾。此外，CHO細胞表達系統(tǒng)的最重要優(yōu)勢之一是能夠容易的得到基因改造的細胞克隆，這些克隆能夠表達產量充足和質量可接受的人用目標基因（GOI）蛋白。這些既可以通過將目的基因特異性位點整合插入到宿主細胞基因組中，也可以通過二氫葉酸還原酶（DHFR）和谷氨酰胺合成酶（GS）系統(tǒng)的基因擴增方法將基因隨機整合到宿主細胞基因組中。然而，因為糖基化模式與人類不完全相同，導致CHO細胞產生的重組蛋白在某些時候仍然表現(xiàn)出免疫源性。22:5152單抗的性質抗體是由B細胞分泌，具有識別外源性病原體并誘發(fā)免疫應答的一類糖蛋白，人體內有5種類型的抗體：IgG、IgA、IgD、IgE、IgM，其中IgG1在血液中占主導地位22:5153目前所有獲批的重組單抗藥物都是IgG亞型FabFc鉸鏈區(qū)單抗的性質22:5154CHO細胞表達單抗的過程細胞核中DNA轉錄成為信使RNA，信使RNA經過核孔進入細胞質，被細胞質中的核糖體發(fā)現(xiàn)，進入核糖體進行翻譯，經過原料氨基酸的合成為多肽，（cho細胞不能自身無合成脯氨酸的基因，需在培養(yǎng)基中加L-脯氨酸），核糖體附著在內質網上，核糖體合成的多肽進入內質網，被內質網上附著的大量的酶加工、剪切，最后內質網分泌囊泡將被加工過的多肽包裹運輸?shù)礁郀柣w，高爾基體進行進一步的修飾，形成蛋白質。然后高爾基體分泌囊泡包裹蛋白質，將蛋白質運輸?shù)桨獗磉_蛋白過程的概述22:5155CHO細胞表達單抗的過程22:5156CHO細胞表達單抗的過程真核細胞中染色質分為兩部分，一部分為固縮狀態(tài)，如間期細胞著絲粒區(qū)、端粒、次溢痕，染色體臂的某些節(jié)段部分的重復序列和巴氏小體均不能表達，通常把該部分稱為異染色質。與異染色質相反的是活化的常染色質。真核基因的活躍轉錄是在常染色質進行的。轉錄發(fā)生之前，常染色質往往在特定區(qū)域被解旋或松弛，形成自由DNA，這種變化可能包括核小體結構的消除或改變，DNA本身局部結構的變化，如雙螺旋的局部去超螺旋或松弛、DNA從右旋變?yōu)樽笮@些變化可導致結構基因暴露，RNA聚合酶能夠發(fā)生作用，促進了這些轉錄因子與啟動區(qū)DNA的結合，導致基因轉錄22:5157真核生物基因轉錄在細胞核內進行，而翻譯則在細胞質中進行。在轉錄過程中真核基因有插入序列，結構基因被分割成不同的片段，因此轉錄后的基因調控是真核生物基因表達調控的一個重要方面，首要的是RNA的加工、成熟。各種基因轉錄產物RNA，無論rRNA、tRNA還是mRNA，必須經過轉錄后的加工才能成為有活性的分子蛋白質合成翻譯階段的基因調控有三個方面：①蛋白質合成起始速率的調控；②mRNA的識別；③激素等外界因素的影響。蛋白質合成起始反應中要涉及到核糖體、mRNA蛋白質合成起始因子可溶性蛋白及tRNA，這些結構和諧統(tǒng)一才能完成蛋白質的生物合成。mRNA則起著重要的調控功能。CHO細胞表達單抗的過程22:5158CHO細胞表達單抗的過程真核生物mRNA的“掃描模式”與蛋白質合成的起始。真核生物蛋白合成起始時，40S核糖體亞基及有關合成起始因子首先與mRNA模板近5’端處結合，然后向3’方向移行，發(fā)現(xiàn)AUG起始密碼時，與60S亞基形成80S起始復合物，即真核生物蛋白質合成的“掃描模式”。真核生物5’末端可以有3種不同帽子：0型、I型和II型。不同生物的mRAN可有不同的帽子，其差異在于帽子的堿基甲基化程度不同。帽子的結構與mRNA的蛋白質合成速率之間關系密切：①帽子結構是mRNA前體在細胞核內的穩(wěn)定因素，也是mRNA在細胞質內的穩(wěn)定因素，沒有帽子的轉錄產物會很快被核酸酶降解；②帽子可以促進蛋白質生物合成過程中起始復合物的形成，因此提高了翻譯強度；③沒有甲基化(m7G)的帽子(如GPPPN-)以及用化學或酶學方法脫去帽子的mRNA，其翻譯活性明顯下降。22:5159翻譯后修飾如脫酰胺、二硫鍵形成、末端賴氨酸處理（切除）和糖基化，后者是一種發(fā)生在內質網和高爾基體內復雜的翻譯后修飾。根據作用機理，生物藥物分子的糖型可能決定了其臨床療效，因此糖基化修飾被認為是單抗藥物的一個關鍵質量屬性（CQA）CHO細胞表達單抗的過程

CQA：糖基化修飾N-糖位點(ASN-X-Thr/Ser,X非Pro)O-糖位點(任意Thr和Ser)60O-糖基化N-糖基化（Enbrel-etanercept）最主要形式O-糖基化類型常見8種粘蛋白類型O-糖核心結構常見粘蛋白類型O-糖質譜分子量61N-糖基化類型62Hybrid雜合型Highmannose高甘露糖型治療性重組抗體常見N-糖基化組成重點關注對Fc功能影響和存在免疫原性的糖型Complex復雜型N-糖形成過程內質網高爾基體各種剪切酶（減去單糖）及轉運酶（加上單糖）作用下對糖基化形式進行編輯63N-糖基化對蛋白功能影響增進蛋白溶解度，一定程度防止蛋白聚集保護蛋白免受蛋白酶酶切可能引起免疫原性對ADCC、CDC等生物效應造成影響對體內循環(huán)半衰期有一定影響64影響蛋白質構象變化65N-糖基化對蛋白構象的影響鉸鏈區(qū)影響分子構象“鉸鏈區(qū)”的存在為分子提供了柔性，使得Fab-Fc、Fab-Fab間可以有一定的擺動。進而影響IgG的空間構象，影響Fc片段活性區(qū)域與多種受體的結合。N糖基化同樣影響分子構象N糖基化位于Fc片段的CH2共有序列

（Asn-X-Ser/Thr）通過晶體X衍射發(fā)現(xiàn)蛋白與糖以對等方式相互作用而影響彼此構象N-GlycosylationsiteFcγRs(FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、FcγRIIIb)FcRnC1q……結合ADCCAntibodyDependentCell-MediatedCytotoxicity（抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用）1、IgG抗體與靶細胞表面的抗原決定簇特異性地結合；2、之后NK細胞、巨噬細胞等借助其表面受體與結合在靶細胞上的IgGFc段結合；3、活化的NK細胞等釋放穿孔素、顆粒酶等細胞毒物質殺傷靶細胞；4、靶細胞發(fā)生細胞凋亡，抗體被肝處理。66*與去巖藻糖化、唾液酸比例等相關CDCComplementDependentCytotoxicity（補體依賴性細胞毒作用）補體參與的細胞毒作用，即通過特異性抗體與細胞膜表面相應抗原結合，形成復合物而激活補體經典途徑，所形成的攻膜復合物對靶細胞發(fā)揮裂解效應67*與末端半乳糖化比例相關甘露糖受體功能甘露糖受體，屬于哺乳動物類C型凝集素超家族成員,主要表達于巨噬細胞和未成熟樹突狀細胞表面,可與末端甘露糖特異結合。高甘露糖型抗體由于可被巨噬細胞的甘露糖受體結合并發(fā)生吞噬作用，因此在體內的循環(huán)時間減少，半衰期減短，因此應盡量減少抗體中高甘露糖糖型的比例。68*與高甘露糖型比例相關舉例AdditionalTerminalResidueEffectonreceptorbindingEffectonADCCEffectonC1qbindingEffectonCDCEffectonHalf-lifeinSerum巖藻糖減弱減弱無影響無影響無影響唾液酸減弱減弱無影響無影響增強半乳糖無影響無影響增強增強無影響高甘露糖增強增強減弱減弱減弱N-乙酰葡糖胺增強增強減弱減弱未知末端寡糖對抗體活性的影響CurrentOpinioninImmunology2008,20:471–47822:5170細胞培養(yǎng)條件對于糖型的影響補料成分抗體糖型取決于培養(yǎng)基中各營養(yǎng)物質濃度，營養(yǎng)物質中的糖分子作為糖基化所需的糖-核苷酸前體存在培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基中葡萄糖水平變化明顯影響聚糖異質性，在流加模式中更為重要，產品糖型的一致性是獲得臨床預期結果的保障。已發(fā)現(xiàn)，隨著葡萄糖濃度的提高，CHO細胞及新近構建的細胞系（如F2N78）所表達的抗體半乳糖和唾液酸糖基化水平會提高葡萄糖合適的操作區(qū)間濃度（2-8g/L）。葡萄糖饑餓程度在培養(yǎng)早期對細胞影響最大22:5171細胞培養(yǎng)條件對于糖型的影響二價陽離子如Mn2+（4-40μM）可以發(fā)現(xiàn)產物的半乳糖苷化和唾液酸化提高。因為Mn2+是高爾基體中β-1,4-半乳糖苷轉移酶的輔助因子。二價陽離子在分泌路徑將寡糖連接至目的物中發(fā)揮作用，沒有它們N型連接寡糖鏈過程將會受到抑制。補料成分22:5172細胞培養(yǎng)條件對于糖型的影響丁酸鈉可以通過將細胞周期滯留而增加特定mAb的產率，然后，在培養(yǎng)基中加入丁酸鈉觀察到會降低半乳糖修飾水平并增加mAb的堿性電荷異構體。添加丁酸鈉也觀察到會降低mAb唾液酸修飾水平補料成分22:5173細胞培養(yǎng)條件對于糖型的影響單糖連接至正在成長的天線寡糖鏈結構中需要核苷酸糖作為供給者，其效率對最終糖型影響極深。尿苷被認為是合成糖-核苷酸結合體的主要前體之一，因此影響產品質量。補料成分22:5174細胞培養(yǎng)條件對于糖型的影響培養(yǎng)基中補充的氨基酸對唾液酸修飾的影響已被很好地證明。氨基酸的消耗直接與表達的抗體所序列所含氨基酸種類相關。因此為了獲得最佳產品質量，在培養(yǎng)過程中補充關鍵氨基酸并進行濃度分析是勢在必行的。這些還引導出了新的詞匯如“fermentanomics”的出現(xiàn)，利用1D1HNMR技術實時或近似實時監(jiān)控補料成分與細胞代謝。利用多重變量數(shù)據分析評估m(xù)Ab糖基化與過程變量及諸如氨基酸等原材料的關系，從而對復雜糖基化過程產生更為深入的了解。補料成分22:5175細胞培養(yǎng)條件對于糖型的影響對細胞最優(yōu)的培養(yǎng)溫度可能不一定是細胞表達產物的最優(yōu)溫度。低些的培養(yǎng)溫度（從37℃降至30-35℃）發(fā)現(xiàn)可以使細胞滯留在G0/G1期，具有更高的細胞活力和更少的細胞凋亡。在低的溫度下發(fā)現(xiàn)細胞內UDP-GlcNAc和UDP-GalNAc數(shù)量減少。研究者證實mRNA水平的提高（而非生長周期的滯留）是低溫下獲得高產率的背后原因。最近，通過關鍵糖分支酶的研究對低溫條件下的mAb產品有了更好的了解。發(fā)現(xiàn)這些酶下調導致終產品糖鏈結構的異常。細胞活力和溫度22:5176細胞培養(yǎng)條件對于糖型的影響溶氧的影響所有代謝過程都需要氧氣，所以溶氧控制對優(yōu)化細胞生長很重要。細胞表達的糖蛋白/抗體糖型的隨溶氧（DO）水平變化而改變。在鼠CC9CC10細胞表達的IgGmAb1時發(fā)現(xiàn)半乳糖基化水平的差異，低溶氧條件下半乳糖糖基化水平也低。這個似乎是因UDP-Gal低水平所致，因為葡萄糖分解途徑導致半乳糖利用率下降。另外一個解釋是早期形成的重鏈間二硫鍵對要加入正在生長的寡糖鏈的半乳糖產生了空間位阻。不同型號的生物反應器，即使達到相似的過程控制和溶氧條件，依然會對糖型有影響。利用雜交瘤細胞系（BCF2）進行一室縮小規(guī)模模擬溶氧張力（DOT）波動培養(yǎng)，研究生物培養(yǎng)環(huán)境的差異對mAb糖型影響。據報道，10%DO水平下培養(yǎng)三天線結構和唾液酸數(shù)量會增加。DOT對鼠雜交瘤細胞系HFN7.1生產的IgG1的糖型影響極深，DOT在10%-90%空氣飽和度變化時，半乳糖和唾液酸最大變化量分別達20%和30%。短暫的DOT變化對終產品質量有著顯著影響。22:5177細胞培養(yǎng)條件對于糖型的影響氨和PH值氨是CHO細胞代謝谷氨酰胺或天冬酰胺時釋放到培養(yǎng)基中的有毒副產物。據知，氨水平的增加會改變CHO細胞表達的IgG的糖型，因為銨根離子會升高高爾基體的pH值并抑制與寡糖鏈相關的酶的酶活。對mAb生產而言，理想的胞內氨濃度低于2mM，胞外濃度4-10mM。高爾基體pH的微小上升會導致-2,3-唾液酸轉移酶定位錯誤，維持pH近中性會改變高爾基體的形態(tài)。高pH會影響UMP的電離狀態(tài)，UMP是一種UDP-GlcAc轉運子的逆向轉運物質，從而影響UDP-GlcNAc轉運進高爾基體。氨水平的增加同樣顯示出：高爾基體高pH時，引起半乳糖和唾液酸修飾的降低，從而引起甘露糖修飾的增加。氨也通過補償胞內核苷酸糖庫的平衡而影響抗體糖型（圖3）。已有推論因為CMP-SiaT酶水平的降低，氨水平的提高阻止了唾液酸從胞質轉運到高爾基體。更進一步，從可用文獻獲知pH（理想pH6.8-7.8）對糖型的顯著影響與不同表達細胞系有關，另有結果表明pH在不同細胞系中對糖型的微觀異質性有影響。還有些研究者報道稱人細胞系中高pH會引起半乳糖修飾水平下降，另外一些人發(fā)現(xiàn)雜交瘤細胞系中高pH引起IgG3的半乳糖修飾水平增加。22:5178滲透壓細胞培養(yǎng)條件對于糖型的影響滲透壓是另外一個影響mAb生產、細胞生長和細胞活力的關鍵過程參數(shù)。一定范圍的高滲（300-400mOsm/kg）有益，并被用來提高重組蛋白在CHO細胞中的表達。添加堿、葡萄糖或其他補料會提高滲透壓，從而影響產品質量和特殊mAb產品。長時間的培養(yǎng)和培養(yǎng)基的高滲透壓會產生高甘露糖型的抗體藥物。22:5179因素正向影響負面影響錳離子在Mn2+濃度高時，IgG的N-聚糖修飾具有高甘露糖型；IgG的Man5糖型減少在有尿苷和半乳糖的補充下，半乳糖修飾水平高。葡萄糖高濃度葡萄糖與可產生的前體相關，導致高水平的半乳糖修飾和唾液酸修飾耗盡時，減少IgG的位點占據；限制葡萄糖水平導致低水平的糖基化。丁酸鈉

丁酸鈉存在時，唾液酸水平微小下降；減少半乳糖修飾。氨/谷氨酰胺

隨著氨水平的增加，抑制半乳糖和唾液酸修飾。氨基酸隨著色氨酸、天冬氨酸和異亮氨酸的補充唾液酸修飾水平增加。培養(yǎng)基中高濃度的天冬酰胺導致低半乳糖型修飾。血清無血清培養(yǎng)中糖型異質性低；

無血清培養(yǎng)基中唾液酸修飾高&半乳糖類修飾低。細胞培養(yǎng)條件對于糖型的影響小結22:5180因素正向影響負面影響氧DO水平波動會增加三天線型和唾液酸修飾。在低DO水平下IgG的半乳糖修飾減少；在低DO水平下半乳糖修飾減少而唾液酸修飾增加。pH低pH時，葡萄糖修飾&唾液酸修飾水平提高。隨著pH上升，末端半乳糖修飾減少&巖藻糖修飾增加；高pH時，半乳糖修飾水平下降。溫度

低溫時，由于基因表達下調，導致mAb糖鏈結構的成熟度下降。滲透壓高滲時，增加Man5修飾水平。在高滲（420mOsm/Kg）時對糖型無明顯影響；在較高滲透壓時會減少巖藻糖修飾水平（在285mOsm/Kg時70%，345mOsm/Kg時40%）。細胞系由于二等分GlcNAc的加入使得ADCC活性增加。在CHO細胞中缺少相應的糖基轉運酶，缺失a-2,6-唾液酸；NS0細胞系增加a-1,3-半乳糖表位。細胞培養(yǎng)條件對于糖型的影響小結22:5181細胞培養(yǎng)條件研究DOE一般在藥物進入臨床II期研究，產品開始進行商業(yè)規(guī)模生產的時候，過程定性研究就要啟動。這部分工作至少需要12~15個月。完成過程定性研究工作后，才能開展的工藝放大，技術轉移和工藝驗證等后續(xù)工作。過程定性（processcharacterization）是對生物制藥生產過程進行系統(tǒng)的研究，旨在建立具有較強穩(wěn)健性（robust），柔順性（compliance）的生產工藝，滿足大規(guī)模工業(yè)生產對工藝開發(fā)的要求。這部分工作包括，對大規(guī)模生產過程進行預先的風險評估，研究過程操作參數(shù)對性能指標的影響,區(qū)分關鍵參數(shù)與非關鍵參數(shù)，確定操作參數(shù)的控制范圍,了解各操作參數(shù)之間的交互作用等。進行過程定性研究，如果在實際生產規(guī)模上進行試驗，不僅成本昂貴，而且不具操作性。目前主要采用“規(guī)模縮小模型”（saledownmodel），在實驗室內利用小型化生物反應器完成過程定性研究。22:5182細胞培養(yǎng)條件研究DOE在實驗室里利用“規(guī)?？s小模型”完成商業(yè)規(guī)模的生產過程定性研究，需要遵循嚴謹科學的程序。首先，要對以往批次數(shù)據的進行充分的挖掘、分析，在此基礎上，完成生產過程的風險評估，根據各操作參數(shù)對過程性能指標的影響程度，對其進行優(yōu)先級別排序。建立能夠充分模擬大規(guī)模生產過程的“規(guī)?？s小模型”22:5183細胞培養(yǎng)條件研究DOE在進行過程定性研究之前，首先需要對以往批次數(shù)據進行充分的挖掘分析。在此基礎上，對生產過程的不同環(huán)節(jié)（培養(yǎng)基、種子鏈及生產期）進行風險評估，這其中包括：潛在風險發(fā)生嚴重程度，風險發(fā)生的幾率，風險是否具有可檢測性等。通常使用危害分析與關鍵點控制(HACCP)、失敗模式和影響分析（Failuremodeandeffectsanalysis）、因果圖（cause-and-effectdiagrams）等工具對以上過程要素進行的風險評估。這其中FMEA是利用數(shù)字（1到10）對過程風險進行量化分級。MPN是綜合評價風險的嚴重程度，發(fā)生的幾率，以及風險是否具有可檢測性進行綜合評判。22:5184細胞培養(yǎng)條件研究DOE22:5185進行過程定性研究，首先需要建立一個能夠充分反映商業(yè)規(guī)模生產過程特點的“規(guī)?？s小模型”。該模型能夠在參數(shù)評價，工藝開發(fā)中，起到模擬商業(yè)規(guī)模生產的效果。當然，建立好一個“規(guī)?？s小模型”后，需要對其的“等效性”進行驗證。開展此工作的流程，首先確定需要進行規(guī)?？s小的操作參數(shù)，找出其中的關鍵參數(shù)，確定參數(shù)的可以接受的變化范圍。進行規(guī)模縮小模型試驗，判定該模型是否與其代表的大規(guī)模培養(yǎng)工藝具有等效性。細胞培養(yǎng)條件研究DOE22:5186細胞培養(yǎng)條件研究DOE細胞培養(yǎng)所涉及到的參數(shù)在進行規(guī)模縮小時，根據其縮小策略的不同，通?？梢苑譃閮深悺Ｒ活惻c體積密切相關的，如工作體積、流加體積，攪拌和通氣。一類是獨立于體積的參數(shù)，如pH、溶氧和溫度。對過程參數(shù)進行規(guī)模進行體積縮小時，非體積依賴型參數(shù)保持不變，體積依賴型參數(shù)則按照培養(yǎng)體積縮小的比例，進行線性遞減。但在實際工作中，受反應器的幾何尺寸，液體的表面體積比，以及操作可控能力等因素影響，某些體積依賴參數(shù)如反應器攪拌速率、通氣流量又不能簡單的理解為線性遞減22:5187體積非依賴型參數(shù)過程溫度pH接種體積(v/v)foreachstep流加策略氧氣傳遞速率二氧化碳去除速率消泡策略細胞培養(yǎng)條件研究DOE22:5188體積依賴型參數(shù)培養(yǎng)基滅菌前后體積變化流加速率空氣流量氧氣流量細胞培養(yǎng)條件研究DOE22:5189細胞培養(yǎng)條件研究DOE舉例：2LApplikon生化反應器模擬2,000L發(fā)酵罐時，各操作參數(shù)進行規(guī)?？s小時所采取的策略。

22:5190完成操作參數(shù)的規(guī)?？s小，建立了整個培養(yǎng)過程的“規(guī)模縮小模型”后，就需要對此模型進行驗證，以判定該模型與其所代表的商業(yè)培養(yǎng)規(guī)模是否具有等效性。驗證的方法是比較兩過程性能參數(shù)是否一致。據此來判定，建立的“規(guī)?？s小模型”是否成功。細胞培養(yǎng)過程的性能指標常被用來當做判定的依據。細胞培養(yǎng)條件研究DOE22:5191細胞培養(yǎng)條件研究DOE細胞生長情況可以通過比較生長曲線，或者直接比較細胞