備案號(hào)：60294-2018四倍體水稻光溫敏雄性核不育系選育技術(shù)規(guī)程2018-10-22實(shí)施2018-10-22實(shí)施湖北省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語(yǔ)與定義 14不育株篩選指標(biāo)檢驗(yàn)方法 14.1花粉不育度 14.2自交結(jié)實(shí)率與自交不實(shí)率 25不育系選育技術(shù) 25.1離體染色體加倍 5.1.1材料選擇 25.1.2外植體選擇 25.1.3愈傷組織誘導(dǎo) 25.1.4愈傷組織染色體加倍 25.1.5加倍愈傷組織分化出苗 25.1.6試管苗移栽 25.1.7倍性鑒定 35.2PMeS基因?qū)牍鉁孛粜坌圆挥?3 5.4回交后代中不育株的篩選 35.5具有PMeS基因的不育株選擇 35.6不育株系自交加代 5.7育性鑒定 3本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分；標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)與編寫》給出的規(guī)則起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別這些專利的責(zé)任。本標(biāo)準(zhǔn)由湖北大學(xué)提出。本標(biāo)準(zhǔn)由湖北省農(nóng)業(yè)廳歸口管理。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：湖北大學(xué)、武漢多倍體生物科技有限公司。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：宋兆建、蔡得田、張獻(xiàn)華、王維、劉育華、何玉池。凡是不注日期的引用文件，委最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。NY/T2306—2013花卉種苗組培快繁技術(shù)規(guī)程3術(shù)語(yǔ)與定義NV/T1215-20861Nv/T2306-2013-DB337752~2009界定的以及下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)四倍體Tetraploid指體細(xì)胞內(nèi)含有四個(gè)染色體組的生物體。4不育株篩選指標(biāo)檢驗(yàn)方法4.1花粉不育度每天上午取當(dāng)天將開花的穎花(花藥伸長(zhǎng)至穎花長(zhǎng)三分之二)進(jìn)行花粉育性鏡檢，每單株取3穗以上，每穗隨機(jī)取3~5朵穎花的混合花粉，用1%I?-KI溶液染色制片，每片選花粉粒100粒以上的代表性視野3個(gè)鏡檢計(jì)數(shù)各類花粉粒數(shù)。按深染(正?？捎ǚ?、淺染(染敗)、圓敗、典敗、無(wú)花粉5種歸類，計(jì)算花粉不育度(SP)。以不育期花粉不育度≥99.9%作為不育株篩選標(biāo)準(zhǔn)。2SP——花粉不育度；n1——單株檢出的不育花粉數(shù)(染敗數(shù)、圓敗數(shù)與典敗數(shù)之和);不育期自交不實(shí)率≥99.9%作為不育株篩選標(biāo)準(zhǔn)。n2——單株套袋自交結(jié)實(shí)粒數(shù)；N2——單株套袋自交總粒數(shù)。選擇光溫敏雄性核不育系植株二次枝梗至雌雄蕊形成期的幼穗或種胚等易于誘導(dǎo)的材料作為外植外植體經(jīng)75%酒精消毒處理30s~50s,倒去酒精，倒入2%次氯酸鈉溶液或0.1%氯化汞溶液浸泡10min~15min,倒去消毒液，無(wú)菌水沖洗3次~5次，將幼穗切碎(或?qū)⒎N胚切下，去除胚乳),接種至愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(N6+2,4-D1.5~2.0瓊脂7.5g/L,pH6.0)中，25℃暗培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織。挑選分裂旺盛的愈傷組織，轉(zhuǎn)接至加倍培養(yǎng)基(N6+2,4-D1.5~2.0mg/L+NAA1.0~2.0mg/L+6-BA0.3~0.5mg/L+蔗糖50g/L+秋水仙素5中振蕩培養(yǎng)48h;再將加倍后愈傷組織轉(zhuǎn)至新鮮愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中恢復(fù)培養(yǎng)7d~10d。I待組培苗高度3cm~5cm時(shí)，將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基(1/2MS+6-BA0.1~0.3mg/L+NAA0.3~0.5mg/L+活性炭0.3g/L+蔗糖20g/L+瓊脂7.5g/L,pH6.0)中，生根后經(jīng)煉苗，移栽至稻缽或大以光溫敏雄性核不育系四倍體植株為母本，與PMeS品系從中篩選出雄性不育植株，同時(shí)可兼顧不育植株的綜合性狀，5.5具有PMeS基因的不育株選擇將篩選得到的植株割蔸，并移至低溫短日照條件下栽培，按照4的方法和標(biāo)準(zhǔn)，考查其花粉