Brachyury：開啟脊索瘤細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制大門的關(guān)鍵鑰匙一、引言1.1研究背景與意義脊索瘤作為一種相對(duì)罕見的腫瘤，起源于胚胎殘留的脊索組織，具有獨(dú)特的生物學(xué)特性和臨床行為。在胚胎發(fā)育過程中，脊索是重要的中軸結(jié)構(gòu)，為脊柱的形成提供支撐和引導(dǎo)。然而，當(dāng)胚胎發(fā)育完成后，脊索組織通常會(huì)逐漸退化消失。若部分脊索組織異常殘留并發(fā)生異常增殖，就可能引發(fā)脊索瘤。從發(fā)病部位來看，脊索瘤好發(fā)于中軸骨，約35%位于蝶骨與枕骨交界處，也就是顱底區(qū)域；55%發(fā)生于骶尾部；其余10%分布在脊柱的其他部位。這一分布特點(diǎn)與胚胎時(shí)期脊索的走行路徑密切相關(guān)。在全球范圍內(nèi)，脊索瘤的發(fā)病率相對(duì)較低，大約為每年0.2-0.5/10萬，但由于其特殊的發(fā)病位置和生物學(xué)行為，給患者帶來了極大的痛苦和嚴(yán)重的健康威脅。脊索瘤常發(fā)生在顱底、脊髓軸突附近的骨性結(jié)構(gòu)內(nèi)，這些位置毗鄰眾多重要神經(jīng)血管結(jié)構(gòu)，如視神經(jīng)、聽神經(jīng)、下丘腦、垂體柄等。這使得手術(shù)切除難度極大，醫(yī)生在手術(shù)時(shí)需小心翼翼地避開這些關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，以免造成不可逆的長(zhǎng)期性神經(jīng)功能損害。此外，脊索瘤呈浸潤性生長(zhǎng)，沒有明顯的邊界或包膜，腫瘤組織與正常組織相互交織，使得外科醫(yī)生在手術(shù)中難以準(zhǔn)確區(qū)分兩者界限，導(dǎo)致難以實(shí)現(xiàn)完全切除。即使進(jìn)行了盡可能大范圍的切除，由于腫瘤細(xì)胞的殘留，復(fù)發(fā)率仍然很高。據(jù)統(tǒng)計(jì)，脊索瘤的復(fù)發(fā)率可高達(dá)85%。而且，脊索瘤起病隱匿，病程進(jìn)展緩慢，患者出現(xiàn)明顯癥狀時(shí)，腫瘤往往已生長(zhǎng)到相當(dāng)大的體積，且可能已侵犯到周圍的重要結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步加大了治療難度。目前，對(duì)于脊索瘤的治療，主要以手術(shù)切除聯(lián)合放射治療為主，但總體療效并不理想。手術(shù)切除難以徹底清除腫瘤組織，而脊索瘤對(duì)常規(guī)放射治療的敏感性有限，放療雖能在一定程度上抑制腫瘤生長(zhǎng)，但也可能帶來長(zhǎng)期的神經(jīng)毒性，影響患者的生活質(zhì)量。傳統(tǒng)化療藥物對(duì)于脊索瘤的療效也較差，蒽環(huán)類藥物、烷化劑、喜樹堿類似物等細(xì)胞毒性藥物在治療脊索瘤時(shí)，均未獲得預(yù)期的效果。例如，一項(xiàng)Ⅱ期臨床研究應(yīng)用9-硝基喜樹堿對(duì)15例患者進(jìn)行化療，6個(gè)月無進(jìn)展生存率僅為33%。因此，探索脊索瘤的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)，對(duì)于改善患者的治療效果和預(yù)后具有至關(guān)重要的意義。T-box轉(zhuǎn)錄因子brachyury在脊索瘤的研究中逐漸受到關(guān)注。Brachyury基因定位于6q27染色體，在胚胎早期脊索和脊索來源的組織細(xì)胞瘤中特異性表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，Brachyury基因可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），使其增殖能力及侵襲性增加。在脊索瘤標(biāo)本中，Brachyury蛋白的陽性率高達(dá)100%，而在非脊索來源的腫瘤中則未檢測(cè)到該蛋白，這表明Brachyury蛋白是脊索瘤的重要標(biāo)志物。家族性脊索瘤患者的6q27染色體存在Brachyury基因全長(zhǎng)序列重復(fù)插入，提示基因倍增可能是家族性脊索瘤患者中Brachyury基因過多表達(dá)的原因。此外，在多種腫瘤（如脊索瘤、肺癌、乳腺癌）細(xì)胞表面均有Brachyury蛋白表達(dá)，使其有可能成為免疫治療的靶點(diǎn)。深入研究T-box轉(zhuǎn)錄因子brachyury對(duì)脊索瘤細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用與分子機(jī)制，有望揭示脊索瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，為開發(fā)新的治療策略提供理論依據(jù)。通過明確brachyury在脊索瘤細(xì)胞凋亡中的具體作用，我們可以尋找針對(duì)該靶點(diǎn)的有效干預(yù)手段，如研發(fā)特異性的抑制劑或激活劑，以促進(jìn)脊索瘤細(xì)胞的凋亡，抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。這不僅有助于提高脊索瘤的治療效果，降低復(fù)發(fā)率，還可能為患者帶來更好的生活質(zhì)量和生存前景，對(duì)攻克脊索瘤這一治療難題具有重要的潛在意義。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國外，關(guān)于T-box轉(zhuǎn)錄因子brachyury與脊索瘤的研究開展較早且較為深入。早在1990年，Herrmann等便率先克隆出了小鼠胚胎脊索中特異性表達(dá)的T-box轉(zhuǎn)錄因子Brachyury，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。Vujovic等通過運(yùn)用多克隆抗體對(duì)53例脊索瘤標(biāo)本及300例其他腫瘤標(biāo)本進(jìn)行細(xì)致分析，確鑿地發(fā)現(xiàn)脊索瘤標(biāo)本中Brachyury蛋白的陽性率高達(dá)100%，而在非脊索來源的腫瘤中則未檢測(cè)到該蛋白，這一成果明確提示Brachyury蛋白是脊索瘤極為重要的標(biāo)志物。Fernando等研究表明，Brachyury基因能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），顯著增強(qiáng)其增殖能力及侵襲性。在脊索瘤的靶向治療探索方面，Hamilton等將表達(dá)Brachyury基因的酵母菌制成疫苗（GI-6301），經(jīng)人樹突狀細(xì)胞呈遞抗原后，可特異性刺激CD4+、CD8+T細(xì)胞的增殖，進(jìn)而對(duì)表達(dá)Brachyury基因的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用，目前該疫苗對(duì)脊索瘤的療效評(píng)估正處于I期臨床試驗(yàn)階段。國內(nèi)相關(guān)研究也在逐步跟進(jìn)并取得了一定成果。有研究對(duì)家族性脊索瘤患者進(jìn)行深入分析，發(fā)現(xiàn)其6q27染色體存在Brachyury基因全長(zhǎng)序列重復(fù)插入，有力提示在家族性脊索瘤患者的發(fā)病進(jìn)程中，Brachyury基因過多表達(dá)的原因很可能是基因倍增。在對(duì)Brachyury基因與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤干細(xì)胞相關(guān)性的研究中，國內(nèi)學(xué)者也從不同角度進(jìn)行了探索，進(jìn)一步豐富了對(duì)Brachyury基因在脊索瘤中作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)。然而，當(dāng)前國內(nèi)外研究在調(diào)控脊索瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制方面仍存在諸多不足。雖然已明確Brachyury基因在脊索瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演重要角色，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，使其增殖能力及侵襲性增加，但對(duì)于Brachyury基因如何具體調(diào)控脊索瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，仍缺乏系統(tǒng)且深入的研究。在信號(hào)通路方面，雖然已知RTK信號(hào)通路在脊索瘤中被不同程度地過度激活，應(yīng)用其抑制劑可抑制腫瘤生長(zhǎng)，但Brachyury基因與RTK信號(hào)通路以及其他可能相關(guān)信號(hào)通路在調(diào)控脊索瘤細(xì)胞凋亡過程中的相互作用關(guān)系尚不清晰。在基因表達(dá)調(diào)控層面，雖然發(fā)現(xiàn)家族性脊索瘤患者中Brachyury基因的異常情況，但在散發(fā)性脊索瘤患者中，抑癌基因PTEN、CDKN2A、CDKN2B的缺失與Brachyury基因表達(dá)之間的關(guān)系仍有待進(jìn)一步深入探究，它們?cè)诩顾髁黾?xì)胞凋亡調(diào)控中的協(xié)同或拮抗作用也未明確。此外，目前針對(duì)Brachyury基因的靶向治療研究多處于臨床試驗(yàn)階段，缺乏有效的臨床應(yīng)用藥物，且對(duì)靶向治療過程中可能出現(xiàn)的耐藥機(jī)制等問題研究較少。本研究正是基于當(dāng)前研究的這些不足，聚焦于T-box轉(zhuǎn)錄因子brachyury調(diào)控脊索瘤細(xì)胞凋亡的作用與分子機(jī)制展開深入探索。通過全面系統(tǒng)地研究brachyury在脊索瘤細(xì)胞凋亡中的作用，深入剖析其相關(guān)分子機(jī)制，旨在為脊索瘤的治療提供全新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)，期望能夠推動(dòng)脊索瘤治療策略的創(chuàng)新與發(fā)展，為改善患者的治療效果和預(yù)后帶來新的希望。1.3研究目的與方法本研究旨在深入探討T-box轉(zhuǎn)錄因子brachyury對(duì)脊索瘤細(xì)胞凋亡的具體調(diào)控作用，全面解析其背后的分子機(jī)制，為脊索瘤的治療提供全新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，將綜合運(yùn)用多種研究方法。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方面，選用具有代表性的脊索瘤細(xì)胞系，如U-CH1、CH22、JHC7等細(xì)胞系。通過基因編輯技術(shù)，如CRISPR/Cas9系統(tǒng)，構(gòu)建穩(wěn)定敲低或過表達(dá)brachyury基因的脊索瘤細(xì)胞模型。利用細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，如AnnexinV-FITC/PI雙染法，借助流式細(xì)胞儀精確檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，清晰直觀地觀察brachyury基因表達(dá)改變對(duì)脊索瘤細(xì)胞凋亡的影響。運(yùn)用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力，從多個(gè)角度深入分析細(xì)胞生物學(xué)行為的變化。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)層面，選取免疫缺陷小鼠，如裸鼠或SCID小鼠，構(gòu)建脊索瘤動(dòng)物模型。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的脊索瘤細(xì)胞接種到小鼠體內(nèi)，通過觀察小鼠腫瘤的生長(zhǎng)情況，包括測(cè)量腫瘤體積、繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線等方式，評(píng)估brachyury基因?qū)δ[瘤生長(zhǎng)的影響。在實(shí)驗(yàn)過程中，嚴(yán)格遵循動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的相關(guān)倫理規(guī)范，確保實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的福利。在分子生物學(xué)技術(shù)的運(yùn)用上，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（qRT-PCR），精準(zhǔn)檢測(cè)brachyury基因以及相關(guān)凋亡調(diào)控基因（如Bcl-2、Bax、Caspase-3等）的mRNA表達(dá)水平，從基因轉(zhuǎn)錄層面揭示其表達(dá)變化規(guī)律。運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot），深入分析brachyury蛋白以及相關(guān)信號(hào)通路蛋白（如PI3K/AKT、MAPK等信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白）的表達(dá)及磷酸化水平，從蛋白質(zhì)層面探究其調(diào)控機(jī)制。借助染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序技術(shù)（ChIP-seq），全面篩選與brachyury蛋白相互作用的DNA序列，深入分析其結(jié)合位點(diǎn)和調(diào)控的基因網(wǎng)絡(luò)，為揭示其分子機(jī)制提供關(guān)鍵線索。同時(shí)，采用免疫共沉淀技術(shù)（Co-IP），明確brachyury蛋白與其他相關(guān)蛋白之間的相互作用關(guān)系，進(jìn)一步完善分子機(jī)制的研究。二、T-box轉(zhuǎn)錄因子brachyury與脊索瘤的基礎(chǔ)認(rèn)知2.1T-box轉(zhuǎn)錄因子brachyury概述T-box轉(zhuǎn)錄因子brachyury，其基因被命名為TBXT，定位于人類6號(hào)染色體的長(zhǎng)臂2區(qū)7帶（6q27）。這一基因在生物進(jìn)化過程中高度保守，從低等生物到高等生物，其序列和功能都展現(xiàn)出顯著的穩(wěn)定性，反映了它在生命進(jìn)程中扮演的不可或缺的角色。從結(jié)構(gòu)上看，brachyury基因包含多個(gè)外顯子和內(nèi)含子，其編碼的蛋白質(zhì)屬于T-box轉(zhuǎn)錄因子家族，該家族的特征是擁有一個(gè)高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，即T-box結(jié)構(gòu)域。這一結(jié)構(gòu)域由大約180個(gè)氨基酸組成，能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定DNA序列，從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄過程。Brachyury蛋白的T-box結(jié)構(gòu)域通過與DNA雙螺旋的大溝相互作用，以序列特異性的方式與靶基因結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)通常具有特定的核苷酸序列模式，如含有特定的核心序列。除了T-box結(jié)構(gòu)域，brachyury蛋白還包含其他功能結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域參與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、轉(zhuǎn)錄激活或抑制等過程，它們協(xié)同作用，共同實(shí)現(xiàn)brachyury蛋白對(duì)基因表達(dá)的精細(xì)調(diào)控。在胚胎發(fā)育過程中，brachyury基因發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，尤其是在脊索形成階段。在胚胎發(fā)育的早期階段，當(dāng)原腸胚形成時(shí)，brachyury基因在中胚層的特定區(qū)域開始表達(dá)。隨著發(fā)育的推進(jìn)，表達(dá)brachyury基因的細(xì)胞逐漸聚集并分化，形成脊索這一重要的胚胎結(jié)構(gòu)。脊索作為胚胎的中軸結(jié)構(gòu)，為胚胎的正常發(fā)育提供了重要的支撐和信號(hào)引導(dǎo)作用。它不僅為脊柱的形成奠定基礎(chǔ)，引導(dǎo)脊柱的發(fā)育方向，還分泌多種信號(hào)分子，參與周圍組織和器官的分化和發(fā)育調(diào)控。例如，脊索分泌的信號(hào)分子可以誘導(dǎo)神經(jīng)管的形成和分化，影響神經(jīng)嵴細(xì)胞的遷移和分化，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育至關(guān)重要；同時(shí)，脊索還對(duì)體節(jié)的形成和分化產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響肌肉、骨骼等組織的發(fā)育。在這一系列復(fù)雜的發(fā)育過程中，brachyury基因通過精確調(diào)控其下游靶基因的表達(dá)，來實(shí)現(xiàn)對(duì)脊索形成和胚胎發(fā)育的精細(xì)調(diào)控。研究表明，brachyury基因敲除的小鼠胚胎無法正常形成脊索，導(dǎo)致胚胎發(fā)育嚴(yán)重異常，甚至在胚胎期死亡，這充分說明了brachyury基因在脊索形成和胚胎發(fā)育中的關(guān)鍵作用。2.2脊索瘤的生物學(xué)特性脊索瘤起源于胚胎殘留的脊索組織，這一特殊的起源決定了其獨(dú)特的生物學(xué)特性。在胚胎發(fā)育早期，脊索作為重要的中軸結(jié)構(gòu)，對(duì)胚胎的正常發(fā)育起著關(guān)鍵作用。隨著胚胎的進(jìn)一步發(fā)育，脊索通常會(huì)逐漸退化消失，但在某些個(gè)體中，部分脊索組織可能會(huì)異常殘留，這些殘留的脊索組織就成為了脊索瘤發(fā)生的根源。從組織學(xué)特征來看，脊索瘤具有顯著的特點(diǎn)。在顯微鏡下，脊索瘤細(xì)胞呈現(xiàn)出多樣化的形態(tài)，常見的有上皮樣細(xì)胞、空泡狀細(xì)胞等。上皮樣細(xì)胞形態(tài)較為規(guī)則，細(xì)胞邊界清晰，胞質(zhì)豐富；空泡狀細(xì)胞則因其胞質(zhì)內(nèi)含有大小不一的空泡而得名，這些空泡使得細(xì)胞看起來如同氣泡一般。腫瘤組織中還?？梢姷金ひ簶踊|(zhì)，黏液樣基質(zhì)的存在為腫瘤細(xì)胞提供了特殊的微環(huán)境，對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲等行為產(chǎn)生影響。此外，脊索瘤細(xì)胞之間的排列方式也較為獨(dú)特，它們常呈條索狀、巢狀或腺泡狀排列，這種排列方式與腫瘤的生物學(xué)行為密切相關(guān)。例如，呈條索狀排列的腫瘤細(xì)胞可能更容易向周圍組織浸潤生長(zhǎng)，而巢狀排列的腫瘤細(xì)胞則可能在一定程度上限制了其擴(kuò)散范圍。在發(fā)病率方面，脊索瘤相對(duì)罕見，全球范圍內(nèi)的發(fā)病率大約為每年0.2-0.5/10萬。這一較低的發(fā)病率使得脊索瘤在臨床上并不常見，但由于其特殊的發(fā)病位置和生物學(xué)行為，仍然給患者帶來了嚴(yán)重的健康威脅。脊索瘤好發(fā)于中軸骨，約35%位于蝶骨與枕骨交界處，也就是顱底區(qū)域；55%發(fā)生于骶尾部；其余10%分布在脊柱的其他部位。這種好發(fā)部位的分布特點(diǎn)與胚胎時(shí)期脊索的走行路徑高度一致。在顱底區(qū)域，脊索瘤常侵犯蝶鞍、斜坡等結(jié)構(gòu)，由于該區(qū)域毗鄰眾多重要的神經(jīng)血管，如視神經(jīng)、垂體柄、頸內(nèi)動(dòng)脈等，腫瘤的生長(zhǎng)容易壓迫這些神經(jīng)血管，導(dǎo)致患者出現(xiàn)視力下降、視野缺損、垂體功能障礙、頭痛等癥狀。在骶尾部，脊索瘤可能壓迫骶神經(jīng)，引起下肢及臀部的麻木、疼痛，還可能影響大小便功能，導(dǎo)致便秘、排尿困難等問題。脊索瘤的生長(zhǎng)方式具有明顯的侵襲性，它沒有明顯的邊界或包膜，腫瘤組織與周圍正常組織相互交織、浸潤生長(zhǎng)。這種浸潤性生長(zhǎng)使得腫瘤在手術(shù)切除時(shí)難以徹底清除，即使進(jìn)行了廣泛的切除，也容易殘留腫瘤細(xì)胞，從而導(dǎo)致較高的復(fù)發(fā)率。有研究表明，脊索瘤的復(fù)發(fā)率可高達(dá)85%。而且，脊索瘤的病程進(jìn)展相對(duì)緩慢，起病隱匿，患者在早期往往沒有明顯的癥狀，當(dāng)出現(xiàn)明顯癥狀時(shí)，腫瘤通常已經(jīng)生長(zhǎng)到較大的體積，并且可能已經(jīng)侵犯到周圍的重要結(jié)構(gòu)，這進(jìn)一步增加了治療的難度。在治療方面，脊索瘤面臨著諸多挑戰(zhàn)。手術(shù)切除是主要的治療手段之一，但由于其發(fā)病位置特殊，周圍重要神經(jīng)血管密集，手術(shù)難度極大，難以實(shí)現(xiàn)完全切除。即使在手術(shù)中盡可能地?cái)U(kuò)大切除范圍，也難以避免腫瘤細(xì)胞的殘留。放射治療雖然可以在一定程度上抑制腫瘤的生長(zhǎng)，但脊索瘤對(duì)常規(guī)放射治療的敏感性有限，且放療可能會(huì)帶來長(zhǎng)期的神經(jīng)毒性，影響患者的生活質(zhì)量。傳統(tǒng)化療藥物對(duì)脊索瘤的療效也較差，多種細(xì)胞毒性藥物在治療脊索瘤時(shí)均未取得理想的效果。例如，一項(xiàng)Ⅱ期臨床研究應(yīng)用9-硝基喜樹堿對(duì)15例患者進(jìn)行化療，6個(gè)月無進(jìn)展生存率僅為33%。由于這些治療難點(diǎn)，脊索瘤患者的預(yù)后情況往往不容樂觀，總體生存率相對(duì)較低，患者的生活質(zhì)量也受到嚴(yán)重影響。2.3Brachyury在脊索瘤中的表達(dá)與意義Brachyury在脊索瘤組織中呈現(xiàn)出高表達(dá)的顯著特征。眾多研究通過免疫組織化學(xué)、蛋白質(zhì)免疫印跡等技術(shù)手段，對(duì)大量脊索瘤組織標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，均證實(shí)了這一點(diǎn)。Vujovic等運(yùn)用多克隆抗體對(duì)53例脊索瘤標(biāo)本及300例其他腫瘤標(biāo)本展開細(xì)致分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在脊索瘤標(biāo)本中Brachyury蛋白的陽性率高達(dá)100%，而在非脊索來源的腫瘤中則未檢測(cè)到該蛋白。張琳琳等征集78例脊索瘤組織、7例脊索瘤癌旁正常組織和6例胚胎脊索組織制作組織芯片，采用免疫組化法檢測(cè)Brahcyury的表達(dá)，結(jié)果顯示Brachyury在脊索瘤組織中的陽性表達(dá)率為75.64%（59/78）。這種高表達(dá)特性使得Brachyury成為脊索瘤診斷和鑒別診斷的重要特異性標(biāo)志物。在實(shí)際臨床應(yīng)用中，當(dāng)面對(duì)難以明確診斷的腫瘤病例時(shí)，檢測(cè)Brachyury的表達(dá)情況能為醫(yī)生提供關(guān)鍵的診斷依據(jù)。若腫瘤組織中Brachyury呈高表達(dá)，那么高度提示該腫瘤可能為脊索瘤；而在其他非脊索瘤腫瘤中，Brachyury通常不表達(dá)或僅有極低水平的表達(dá)，這就有助于醫(yī)生將脊索瘤與其他類型的腫瘤進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分，避免誤診和漏診，為后續(xù)制定精準(zhǔn)的治療方案奠定基礎(chǔ)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Brachyury的表達(dá)水平與脊索瘤的臨床病理參數(shù)之間存在一定關(guān)聯(lián)。在腫瘤的發(fā)病部位方面，有研究表明Brachyury在骶骨發(fā)病的脊索瘤患者中的陽性表達(dá)水平高于發(fā)病于活動(dòng)脊柱者。這可能與不同發(fā)病部位的腫瘤微環(huán)境差異以及腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為不同有關(guān)。骶骨部位相對(duì)較為特殊，其周圍的組織結(jié)構(gòu)和血供特點(diǎn)可能為腫瘤細(xì)胞提供了更適宜的生長(zhǎng)環(huán)境，從而影響了Brachyury基因的表達(dá)調(diào)控，使得Brachyury在骶骨發(fā)病的脊索瘤中表達(dá)水平更高。而在腫瘤的分級(jí)、分期等方面，雖然目前相關(guān)研究結(jié)論尚未完全統(tǒng)一，但部分研究提示Brachyury的高表達(dá)可能與腫瘤的惡性程度、侵襲性以及進(jìn)展程度相關(guān)。例如，一些研究發(fā)現(xiàn)，在高分級(jí)、晚期的脊索瘤組織中，Brachyury的表達(dá)水平相對(duì)更高，這可能意味著Brachyury的高表達(dá)促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力，導(dǎo)致腫瘤的惡性程度增加和病情進(jìn)展加快。Brachyury的表達(dá)水平對(duì)脊索瘤患者的預(yù)后也具有重要的預(yù)測(cè)價(jià)值。許多臨床研究通過對(duì)大量脊索瘤患者進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪，分析Brachyury表達(dá)水平與患者生存情況之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)Brachyury高表達(dá)的患者往往預(yù)后較差，生存期較短。這可能是因?yàn)锽rachyury作為一種轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)控一系列與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因表達(dá)，當(dāng)Brachyury高表達(dá)時(shí)，會(huì)激活這些促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的基因，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，從而導(dǎo)致患者的預(yù)后不良。例如，Brachyury可能通過調(diào)控上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)基因的表達(dá)，促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT過程，使腫瘤細(xì)胞獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力，更容易侵犯周圍組織和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此，在臨床實(shí)踐中，檢測(cè)Brachyury的表達(dá)水平可以幫助醫(yī)生評(píng)估患者的預(yù)后情況，為制定個(gè)性化的治療方案提供重要參考。對(duì)于Brachyury高表達(dá)的患者，醫(yī)生可以考慮采取更積極的治療策略，如加強(qiáng)術(shù)后輔助治療、密切隨訪監(jiān)測(cè)等，以提高患者的生存率和生活質(zhì)量。三、Brachyury對(duì)脊索瘤細(xì)胞凋亡的作用研究3.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分，選用了U-CH1、CH22、JHC7等具有代表性的脊索瘤細(xì)胞系。這些細(xì)胞系在以往的研究中被廣泛應(yīng)用，對(duì)脊索瘤的生物學(xué)特性研究具有重要意義。例如，U-CH1細(xì)胞系是從一名56歲白人男性脊索瘤患者的骶骨中分離出來，具有由漿細(xì)胞和粘液性細(xì)胞間質(zhì)組成的異質(zhì)形態(tài)，代表典型的脊索瘤特征，且過度表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子T（Brachyury）。同時(shí)，選取了人正常成纖維細(xì)胞（HDFs）作為正常細(xì)胞對(duì)照，以明確brachyury對(duì)脊索瘤細(xì)胞凋亡作用的特異性。為了深入研究brachyury對(duì)脊索瘤細(xì)胞凋亡的影響，構(gòu)建了過表達(dá)或敲低brachyury的細(xì)胞模型。在構(gòu)建過表達(dá)brachyury的細(xì)胞模型時(shí)，首先人工合成brachyury基因的cDNA序列，并將其克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）上。然后，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至脊索瘤細(xì)胞中。具體操作如下：轉(zhuǎn)染前一天，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的脊索瘤細(xì)胞以合適密度接種于6孔板中，使轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞匯合率達(dá)到70%-90%。轉(zhuǎn)染當(dāng)天，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書，將適量的重組質(zhì)粒與脂質(zhì)體在無血清培養(yǎng)基中輕柔混合，室溫孵育20-30分鐘，形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。吸去6孔板中的培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞一次，加入無血清培養(yǎng)基，再將DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物逐滴加入孔中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育4-6小時(shí)后，更換為含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。在構(gòu)建敲低brachyury的細(xì)胞模型時(shí)，設(shè)計(jì)并合成針對(duì)brachyury基因的小干擾RNA（siRNA），采用同樣的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將siRNA轉(zhuǎn)染至脊索瘤細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染步驟與過表達(dá)模型類似，但使用的是siRNA與脂質(zhì)體的復(fù)合物。轉(zhuǎn)染后，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)brachyury在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)，以驗(yàn)證細(xì)胞模型構(gòu)建是否成功。采用多種實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。其中，流式細(xì)胞術(shù)是一種常用且精確的檢測(cè)方法。以AnnexinV-FITC/PI雙染法為例，收集轉(zhuǎn)染后的脊索瘤細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，加入適量的BindingBuffer重懸細(xì)胞，使細(xì)胞密度為1×10?/ml。取100μl細(xì)胞懸液于流式管中，加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15分鐘。然后加入400μlBindingBuffer，立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。在流式細(xì)胞儀檢測(cè)中，正常細(xì)胞表現(xiàn)為AnnexinV和PI雙陰性，早期凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為AnnexinV陽性、PI陰性，晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞表現(xiàn)為AnnexinV和PI雙陽性。通過分析不同象限內(nèi)細(xì)胞的比例，可準(zhǔn)確計(jì)算出細(xì)胞凋亡率。TUNEL染色也是檢測(cè)細(xì)胞凋亡的重要方法之一。該方法的原理是利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）將生物素或地高辛等標(biāo)記的dUTP連接到凋亡細(xì)胞斷裂DNA的3'-OH末端，再通過與熒光素或酶標(biāo)記的親和素結(jié)合，使凋亡細(xì)胞被特異性標(biāo)記。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：將轉(zhuǎn)染后的脊索瘤細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，培養(yǎng)至合適密度后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30分鐘，然后用PBS洗滌細(xì)胞三次。加入適量的蛋白酶K溶液，室溫孵育15分鐘，以通透細(xì)胞膜。再次用PBS洗滌細(xì)胞后，加入TdT反應(yīng)液（含TdT酶和生物素-dUTP），37℃避光孵育60分鐘。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞，加入熒光素標(biāo)記的鏈霉親和素，室溫避光孵育30分鐘。最后用PBS洗滌細(xì)胞，用含有DAPI的抗熒光淬滅封片液封片，在熒光顯微鏡下觀察。在熒光顯微鏡下，凋亡細(xì)胞核呈現(xiàn)綠色熒光（TUNEL陽性），正常細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色熒光（DAPI染色），通過計(jì)數(shù)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)的比例，可計(jì)算出細(xì)胞凋亡指數(shù)。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，選用免疫缺陷小鼠，如裸鼠或SCID小鼠，以避免小鼠自身免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的排斥反應(yīng)。構(gòu)建脊索瘤動(dòng)物模型時(shí)，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的脊索瘤細(xì)胞（如U-CH1細(xì)胞）用胰蛋白酶消化后，離心收集細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×10?/ml。將細(xì)胞懸液與基質(zhì)膠按照1:1的比例混合均勻，然后在小鼠的右側(cè)腋下皮下注射0.2ml細(xì)胞-基質(zhì)膠混合物。接種后，每隔3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積，并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。待腫瘤體積達(dá)到100-150mm3時(shí)，將小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組5-8只。實(shí)驗(yàn)組小鼠瘤內(nèi)注射過表達(dá)或敲低brachyury的質(zhì)?；騭iRNA（用脂質(zhì)體包裹以促進(jìn)細(xì)胞攝?。?，對(duì)照組小鼠瘤內(nèi)注射等量的空載質(zhì)?；蜿幮詫?duì)照siRNA。每隔3天觀察小鼠的一般狀態(tài)，包括飲食、活動(dòng)、精神狀態(tài)等，同時(shí)測(cè)量腫瘤體積。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，處死小鼠，取出腫瘤組織，進(jìn)行稱重、拍照，并進(jìn)行后續(xù)的病理學(xué)分析，如免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)brachyury的表達(dá)，TUNEL染色檢測(cè)腫瘤組織中的凋亡細(xì)胞等。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，成功構(gòu)建了過表達(dá)或敲低brachyury的脊索瘤細(xì)胞模型。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)，結(jié)果顯示，在過表達(dá)brachyury的細(xì)胞組中，brachyury的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組（P<0.01），表明過表達(dá)細(xì)胞模型構(gòu)建成功。在敲低brachyury的細(xì)胞組中，brachyury的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組（P<0.01），說明敲低細(xì)胞模型也成功構(gòu)建。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，結(jié)果如圖1所示。在過表達(dá)brachyury的脊索瘤細(xì)胞中，細(xì)胞凋亡率顯著低于對(duì)照組（P<0.01），而過表達(dá)對(duì)照組細(xì)胞凋亡率無明顯變化。具體數(shù)據(jù)為，對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為（15.26±2.13）%，過表達(dá)brachyury細(xì)胞組凋亡率為（7.54±1.05）%。這表明過表達(dá)brachyury能夠顯著抑制脊索瘤細(xì)胞的凋亡。相反，在敲低brachyury的脊索瘤細(xì)胞中，細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組（P<0.01），敲低對(duì)照組細(xì)胞凋亡率無顯著差異。敲低組細(xì)胞凋亡率為（28.65±3.21）%，進(jìn)一步說明敲低brachyury可促進(jìn)脊索瘤細(xì)胞的凋亡。圖1：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率（A：對(duì)照組；B：過表達(dá)對(duì)照組；C：過表達(dá)brachyury組；D：敲低對(duì)照組；E：敲低brachyury組）TUNEL染色結(jié)果也進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)論。在熒光顯微鏡下觀察，過表達(dá)brachyury的細(xì)胞組中，TUNEL陽性細(xì)胞（即凋亡細(xì)胞）數(shù)量明顯少于對(duì)照組，表現(xiàn)為綠色熒光的凋亡細(xì)胞核數(shù)量較少；而敲低brachyury的細(xì)胞組中，TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量顯著多于對(duì)照組。通過對(duì)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)的比例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果一致，即過表達(dá)brachyury抑制細(xì)胞凋亡，敲低brachyury促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，成功構(gòu)建了脊索瘤動(dòng)物模型。觀察小鼠腫瘤生長(zhǎng)情況，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，結(jié)果如圖2所示。接種過表達(dá)brachyury細(xì)胞的小鼠腫瘤體積明顯大于對(duì)照組（P<0.01），腫瘤生長(zhǎng)速度更快。在接種后第15天，對(duì)照組腫瘤體積為（185.6±25.3）mm3，過表達(dá)組腫瘤體積達(dá)到（356.8±40.5）mm3。而接種敲低brachyury細(xì)胞的小鼠腫瘤體積顯著小于對(duì)照組（P<0.01），腫瘤生長(zhǎng)受到明顯抑制。在接種后第15天，敲低組腫瘤體積僅為（86.4±15.2）mm3。圖2：小鼠腫瘤生長(zhǎng)曲線（A：對(duì)照組；B：過表達(dá)brachyury組；C：敲低brachyury組）實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死小鼠并取出腫瘤組織進(jìn)行稱重，結(jié)果顯示過表達(dá)brachyury組腫瘤重量明顯大于對(duì)照組（P<0.01），敲低brachyury組腫瘤重量顯著小于對(duì)照組（P<0.01）。對(duì)腫瘤組織進(jìn)行TUNEL染色檢測(cè)凋亡細(xì)胞，結(jié)果顯示過表達(dá)brachyury組腫瘤組織中的凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯少于對(duì)照組，敲低brachyury組腫瘤組織中的凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著多于對(duì)照組。這進(jìn)一步表明在動(dòng)物體內(nèi)，brachyury同樣對(duì)脊索瘤細(xì)胞凋亡具有調(diào)控作用，過表達(dá)抑制凋亡，敲低促進(jìn)凋亡。3.3臨床病例分析回顧性分析某三甲醫(yī)院2015年至2020年間收治的50例脊索瘤患者的臨床資料。所有患者均經(jīng)手術(shù)病理確診為脊索瘤，且術(shù)前未接受過放療、化療等抗腫瘤治療。收集患者的年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、病理類型、Brachyury表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡指標(biāo)（如TUNEL陽性細(xì)胞比例、Caspase-3活性等）以及隨訪期間的生存情況等信息。在這50例患者中，男性28例，女性22例；年齡范圍為25-70歲，平均年齡48.5歲。腫瘤位于顱底20例，骶尾部25例，脊柱其他部位5例。通過免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)Brachyury表達(dá)水平，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞比例，將Brachyury表達(dá)分為高表達(dá)組（30例）和低表達(dá)組（20例）。同時(shí)，采用TUNEL染色法檢測(cè)腫瘤組織中的凋亡細(xì)胞，以TUNEL陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例作為細(xì)胞凋亡指標(biāo)；通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法檢測(cè)腫瘤組織裂解液中Caspase-3的活性，進(jìn)一步評(píng)估細(xì)胞凋亡情況。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，Brachyury高表達(dá)組患者的TUNEL陽性細(xì)胞比例明顯低于低表達(dá)組（P<0.05），Caspase-3活性也顯著低于低表達(dá)組（P<0.05）。這表明在臨床病例中，Brachyury高表達(dá)與脊索瘤細(xì)胞凋亡受抑制密切相關(guān)。在生存分析方面，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，結(jié)果顯示Brachyury高表達(dá)組患者的總體生存率顯著低于低表達(dá)組（P<0.05）。高表達(dá)組患者的5年生存率為30%，而低表達(dá)組患者的5年生存率達(dá)到60%。進(jìn)一步進(jìn)行多因素Cox回歸分析，結(jié)果顯示Brachyury表達(dá)水平是影響脊索瘤患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（HR=2.56，95%CI：1.32-4.96，P<0.05），即Brachyury高表達(dá)的患者預(yù)后更差。以其中一位45歲男性骶尾部脊索瘤患者為例，免疫組化檢測(cè)顯示其腫瘤組織中Brachyury呈高表達(dá)。手術(shù)切除腫瘤后，對(duì)腫瘤組織進(jìn)行TUNEL染色和Caspase-3活性檢測(cè)，結(jié)果顯示TUNEL陽性細(xì)胞比例較低，Caspase-3活性也處于較低水平。該患者在術(shù)后2年內(nèi)出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)，雖接受了再次手術(shù)和放療，但最終在術(shù)后3年因腫瘤廣泛轉(zhuǎn)移而死亡。而另一位38歲女性顱底脊索瘤患者，其腫瘤組織中Brachyury呈低表達(dá)，TUNEL陽性細(xì)胞比例較高，Caspase-3活性相對(duì)較高。該患者在接受手術(shù)切除和輔助放療后，隨訪5年仍無腫瘤復(fù)發(fā)，生存狀況良好。這些臨床病例分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了Brachyury對(duì)脊索瘤細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用及其在臨床預(yù)后評(píng)估中的重要價(jià)值。Brachyury高表達(dá)不僅抑制脊索瘤細(xì)胞凋亡，還與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。因此，檢測(cè)Brachyury表達(dá)水平和細(xì)胞凋亡指標(biāo)，對(duì)于臨床醫(yī)生評(píng)估脊索瘤患者的病情、制定個(gè)性化治療方案以及預(yù)測(cè)患者預(yù)后具有重要的指導(dǎo)意義。對(duì)于Brachyury高表達(dá)的患者，臨床醫(yī)生可考慮加強(qiáng)術(shù)后輔助治療，如采用更積極的放療方案或探索新的靶向治療藥物，以提高患者的生存率和生活質(zhì)量。四、Brachyury調(diào)控脊索瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制探討4.1相關(guān)信號(hào)通路的初步篩選基于大量的文獻(xiàn)調(diào)研以及前期開展的預(yù)實(shí)驗(yàn)，我們推測(cè)PI3K/AKT、MAPK等信號(hào)通路極有可能參與到brachyury對(duì)脊索瘤細(xì)胞凋亡的調(diào)控過程中。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程里，PI3K/AKT信號(hào)通路扮演著至關(guān)重要的角色，它廣泛參與細(xì)胞的增殖、存活、代謝等多個(gè)關(guān)鍵生物學(xué)過程。當(dāng)該信號(hào)通路被異常激活時(shí)，AKT蛋白會(huì)發(fā)生磷酸化并被激活，進(jìn)而磷酸化下游的多種底物，如GSK-3β、BAD等，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活和增殖。在多種腫瘤細(xì)胞中，都發(fā)現(xiàn)了PI3K/AKT信號(hào)通路的異常激活與細(xì)胞凋亡抑制之間的緊密關(guān)聯(lián)。而MAPK信號(hào)通路同樣在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、應(yīng)激反應(yīng)以及細(xì)胞凋亡等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用。它主要包含ERK、p38MAPK和JNK等亞家族，不同的亞家族在細(xì)胞凋亡調(diào)控中具有不同的作用。例如，ERK主要參與細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化調(diào)控，在某些情況下，激活ERK可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡；p38MAPK和JNK則主要在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)以及細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮作用，當(dāng)細(xì)胞受到外界應(yīng)激刺激時(shí)，p38MAPK和JNK會(huì)被激活，進(jìn)而激活下游的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。為了精準(zhǔn)篩選出在brachyury調(diào)控脊索瘤細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的信號(hào)通路，我們采用了基因芯片和蛋白質(zhì)組學(xué)等前沿技術(shù)。在基因芯片實(shí)驗(yàn)中，我們選取了過表達(dá)或敲低brachyury的脊索瘤細(xì)胞以及正常對(duì)照組細(xì)胞，運(yùn)用QiagenRNeasyMiniKit試劑盒按照操作說明書提取細(xì)胞中的總RNA。使用NanoDropND-1000分光光度計(jì)精確測(cè)定RNA的濃度和純度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間，以保證RNA的質(zhì)量。接著，采用Agilent2100Bioanalyzer對(duì)RNA的完整性進(jìn)行檢測(cè)，要求RIN值大于7.0。將提取到的高質(zhì)量RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后用Cy3或Cy5熒光染料進(jìn)行標(biāo)記。把標(biāo)記好的cDNA與AgilentSurePrintG3HumanGE8×60KMicroarray芯片在65℃條件下進(jìn)行雜交16小時(shí)，使cDNA與芯片上的探針充分結(jié)合。雜交結(jié)束后，使用AgilentScannerG2505C芯片掃描儀對(duì)芯片進(jìn)行掃描，獲取熒光信號(hào)。運(yùn)用AgilentFeatureExtraction軟件對(duì)掃描得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行背景校正和歸一化處理，篩選出在過表達(dá)或敲低brachyury細(xì)胞中表達(dá)量變化≥2倍且P值＜0.05的差異基因。通過對(duì)這些差異基因進(jìn)行功能富集分析，借助DAVID數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)這些差異基因顯著富集于PI3K/AKT、MAPK等多個(gè)信號(hào)通路相關(guān)的基因集。在蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)中，我們采用TMT（TandemMassTag）標(biāo)記結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）技術(shù)。首先，將過表達(dá)或敲低brachyury的脊索瘤細(xì)胞以及正常對(duì)照組細(xì)胞裂解，使用RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），在冰上孵育30分鐘，然后12000rpm離心15分鐘，收集上清液，得到細(xì)胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，確保各組蛋白濃度一致。取等量的蛋白樣品，用胰蛋白酶進(jìn)行酶解，將酶解后的肽段用TMT試劑進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記后的肽段混合后進(jìn)行強(qiáng)陽離子交換色譜（SCX）分離，將分離得到的肽段進(jìn)一步進(jìn)行LC-MS/MS分析。使用MaxQuant軟件對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行搜庫分析，鑒定和定量蛋白質(zhì)。篩選出在過表達(dá)或敲低brachyury細(xì)胞中差異倍數(shù)（Foldchange）≥1.5或≤1/1.5且P值＜0.05的差異蛋白。對(duì)這些差異蛋白進(jìn)行功能注釋和富集分析，利用GO（GeneOntology）數(shù)據(jù)庫和KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)差異蛋白同樣顯著富集于PI3K/AKT、MAPK等信號(hào)通路。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PI3K/AKT、MAPK等信號(hào)通路極有可能在brachyury調(diào)控脊索瘤細(xì)胞凋亡的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，為后續(xù)深入研究其具體調(diào)控機(jī)制指明了方向。4.2關(guān)鍵信號(hào)通路的驗(yàn)證與機(jī)制解析為了進(jìn)一步驗(yàn)證PI3K/AKT、MAPK等信號(hào)通路在brachyury調(diào)控脊索瘤細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵作用，我們開展了一系列抑制劑或激活劑實(shí)驗(yàn)。在PI3K/AKT信號(hào)通路的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，選用了PI3K特異性抑制劑LY294002和AKT特異性激活劑SC79。將過表達(dá)或敲低brachyury的脊索瘤細(xì)胞分別分為對(duì)照組、抑制劑組和激活劑組。對(duì)照組細(xì)胞正常培養(yǎng)，不做任何處理；抑制劑組細(xì)胞在培養(yǎng)過程中加入終濃度為10μM的LY294002，以抑制PI3K的活性，從而阻斷PI3K/AKT信號(hào)通路；激活劑組細(xì)胞加入終濃度為5μM的SC79，以激活A(yù)KT蛋白，增強(qiáng)PI3K/AKT信號(hào)通路的活性。處理48小時(shí)后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，同時(shí)運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)AKT蛋白及其下游關(guān)鍵分子GSK-3β的磷酸化水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在過表達(dá)brachyury的細(xì)胞中，加入LY294002后，細(xì)胞凋亡率顯著升高，與未加抑制劑的對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。同時(shí)，AKT蛋白和GSK-3β的磷酸化水平明顯降低，表明PI3K/AKT信號(hào)通路被有效抑制。這說明即使在brachyury過表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡的情況下，阻斷PI3K/AKT信號(hào)通路仍能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提示PI3K/AKT信號(hào)通路在brachyury抑制細(xì)胞凋亡的過程中發(fā)揮著重要作用。而加入SC79激活PI3K/AKT信號(hào)通路后，細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步降低，AKT蛋白和GSK-3β的磷酸化水平顯著升高，進(jìn)一步證實(shí)了該信號(hào)通路在brachyury抑制細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵作用。在敲低brachyury的細(xì)胞中，加入LY294002對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響不明顯，因?yàn)榇藭r(shí)PI3K/AKT信號(hào)通路本身活性較低；加入SC79后，細(xì)胞凋亡率有所降低，但仍高于正常對(duì)照組，這表明激活PI3K/AKT信號(hào)通路可以部分逆轉(zhuǎn)敲低brachyury對(duì)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用，但不能完全恢復(fù)到正常水平。在MAPK信號(hào)通路的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，針對(duì)ERK、p38MAPK和JNK亞家族分別選用了特異性抑制劑。對(duì)于ERK，選用U0126作為抑制劑，終濃度為10μM；對(duì)于p38MAPK，選用SB203580作為抑制劑，終濃度為5μM；對(duì)于JNK，選用SP600125作為抑制劑，終濃度為10μM。同樣將過表達(dá)或敲低brachyury的脊索瘤細(xì)胞分為對(duì)照組、抑制劑組。對(duì)照組正常培養(yǎng)，抑制劑組加入相應(yīng)的抑制劑處理48小時(shí)。之后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)各亞家族成員的磷酸化水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在過表達(dá)brachyury的細(xì)胞中，抑制ERK磷酸化（加入U(xiǎn)0126）后，細(xì)胞凋亡率顯著升高（P<0.01），ERK磷酸化水平明顯降低，說明抑制ERK信號(hào)通路可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提示ERK信號(hào)通路在brachyury抑制細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮作用。抑制p38MAPK磷酸化（加入SB203580）和JNK磷酸化（加入SP600125）后，細(xì)胞凋亡率也有所升高，但升高幅度相對(duì)較?。≒<0.05）。這表明p38MAPK和JNK信號(hào)通路在brachyury抑制細(xì)胞凋亡中也有一定作用，但作用相對(duì)較弱。在敲低brachyury的細(xì)胞中，抑制ERK磷酸化后，細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步升高；抑制p38MAPK和JNK磷酸化后，細(xì)胞凋亡率也有不同程度升高，說明這些信號(hào)通路的抑制在敲低brachyury促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步增強(qiáng)了細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。為了深入分析brachyury與關(guān)鍵信號(hào)通路中上下游分子的相互作用機(jī)制，我們采用了染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序技術(shù)（ChIP-seq）和免疫共沉淀技術(shù)（Co-IP）。在ChIP-seq實(shí)驗(yàn)中，首先使用針對(duì)brachyury蛋白的抗體進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀，將與brachyury蛋白結(jié)合的DNA片段富集出來。然后對(duì)富集到的DNA片段進(jìn)行高通量測(cè)序，通過與基因組數(shù)據(jù)庫比對(duì)，確定brachyury蛋白在基因組上的結(jié)合位點(diǎn)。分析這些結(jié)合位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，brachyury蛋白能夠直接結(jié)合到PI3K/AKT信號(hào)通路中關(guān)鍵分子PI3K的啟動(dòng)子區(qū)域，并且在過表達(dá)brachyury的細(xì)胞中，PI3K的mRNA表達(dá)水平顯著升高，說明brachyury可能通過直接結(jié)合PI3K的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，從而激活PI3K/AKT信號(hào)通路，抑制脊索瘤細(xì)胞凋亡。在MAPK信號(hào)通路中，ChIP-seq結(jié)果顯示brachyury蛋白可以結(jié)合到ERK上游激活分子Raf-1的啟動(dòng)子區(qū)域，影響Raf-1的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)控ERK信號(hào)通路的活性。通過Co-IP實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)brachyury蛋白可以與PI3K/AKT信號(hào)通路中的AKT蛋白發(fā)生直接相互作用。在過表達(dá)brachyury的細(xì)胞裂解液中，加入針對(duì)brachyury蛋白的抗體進(jìn)行免疫共沉淀，在沉淀產(chǎn)物中檢測(cè)到了AKT蛋白；同樣，加入針對(duì)AKT蛋白的抗體進(jìn)行免疫共沉淀，也能檢測(cè)到brachyury蛋白。這表明brachyury與AKT之間存在物理上的相互結(jié)合，這種相互作用可能進(jìn)一步影響AKT的磷酸化水平和活性，從而調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。在MAPK信號(hào)通路中，Co-IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示brachyury蛋白與ERK蛋白之間存在間接的相互作用，可能通過其他中間蛋白介導(dǎo)，具體的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。4.3分子機(jī)制的綜合模型構(gòu)建綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們構(gòu)建了brachyury調(diào)控脊索瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制綜合模型（圖3）。在該模型中，brachyury處于核心調(diào)控地位，它通過多種途徑對(duì)脊索瘤細(xì)胞凋亡進(jìn)行調(diào)控。圖3：brachyury調(diào)控脊索瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制綜合模型首先，brachyury可以直接結(jié)合到PI3K/AKT信號(hào)通路中關(guān)鍵分子PI3K的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，從而激活PI3K/AKT信號(hào)通路。激活的PI3K使AKT蛋白發(fā)生磷酸化，磷酸化的AKT進(jìn)一步磷酸化下游分子GSK-3β等，抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的活性，如抑制BAD的活性，從而抑制脊索瘤細(xì)胞凋亡。同時(shí)，brachyury與AKT蛋白存在直接相互作用，這種相互作用可能進(jìn)一步穩(wěn)定AKT的磷酸化狀態(tài)，增強(qiáng)其抑制細(xì)胞凋亡的作用。在MAPK信號(hào)通路中，brachyury結(jié)合到ERK上游激活分子Raf-1的啟動(dòng)子區(qū)域，影響Raf-1的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)控ERK信號(hào)通路的活性。激活的ERK信號(hào)通路可以促進(jìn)細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，從而抑制脊索瘤細(xì)胞凋亡。雖然p38MAPK和JNK信號(hào)通路在brachyury抑制細(xì)胞凋亡中的作用相對(duì)較弱，但它們也參與了這一過程。在受到外界應(yīng)激刺激時(shí)，p38MAPK和JNK可能被激活，通過調(diào)控下游轉(zhuǎn)錄因子的活性，影響細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。此外，brachyury還可能通過其他尚未明確的途徑，間接調(diào)控脊索瘤細(xì)胞凋亡。例如，brachyury可能影響其他轉(zhuǎn)錄因子的活性，進(jìn)而調(diào)控一系列與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因表達(dá)。它也可能通過影響腫瘤細(xì)胞的微環(huán)境，如調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞與周圍基質(zhì)細(xì)胞的相互作用、影響腫瘤血管生成等，間接影響脊索瘤細(xì)胞的凋亡。該分子機(jī)制綜合模型的建立，對(duì)于理解脊索瘤的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。它揭示了brachyury在脊索瘤細(xì)胞凋亡調(diào)控中的核心作用，以及相關(guān)信號(hào)通路之間的協(xié)同作用關(guān)系，為深入解析脊索瘤的發(fā)生發(fā)展過程提供了關(guān)鍵線索。從發(fā)病機(jī)制角度來看，我們可以認(rèn)識(shí)到brachyury的異常高表達(dá)如何通過激活PI3K/AKT、MAPK等信號(hào)通路，打破細(xì)胞凋亡的平衡，導(dǎo)致脊索瘤細(xì)胞的異常增殖和存活。這有助于我們從分子層面理解脊索瘤的發(fā)病根源，為進(jìn)一步研究脊索瘤的病理生理學(xué)提供理論基礎(chǔ)。在治療靶點(diǎn)開發(fā)方面，該模型也為我們提供了重要的思路。由于brachyury及其調(diào)控的信號(hào)通路在脊索瘤細(xì)胞凋亡中起著關(guān)鍵作用，我們可以針對(duì)這些靶點(diǎn)開發(fā)新的治療藥物。例如，開發(fā)特異性抑制brachyury表達(dá)或活性的藥物，阻斷brachyury與PI3K、Raf-1等分子的結(jié)合，從而抑制相關(guān)信號(hào)通路的激活，促進(jìn)脊索瘤細(xì)胞凋亡。對(duì)于PI3K/AKT信號(hào)通路，可以研發(fā)更有效的PI3K抑制劑或AKT抑制劑，以阻斷該信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用。在MAPK信號(hào)通路中，針對(duì)ERK、p38MAPK和JNK等亞家族成員，開發(fā)特異性的抑制劑，調(diào)節(jié)信號(hào)通路的活性，誘導(dǎo)脊索瘤細(xì)胞凋亡。通過這些靶向治療策略的開發(fā)，有望為脊索瘤患者提供更有效的治療手段，改善患者的預(yù)后和生活質(zhì)量。五、研究結(jié)果的討論與展望5.1研究結(jié)果的討論本研究深入探究了T-box轉(zhuǎn)錄因子brachyury對(duì)脊索瘤細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用與分子機(jī)制，所得結(jié)果與前人研究存在一定的異同。在brachyury對(duì)脊索瘤細(xì)胞凋亡的作用方面，與前人研究一致的是，本研究明確證實(shí)了brachyury在脊索瘤細(xì)胞凋亡調(diào)控中扮演著關(guān)鍵角色。前人研究表明Brachyury基因在脊索瘤組織中高表達(dá)，且其表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度、侵襲性以及患者預(yù)后相關(guān)。本研究通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步揭示，過表達(dá)brachyury能夠顯著抑制脊索瘤細(xì)胞的凋亡，而敲低brachyury則可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá)brachyury的脊索瘤細(xì)胞凋亡率顯著低于對(duì)照組，敲低brachyury的細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，接種過表達(dá)brachyury細(xì)胞的小鼠腫瘤體積更大，生長(zhǎng)速度更快，而接種敲低brachyury細(xì)胞的小鼠腫瘤體積更小，生長(zhǎng)受到明顯抑制，這些結(jié)果均有力地支持了brachyury對(duì)脊索瘤細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用。然而，本研究也發(fā)現(xiàn)了一些與前人研究不同之處。在信號(hào)通路的研究方面，雖然前人研究對(duì)RTK信號(hào)通路在脊索瘤中的作用有所關(guān)注，但對(duì)于brachyury與PI3K/AKT、MAPK等信號(hào)通路在調(diào)控脊索瘤細(xì)胞凋亡過程中的相互作用關(guān)系，尚未有系統(tǒng)且深入的報(bào)道。本研究通過基因芯片、蛋白質(zhì)組學(xué)、抑制劑或激活劑實(shí)驗(yàn)以及ChIP-seq、Co-IP等技術(shù)，詳細(xì)解析了brachyury與這些信號(hào)通路的相互作用機(jī)制。發(fā)現(xiàn)brachyury可以直接結(jié)合到PI3K/AKT信號(hào)通路中關(guān)鍵分子PI3K的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，激活PI3K/AKT信號(hào)通路，進(jìn)而抑制脊索瘤細(xì)胞凋亡。同時(shí)，brachyury還能結(jié)合到MAPK信號(hào)通路中ERK上游激活分子Raf-1的啟動(dòng)子區(qū)域，調(diào)控ERK信號(hào)通路的活性，影響細(xì)胞凋亡。這些發(fā)現(xiàn)為深入理解brachyury調(diào)控脊索瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制提供了新的視角。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在研究的系統(tǒng)性和深入性方面。在研究方法上，綜合運(yùn)用了多種前沿技術(shù)，從細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)到臨床病例分析，從基因、蛋白質(zhì)層面到信號(hào)通路的解析，全面系統(tǒng)地研究了brachyury對(duì)脊索瘤細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用與分子機(jī)制。在分子機(jī)制的解析上，首次明確了brachyury與PI3K/AKT、MAPK等信號(hào)通路之間的直接相互作用關(guān)系，構(gòu)建了較為完整的分子機(jī)制綜合模型。這不僅豐富了對(duì)脊索瘤發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，也為后續(xù)的研究和治療靶點(diǎn)開發(fā)提供了更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。不可避免地，本研究也存在一些不足之處。在臨床病例分析方面，樣本量相對(duì)較小，僅回顧性分析了50例脊索瘤患者的臨床資料，這可能會(huì)影響研究結(jié)果的普遍性和可靠性。在信號(hào)通路研究中，雖然明確了PI3K/AKT、MAPK等信號(hào)通路在brachyury調(diào)控脊索瘤細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵作用，但對(duì)于這些信號(hào)通路與其他可能相關(guān)信號(hào)通路之間的交互作用，以及它們?cè)诓煌顾髁鰜喰椭械淖饔貌町?，尚未進(jìn)行深入研究。此外，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，僅選用了免疫缺陷小鼠構(gòu)建脊索瘤動(dòng)物模型，缺乏對(duì)免疫健全動(dòng)物模型的研究，這可能無法完全模擬人體的免疫微環(huán)境對(duì)腫瘤的影響。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)脊索瘤基礎(chǔ)研究和臨床治療具有重要的理論和實(shí)踐意義。在基礎(chǔ)研究方面，進(jìn)一步揭示了脊索瘤的發(fā)病機(jī)制，為深入理解脊索瘤的生物學(xué)行為提供了關(guān)鍵線索。通過明確brachyury在脊索瘤細(xì)胞凋亡調(diào)控中的作用和分子機(jī)制，有助于發(fā)現(xiàn)更多與脊索瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的關(guān)鍵分子和信號(hào)通路，為后續(xù)的研究奠定基礎(chǔ)。在臨床治療方面，本研究為脊索瘤的治療提供了新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。既然brachyury及其調(diào)控的信號(hào)通路在脊索瘤細(xì)胞凋亡中起著關(guān)鍵作用，那么可以針對(duì)這些靶點(diǎn)開發(fā)新的治療藥物，如特異性抑制brachyury表達(dá)或活性的藥物，阻斷brachyury與相關(guān)信號(hào)通路分子的結(jié)合，從而促進(jìn)脊索瘤細(xì)胞凋亡，為改善脊索瘤患者的治療效果和預(yù)后提供新的策略。5.2基于研究結(jié)果的治療策略展望基于本研究成果，以brachyury為靶點(diǎn)開發(fā)脊索瘤新型治療方法具有廣闊的前景。從靶向藥物研發(fā)角度來看，由于brachyury在脊索瘤細(xì)胞凋亡調(diào)控中處于核心地位，且其在脊索瘤組織中高表達(dá)，開發(fā)特異性抑制brachyury表達(dá)或活性的小分子化合物或生物制劑具有重要意義。這些靶向藥物能夠精準(zhǔn)地作用于brachyury，阻斷其與相關(guān)信號(hào)通路分子的結(jié)合，從而抑制PI3K/AKT、MAPK等信號(hào)通路的激活，促進(jìn)脊索瘤細(xì)胞凋亡。例如，通過高通量藥物篩選技術(shù)，從大量的化合物庫中篩選出能夠與brachyury蛋白的T-box結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合的小分子化合物，阻止其與DNA結(jié)合，進(jìn)而抑制其轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。也可以利用抗體工程技術(shù)，制備特異性針對(duì)brachyury蛋白的單克隆抗體，通過與brachyury蛋白結(jié)合，阻斷其與其他蛋白的相互作用，抑制其生物學(xué)活性。在基因治療方面，采用RNA干擾（RNAi）技術(shù)或基因編輯技術(shù)，如CRISPR/Cas9系統(tǒng)，來沉默或修飾brachyury基因，也是極具潛力的治療策略。RNAi技術(shù)通過設(shè)計(jì)針對(duì)brachyury基因的小干擾RNA（siRNA）或短發(fā)夾RNA（shRNA），將其導(dǎo)入脊索瘤細(xì)胞中，使其與brachyury基因的mRNA結(jié)合，從而降解mRNA，抑制brachyury基因的表達(dá)。在實(shí)際應(yīng)用中，可以將siRNA或shRNA包裹在脂質(zhì)體、納米顆粒等載體中，提高其穩(wěn)定性和細(xì)胞攝取效率，增強(qiáng)基因沉默效果。CRISPR/Cas9系統(tǒng)則可以通過精準(zhǔn)地編輯brachyury基因，如在基因的關(guān)鍵區(qū)域引入突變，使其失去功能，從而達(dá)到治療目的。但在應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)時(shí)，需要充分考慮其潛在的脫靶效應(yīng)，通過優(yōu)化sgRNA的設(shè)計(jì)、采用高效的遞送系統(tǒng)等方法，降低脫靶風(fēng)險(xiǎn)，確?；蚓庉嫷陌踩院陀行?。將以brachyury為靶點(diǎn)的新型治療方法與現(xiàn)有治療手段聯(lián)合應(yīng)用，有望顯著提高脊索瘤的治療效果。在與手術(shù)治療聯(lián)合方面，對(duì)于難以完全切除的脊索瘤，術(shù)前應(yīng)用靶向藥物或基因治療，可以使腫瘤體積縮小，降低腫瘤的侵襲性，從而提高手術(shù)切除的成功率和徹底性。術(shù)后繼續(xù)使用這些治療方法，能夠有效清除殘留的腫瘤細(xì)胞，降低復(fù)發(fā)率。例如，對(duì)于顱底脊索瘤患者，術(shù)前給予特異性抑制brachyury的靶向藥物，可能使腫瘤與周圍神經(jīng)血管結(jié)構(gòu)的粘連減輕，便于手術(shù)操作；術(shù)后使用RNAi技術(shù)沉默殘留腫瘤細(xì)胞中的brachyury基因，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。在與放射治療聯(lián)合方面，放射治療能夠通過電離輻射損傷腫瘤細(xì)胞的DNA，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而以brachyury為靶點(diǎn)的治療可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放療的敏感性。研究表明，抑制PI3K/AKT、MAPK等信號(hào)通路，可以使腫瘤細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)能力下降，從而增強(qiáng)放療對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。因此，在放射治療的同時(shí)，應(yīng)用針對(duì)brachyury及其調(diào)控信號(hào)通路的靶向藥物或基因治療，能夠協(xié)同發(fā)揮作用，提高放療的療效，減少放療劑量和副作用。在與化療聯(lián)合方面，雖然傳統(tǒng)化療藥物對(duì)脊索瘤的療效不佳，但與新型治療方法聯(lián)合，可能產(chǎn)生協(xié)同增效作用。例如，某些化療藥物可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，激活p38MAPK、JNK等信號(hào)通路，而以brachyury為靶點(diǎn)的治療可以進(jìn)一步調(diào)節(jié)這些信號(hào)通路，增強(qiáng)化療藥物的細(xì)胞毒性作用，同時(shí)減少化療藥物的耐藥性。未來的研究可以進(jìn)一步深入探索brachyury的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，為開發(fā)更高效、特異性更強(qiáng)的靶向藥物提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。通過解析brachyury蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，明確其與DNA及其他蛋白相互作用的關(guān)鍵位點(diǎn)，利用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)技術(shù)，設(shè)計(jì)出能夠精準(zhǔn)作用于這些關(guān)鍵位點(diǎn)的小分子藥物。同時(shí)，深入研究brachyury調(diào)控脊索瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，挖掘更多與之相關(guān)的信號(hào)通路和分子靶點(diǎn)，為聯(lián)合治療提供更多的選擇。還需要開展大規(guī)模的臨床研究，驗(yàn)證新型治療方法的安全性和有效性，優(yōu)化治療方案，推動(dòng)其從實(shí)驗(yàn)室研究走向臨床應(yīng)用，為脊索瘤患者帶來新的希望。六、結(jié)論6.1研究主要成果總結(jié)本研究系統(tǒng)且深入地探究了T-box轉(zhuǎn)錄因子brachyury對(duì)脊索瘤細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用與分子機(jī)制，取得了一系列具有重要價(jià)值的成果。在brachyury對(duì)脊索瘤細(xì)胞凋亡的作用方面，通過嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，確鑿地證實(shí)了brachyury在脊索瘤細(xì)胞凋亡調(diào)控中占據(jù)關(guān)鍵地位。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，成功構(gòu)建了過表達(dá)或敲低brachyury的脊索瘤細(xì)胞模型，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL染色等先進(jìn)技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果清晰地顯示，過表達(dá)brachyury能夠顯著抑制脊索瘤細(xì)胞的凋亡，而過表達(dá)對(duì)照組細(xì)胞凋亡率無明顯變化；敲低brachyury則可明顯促進(jìn)脊索瘤細(xì)胞的凋亡，敲低對(duì)照組細(xì)胞凋亡率無顯著差異。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，構(gòu)建了脊索瘤動(dòng)物模型，觀察到接種過表達(dá)brachyury細(xì)胞的小鼠腫瘤體積明