核酸化學第一節(jié)核酸通論

核酸的發(fā)展簡史、種類與分布、生物功能1868

F.

Miescher從膿細胞的細胞核中分離出了一種含磷酸的有機物，當時稱為核素（nuclein）,后稱為核酸（nucleicacid）。1944

Avery等通過肺炎球菌轉化試驗證明DNA是遺傳物質。1952

Hershey-Chase噬菌體標記實驗。1953

Watson和Crick提出DNA結構的雙螺旋模型。1958

Crick提出遺傳信息傳遞的中心法則。1973Boyer，Cohen-DNACloning(克隆）。1976DNASequencing(序列分析）。1990HumanGeneProject（人類基因組計劃）。核酸的發(fā)展簡史光滑型細胞（有毒）粗糙型細胞（無毒）破碎細胞DNAase降解后的DNA粗糙型細胞接受光滑型DNA只有粗糙型大多數(shù)仍為粗糙型少數(shù)光滑型細胞被轉化SSRRR+DNA1944年Avery細菌轉化實驗1952年，美國Hershey-Chase噬菌體浸染細菌的實驗。脫氧核糖核酸（DNA—Deoxyribonucleicacid)核糖核酸（RNA—Ribonucleicacid)核酸的種類、分布、含量信使RNA(mRNA)：直接模板最大轉運RNA(tRNA)：轉運氨基酸的工具

最小

核糖體RNA(rRNA)：與蛋白質構成核糖體最多小RNA（sRNA）：如胞質小RNA(scRNA)、核不均一RNA（hnRNA）、核內小RNA（snRNA）、反義RNA（asRNA）等RNA分類：1、rRNA(ribosomeRNA)核糖體RNA，細胞中最主要的RNA，占細胞中總RNA80%左右。原核細胞rRNA中有3種分別是：16SrRNA、23SrRNA、5SrRNA；真核細胞rRNA中有4種分別是：28SrRNA、18SrRNA、5.8SrRNA、5SrRNA。核糖體是蛋白質合成的場所。含量：

DNA含量恒定，RNA含量與細胞生長狀態(tài)有關

3、mRNA(messengerRNA)信使RNA，占細胞總RNA的5%左右，含量最少，代謝活躍。mRNA在蛋白質的生物合成中起模板作用。它將DNA的遺傳信息傳遞給蛋白質。

2、tRNA(transferRNA)轉移RNA，是細胞中最小的一種RNA分子，占細胞總RNA的15%左右。是結構研究最清楚的一類RNA。在蛋白質的生物合成中，tRNA起攜帶氨基酸的作用。核酸的生物功能：核酸是生物體遺傳變異的物質基礎，DNA是大多數(shù)生物體的遺傳物質。RNA主要參與蛋白質的生物合成。RNA功能具有多樣性，還有：RNA的轉錄后加工與修飾、參與基因表達的調控、催化作用如核酶、遺傳信息的加工、病毒RNA或類病毒是遺傳信息的載體等。DNA是主要的遺傳物質(1):原核生物:沒有細胞核,它的DNA存在于一個叫“類核/擬核”的結構中。在某些細菌具有以質粒形式存在的DNA。質粒：plasmid,指染色體外基因，能自主復制，并給出附加的性狀。(2)：真核生物：不同種的生物細胞的DNA含量相差很大，但同種生物細胞的DNA含量總是相同的；DNA在細胞核內呈高度卷曲的雙股螺旋線性分子，與組蛋白結合形成染色體；線粒體和葉綠體也含有DNA，但不與組蛋白結合，分子也較小。(3)：原核生物染色體DNA，質粒DNA，真核生物細胞器DNA都是環(huán)狀雙鏈DNA；真核生物染色體是線形雙鏈DNA，末端具有高度重復序列形成的端粒結構。除少數(shù)病毒（RNA病毒）以RNA作為遺傳物質外，多數(shù)有機體的遺傳物質是DNA。RNA在蛋白質的生物合成中起重要作用“一個基因一條多肽鏈”是現(xiàn)代遺傳學極重要的基本概念?；蚬δ艿谋磉_是以蛋白質的形式體現(xiàn)出來的。大量的實驗證明：RNA在蛋白質生物合成中起著重要作用，即RNA的核心功能是：遺傳信息由DNA到蛋白質的中間傳遞體。核酸的結構：核酸的元素組成核酸的結構組成核酸的共價結構DNA的高級結構RNA的高級結構組成核酸的元素有C、H、O、N、P等，與蛋白質比較，其組成上有兩個特點：一是核酸一般不含元素S，二是核酸中P元素的含量較多并且恒定，在DNA中9.9%在RNA中9.4%

。因此，核酸定量測定的經(jīng)典方法，是以測定P含量來代表核酸量。核酸nucleicacid核苷酸nucleotide核苷nucleoside磷酸phosphate嘌呤堿purinebase

嘧啶堿pyrimidinebase（堿基base）核糖ribose

脫氧核糖deoxyribose

（戊糖amylsugar）戊糖：核糖和脫氧核糖OHOH2COHOHOH12OHOH2COHOH12β-D-2-核糖β-D-2-脫氧核糖O核糖

+H+糠醛甲基間苯二酚FeCl3綠色產(chǎn)物Δ脫氧核糖

+H+

Δω-羥基-γ-酮戊醛二苯胺藍色產(chǎn)物RNA和DNA定性、定量測定堿基：嘌呤堿基和嘧啶堿基NNNNHHHHNNNNHHHH123456789嘌呤NH2腺嘌呤adenine（A）NNNNHHHHOH2N鳥嘌呤guanine（G）NNHHHH嘧啶123456NNHHHHNH2OH胞嘧啶cytosine（C）NNHHHHOOHH尿嘧啶uracil（U）NNHHHHOOHHCH3胸腺嘧啶thymine（T）NNOOHHH酮式HNNOOHHH酮式HHH烯醇式含氧堿基的兩種互變異構體，在生理pH條件下主要以酮式存在。

核酸中也存在一些不常見的稀有堿基,大部分是上述堿基的甲基化或羥甲基化產(chǎn)物二氫尿嘧啶（DHU）修飾堿基的簡寫符號

(為1時可以不寫)取代基用下列小寫英文字母表示:甲基m

乙?；鵤c

氨基n

甲硫基ms

羥基o或h硫基s異戊烯基i羧基c

核苷：戊糖+堿基

糖與堿基之間的C-N鍵，稱為C-N糖苷鍵1’2’3’4’5’(OH)1’2’3’4’5’(OH)核苷嘌呤堿的N9與戊糖的C1′連接成的糖苷鍵嘧啶堿的N1與戊糖的C1′連接成的糖苷鍵(假尿苷ψ，C-C鍵)稀有核苷：修飾堿基+戊糖堿基+修飾戊糖特殊糖苷鍵(C1′—C5)正常糖苷鍵OO（N=A、G、C、U、T）HH(O)H1′2′NOHCH2HH5′4′3′PO-OOO-核苷酸(核苷的磷酸酯,核酸的基本組成單位)常見核苷酸及其衍生物的形式、功能PPPPPPPP常見（脫氧）核苷酸的結構和命名鳥嘌呤核苷酸（GMP）尿嘧啶核苷酸（UMP）胞嘧啶核苷酸（CMP）腺嘌呤核苷酸（AMP）脫氧腺嘌呤核苷酸（dAMP）脫氧鳥嘌呤核苷酸（dGMP）脫氧胞嘧啶核苷酸（dCMP）脫氧胸腺嘧啶核苷酸（dTMP）

5′-NMP

5′-NDP

5′-NTPN=A、G、C、U

5′-dNMP

5′-dNDP

5′-dNTPN=A、G、C、T腺苷酸及其多磷酸化合物

AMP腺苷一磷酸

Adenosine

monophosphate

ADP腺苷二磷酸

Adenosine

diphosphate

ATP腺苷三磷酸

Adenosine

triphosphate1.繼續(xù)磷酸化2.環(huán)化磷酸化

cAMP

cGMP第二信使—cAMP（3′5′—環(huán)化腺苷酸）由ATP在腺苷酸環(huán)化酶催化形成；其拮抗物為cGMP（3′5′—環(huán)化鳥苷酸）；共同在細胞的生長發(fā)育中起重要調節(jié)作用。作為合成原料:各種核苷三磷酸(ATP、GTP、CTP、UTP）是體內合成RNA的直接原料；各種脫氧核苷三磷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）是體內合成DNA直接原料核苷酸在體內新陳代謝中的作用：ATP——能量“貨幣”UTP——參加糖的互相轉化與合成CTP——參加磷脂的合成GTP——參加蛋白質和嘌呤的合成作為輔酶的組成成分：NAD+、NADP+、FAD、FMN、HSCoA是核酸的衍生物，在物質代謝和能量代謝中起重要作用參與新陳代謝

NAD、NADP、FAD、HSCoAFADNAD、NADPHSCoA堿基、核苷、核苷酸的概念和關系

NitrogenousbasePentosesugarHOCH2HOHDoxyribose(inDNA)HOCH2HOOHRibose(inRNA)PhosphatePyrimidinesCytosineThymineUracilCUTPurinesAdenineGuanineAG核苷核苷酸糖苷鍵5′—磷酸酯鍵

兩類核酸的基本成分核酸的共價結構核酸中核苷酸的連接方式DNA的一級結構RNA的一級結構5’5’3’3’每個核苷酸戊糖上的3′-OH和相鄰核苷酸戊糖上的5′-磷酸形成3′，5′---磷酸二酯鍵，因此，核苷酸間的連接鍵是3′,5′--磷酸二酯鍵結構式5′-磷酸端（常用5′-P表示）；3′-羥基端（常用3′-OH表示）核苷酸鏈具有方向性，當表示一個核苷酸鏈時，必須注明它的方向，5′→3′。OHO-O

O—CH2

TO=P—O-3′5′OHOHO-O

O—CH2

GO=P—O-3′5′OHO

O—CH2OHOH

AO=P—OO-3′5′3′5′1′PPPOHATGpGpTpAOHpG-T-ApGTA線條式字母式DNA一級結構的概念、特點與意義：概念：脫氧核苷酸（堿基）在分子中的排列順序DNA分子一級結構特點A:DNA是沒有分支的多核苷酸長鏈，各脫氧核苷酸之間以3′5′—磷酸二酯鍵相連B：相間排列的戊糖和磷酸構成脫氧核糖核酸大分子的主鏈，而其堿基則可看成是側鏈基團；HHH5′3′OHC:天然DNA分子長鏈的兩端，總是有一個核糖帶有自由的5′-磷酸，而另一端的核糖帶有自由的3′-OH。DNA的方向就是從5′端到3′端；D:DNA分子的核糖的2′位上沒有自由羥基,這是DNA作為主要遺傳物質極其穩(wěn)定的根本原因.特別是對于堿的抵抗力.DNA分子一級結構的意義:不僅在于它的堿基排列以密碼子的方式蘊藏了遺傳信息,而且還決定了DNA的二級結構和空間結構。生物界物種的多樣性即寓于DNA分子中四種核苷酸千變萬化的不同排列組合之中。RNA的一級結構:

RNA分子中各核苷酸/堿基的排列順序叫做RNA的一級結構OHOHOH5′3′

RNA與DNA的差異

DNA

RNA糖脫氧核糖核糖堿基AGCTAGCU

不含稀有堿基含稀有堿基DNA的高級結構DNA堿基組成的Chargaff定則DNA的二級結構DNA的三級結構DNA與蛋白質復合物的結構

——染色體Chargaff定則DNA堿基組成符合：A=T；G=C；A+C=G+T；A+G=T+C；不對稱比率：A+T/G+C；物種不同，DNA堿基組成不同；物種親緣愈接近，堿基組成也愈接近，該比率越相近似。Ⅲ.具有種的特異性，沒有器官和組織的特異性，年齡、營養(yǎng)狀況、環(huán)境的改變不影響DNA的堿基組成。Watson

和Crick

于1953年提出了DNA雙螺旋結構模型，說明了DNA

的二級結構。（即B型DNA）雙螺旋結構的主要依據(jù)、結構要點、穩(wěn)定因素、呼吸作用、構象類型

雙螺旋結構的主要依據(jù)（1）Wilkins和Franklin發(fā)現(xiàn)不同來源的DNA纖維具有相似的X射線衍射圖譜。（2）Chargaff發(fā)現(xiàn)DNA中A與T、C與G的數(shù)目相等。后Pauling和Corey發(fā)現(xiàn)A與T生成2個氫鍵、C與G生成3個氫鍵。（3）電位滴定證明，嘌呤與嘧啶的可解離基團由氫鍵連接。x-光衍射分析

DNA雙螺旋結構模型的結構要點（double-helicalstructure）

（1）主鏈：脫氧核糖和磷酸基通過3′5′—磷酸二酯鍵連接成為螺旋的骨架，二條主鏈以反平行的方式組成右手螺旋；主鏈處于螺旋外側，這是由核糖和磷酸的親水性所決定的；核糖平面與螺旋軸平行，堿基則處于螺旋的內側(2)直徑與螺距:螺旋的直徑為2nm；螺距（雙螺旋鏈中的任意一條鏈繞軸一周所升降的距離）為3.4nm,其中包含10個核苷酸,因此每兩個相鄰堿基平面的垂直距離(堿基堆積距離)0.34nm,相對于螺旋軸移動36°.2.0nm（3）堿基對：由于雙螺旋結構要求有一個正常的螺旋形式，就必須按堿基互補的原則進行堿基配對；嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)上的氨基和酮基是親水的，配對的堿基之間能夠形成氫鍵；而嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)本身都是疏水的，因而同一條鏈中的相鄰堿基能夠形成一種堆積力；這兩種力的協(xié)同作用就維持了雙螺旋結構的穩(wěn)定性(4)大溝小溝:兩條主鏈和堿基并不充滿雙螺旋的空間,其表面形成兩條凹槽,一條寬而深為大溝；一條狹而淺為小溝。特別是大溝,對于Pr識別DNA雙螺旋結構上的特定信息是非常重要的。因為只有在溝內，Pr才能“感覺”到不同堿基順序，而在雙螺旋的表面全是相同的磷酸和脫氧核糖的骨架，是沒有什么信息可言的2.0nm小溝大溝DNA的雙螺旋結構穩(wěn)定因素

氫鍵

堿基堆積力

磷酸基上負電荷被屏蔽

堿基處于疏水環(huán)境

氫鍵:在每一個堿基上都有適于形成氫鍵的供氫體如氨基和羥基以及受氫體如酮基和亞氨基，在形成氫鍵時，要求供體氫原子與受體原子具有互補性即特異性很強；氫鍵的另一個特點是具有高度的方向性，如果供體原子，氫原子和受體原子三者在一條直線上，形成的氫鍵最強。同鏈的相鄰堿基之間的堆積力恰恰為形成最強的氫鍵提供了條件。堿基堆積力：同一條鏈中相鄰堿基之間的非特異性作用力，即疏水作用和范德華力。嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)本身帶有一定程度的疏水性，這些不溶性的環(huán)狀物相互聯(lián)合，則可以使有序的水分子殼層減少到很低的數(shù)量。因此，DNA相鄰堿基就有相互堆積在一起的趨勢；其次是DNA鏈中的大量的嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)，其累積的范德華力是相當可觀的，是構成堿基堆積力的另一個重要因素。雙鏈DNA中的堿基比單鏈DNA中的堿基堆積程度更高，這是由兩條鏈的配對堿基之間的氫鍵所引起的。很明顯，已被氫鍵定向的堿基更容易堆積；相應地，已經(jīng)堆積的堿基更容易氫鍵鍵合。因此，兩種作用力相互協(xié)同，形成一種非常穩(wěn)定的結構。如果一種作用力被消除，則另一種作用力大為削弱。負電荷的磷酸基的靜電斥力被屏蔽：每一個核苷酸的磷酸基上都帶有一個負電荷，如沒被中和，強有力的靜電排斥作用將驅使兩條鏈分開。但是帶負電荷的磷酸基團可以被生理環(huán)境中的組蛋白或正離子所中和，即正離子圍繞在磷酸基團周圍形成了“離子云”，有效地屏蔽了磷酸基團之間的靜電斥力，這就是離子屏蔽理論。在生理鹽濃度（約0.2mol/L）時就發(fā)生了這種屏蔽作用，斥力也被終止。事實上在純蒸餾水中的DNA在室溫下就會變性，所以制備的也總是DNA的鈉鹽，每個磷酸基團結合一個鈉離子。DNA雙螺旋結構的呼吸作用：在DNA雙螺旋結構中，配對堿基之間的氫鍵處于連續(xù)不斷的斷裂和再生的動態(tài)平衡之中——DNA鏈的呼吸作用。特別是富含A-T的節(jié)段，呼吸作用更為明顯，經(jīng)常發(fā)生瞬間的單鏈泡狀結構，這對于某些Pr與DNA發(fā)生反應并閱讀DNA內部儲藏的信息具有重要作用。AB

Z外型粗短適中細長螺旋方向右手右手

左手螺旋直徑2.55nm2nm1.84nm堿基直升0.23nm0.34nm0.38nm堿基夾角32.70

34.6060.00每圈堿基數(shù)1110.412軸心與堿基對關系2.46nm3.32nm4.56nm堿基傾角190

10

90糖苷鍵構象反式反式

C、T反式，G順式大溝很窄很深很寬較深平坦小溝很寬、淺窄、深較窄很深DNA雙螺旋的構象類型DNA的三級結構——超螺旋1）超螺旋是指雙螺旋進一步扭曲或再螺旋的構象。2）正超螺旋（變緊，過旋）和負超螺旋（變松，欠旋）。3）人類46條染色體的DNA總長可達1.7m，經(jīng)過螺旋化壓縮，實際總長只有200nm。真核生物的基因一般分布在若干條染色體（chromosome）上。DNA與組蛋白結合成染色體組蛋白是真核生物染色體的基本結構蛋白，富含帶正電荷的Arg和Lys等堿性氨基酸，pI一般在10.0以上，屬堿性蛋白質，可以和酸性的DNA緊密結合，而且一般不要求特殊的核苷酸序列。核小體——染色體的基本結構單位用聚丙烯酰胺凝膠電泳可以將組蛋白區(qū)分為5種組分，依分子量大小為：H1（223Aa）、H3（135Aa）、H2A（129Aa）、H2B（125Aa）、H4（102Aa）H1的N端富含疏水Aa，C端富含堿性Aa四種N端富含堿性Aa，C端富含疏水Aa除H1外四種有形成聚合體的趨勢，通過C端疏水Aa相結合，而N端的堿性Aa則向四面伸出以便與DNA分子相互作用組蛋白與DNA的結合雙螺旋DNA先盤繞組蛋白形成核小體——真核生物染色體的基本結構單位。每個核小體的核心含H2A、H2B、H3和H4各兩分子，即八聚體的扁盤狀結構。然后DNA分子在八聚體的扁盤狀核心外纏繞1.75-1.8圈（146bp）組裝成核小體，其長度壓縮7倍；連接核小體的DNA片段（連接DNA）結合有一分子H1，把許多核小體連在一起構成念珠狀結構核小體鏈可進一步盤繞成30nm的染色質纖絲，每圈6個核小體；由染色質纖絲組成突環(huán)，再由突環(huán)形成玫瑰花結形狀的結構，進而組裝成螺旋圈，由螺旋圈再組裝成染色單體。所以，DNA壓縮的基本原則是在螺旋上形成螺旋，再形成螺旋②染色質纖絲真核生物染色體DNA組裝的不同層次的結構DNA（2nm）核小體鏈纖絲突環(huán)玫瑰花結螺旋圈染色體RNA的高級結構tRNA的二級結構tRNA的三級結構rRNA的高級結構mRNA的結構特點tRNA二級結構特征

單鏈三葉草葉形

四臂四環(huán)酵母tRNA

Ala

的二級結構DHU/D環(huán)IGC反密碼子反密碼環(huán)氨基酸臂可變環(huán)TψC環(huán)CCAAla3′5′D臂反密碼子臂TψC臂1.氨基酸臂3′端有CCAOH的共有結構,與轉運的Aa形成酯鍵；2.D環(huán)上有二氫尿嘧啶（D）,氨酰-tRNA合成酶的結合位點；3.反密碼子環(huán)的反密碼子與mRNA相互作用4.可變環(huán)上的核苷酸數(shù)目可以變動,決定tRNA分子大??；5.TψC環(huán)含有T和ψ,與核糖體結合位點；6.含有修飾堿基和不變核苷酸。tRNA三級結構特征：

1:形狀象倒寫的字母“L”2：Aa臂和TΨC臂沿同一軸排列，形成12bp的連續(xù)螺旋；在與之垂直的方向，反密碼子臂和D臂沿同一軸排列；D環(huán)和TΨC環(huán)構成倒L的轉角，兩環(huán)間的氫鍵和堿基堆積力穩(wěn)定了轉角的構象3.氫鍵使多核苷酸鏈的某些部分固定在一定的位置。所有的tRNA折疊后形成大小及三維構象相似的三級結構，有利于攜帶AA的tRNA進入核糖體的特定部位。

rRNA的結構特征

與Pr組成核糖體后方能發(fā)揮其功能

單鏈，螺旋化程度較tRNA低原核生物

真核生物核糖體rRNA核糖體rRNA70S（30S、50S）16S、5S、23S80S（40S、60S）18S、5S、5.8S、28S單鏈RNA自行盤繞形成局部雙螺旋的多“莖”多“環(huán)”結構，螺旋部分稱為“莖”或“臂”，非螺旋部分稱為“環(huán)”，在螺旋區(qū)，A與U配對，G與C配對。

5srRNA的二級結構原核生物mRNA特征：

先導區(qū)+翻譯區(qū)（多順反子）+末端序列真核生物mRNA特征：

“帽子”（m7G-5′ppp5′-N-3′p）+單順反子+“尾巴”（PolyA）原核細胞mRNA的結構特點5′3′順反子順反子順反子插入順序插入順序先導區(qū)末端順序真核細胞mRNA的結構特點AAAAAAA-OH5′“帽子”3′尾巴

PolyA順反子m7G-5′ppp5′-N-3′p核酸的物理化學性質：核酸的水解核酸的一般性質核酸的紫外吸收核酸的變性與復性核酸的雜交核酸的水解:兩種戊糖(核糖和脫氧核糖)的C1與嘌呤堿的N9和嘧啶堿的N1可以形成4種糖苷鍵，即嘌呤核苷、嘌呤脫氧核苷、嘧啶核苷、嘧啶脫氧核苷；磷酸基與兩種戊糖分別形成核糖磷酸酯和脫氧核糖磷酸酯；所有這些糖苷鍵和磷酸酯鍵都能被酸水解、堿水解和酶水解。酸水解：糖苷鍵和磷酸酯鍵都能被酸水解，但糖苷鍵比磷酸酯鍵更易被水解；嘌呤堿的糖苷鍵比嘧啶堿的糖苷鍵對酸更不穩(wěn)定；對酸最不穩(wěn)定的是嘌呤與脫氧核糖之間的糖苷鍵。堿水解:

RNA的磷酸酯鍵易被堿水解，產(chǎn)生核苷酸，這是因為RNA的核糖上有2′-OH，在堿作用下形成磷酸三酯，磷酸三酯極不穩(wěn)定隨即水解，產(chǎn)生核苷2′3′-環(huán)磷酸酯，繼續(xù)水解產(chǎn)生2′-核苷酸和3′-核苷酸。DNA的脫氧核糖無2′-OH，不能形成堿水解的中間產(chǎn)物，故對堿有一定的抗性。酶水解：非專一性核酸酶類：非特異性水解磷酸二酯鍵的酶為磷酸二酯酶，為核酸外切酶，常見的有蛇毒磷酸二酯酶和牛脾磷酸二酯酶專一性核酸酶類：專一水解核酸的磷酸二酯酶稱為核酸酶PP核酸酶：（1）按底物專一性分類：A：核糖核酸酶類：作用于核糖核酸B：脫氧核糖核酸酶類:作用于脫氧核糖核酸(2):按對底物作用的方式分類:A:核酸內切酶:作用點在多核苷酸鏈的內部B:核酸外切酶:作用點從多核苷酸鏈的末端開始,逐個將核苷酸切下從而對核苷酸進行降解①牛胰核糖核酸酶:RNaseI只作用于RNA；最適pH7.0-8.2，耐熱專一性極高,作用點為嘧啶核苷-3′磷酸與其他核苷酸之間的連鍵；產(chǎn)物為3′-嘧啶核苷酸或以3′-嘧啶核苷酸結尾的寡核苷酸②核糖核酸酶T1：耐熱耐酸，具更高專一性，作用點是3′-鳥苷酸與其相鄰核苷酸的5′-OH之間的連鍵；產(chǎn)物為3′-鳥苷酸或以3′-鳥苷酸為末端的寡核苷酸③核糖核酸酶T2：主要作用點是Ap殘基，可以將tRNA完全降解為3′-腺苷酸結尾的寡核苷酸。核糖核酸酶類脫氧核糖核酸酶類：①牛胰脫氧核糖核酸酶：DNaseI，無堿基專一性，切斷單鏈或雙鏈DNA成為以5′-磷酸為末端的寡聚核苷酸，平均長度為4個核苷酸，需Mg2+、Mn2+、Co2+，最適pH7-8。②牛脾脫氧核糖核酸酶：DNaseⅡ，無堿基專一性降解DNA成為以3′-磷酸為末端的寡聚核苷酸，平均長度為6個核苷酸，最適pH4-5，需0.3mol/LNa+激活，Mg2+可以抑制此酶。外切核酸酶對核酸的水解位點5′

p

p

p

pOHB

p

p

p

p3′BBBBBBB牛脾磷酸二酯酶（5′端外切5得3）蛇毒磷酸二酯酶（3′端外切3得5）內切核酸酶對RNA的水解位點示意圖5′

p

p

p

pOHPyPuPyPy1′

p

p

pGACU

p

p

pGA3′RNAaseIRNAaseIRNAaseT1RNAaseT1Pu

：嘌呤Py：嘧啶

③限制性內切酶：降解外源的DNA，具有嚴格的堿基序列專一性（4～6bp），交錯切割形成粘性末端。常與甲基化酶同時成對地存在，它們具有相同的底物專一性，具有識別相同堿基序列的能力。甲基化酶的甲基供體為S-腺苷Met，甲基受體為DNA上的A與C。當限制性內切酶作用位點上的某一些堿基被甲基化修飾后，限制酶就不能再降解這種DNA了；所以甲基化酶使細菌自身的DNA帶上標志，限制性內切酶專用于降解外來入侵的異種DNA。常用的DNA限制性內切酶的專一性酶辨認的序列和切口說明‥‥AGCT‥‥‥‥TCGA‥‥‥‥GGATCC‥‥‥‥CCTAGG‥‥‥‥AGATCT‥‥‥‥TCTAGA‥‥‥‥GAATTC‥‥‥‥CTTAAG‥‥‥‥AAGCTT‥‥‥‥TTCGAA‥‥‥‥GTCGAC‥‥‥‥CAGCTG‥‥‥‥CCCGGG‥‥‥‥GGGCCC‥‥BamHIAluIBglIEcoRIHindⅢSalISmaI四核苷酸，平端切口六核苷酸，平端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口限制性內切酶類型I型：分子量大于105，多亞基，需S-線苷蛋氨酸、ATP和Mg2+，識別位點與切割位點相差甚遠，產(chǎn)物為異質，是限制與修飾相排斥的多功能酶。Ⅱ型：分子量小于105，需Mg2+，切割位點位于識別位點上，產(chǎn)物為專一性片段，不具修飾酶功能?，F(xiàn)在分子生物學研究所用的限制性內切酶均為此類。Ⅲ型：識別位點為5-7bp的非對稱序列

,切割位點在順序之外離識別序列5-10bp，切割雙鏈，個別也切割單鏈。是限制與修飾相多功能酶。限制性內切酶的命名和意義EcoRI序號屬名種名株名例：EcoRI，這是從大腸桿菌（Ecoli）R菌珠中分離出的一種限制性內切酶

限制性內切酶是分析染色體結構、制作DNA限制圖譜、進行DNA序列測定和基因分離、基因體外重組等研究中不可缺少的工具，是一把天賜的神刀，用來解剖纖細的DNA分子。一般理化性質：兩性電解質，通常表現(xiàn)為酸性DNA為白色纖維狀固體，RNA為白色粉末，不溶于有機溶劑DNA溶液的粘度極高，而RNA溶液要小得多RNA在室溫條件下被稀堿水解而DNA對堿穩(wěn)定利用核糖和脫氧核糖不同的顯色反應鑒定DNA與RNA。加熱條件下，D－核糖＋濃鹽酸＋苔黑酚綠色D－2－脫氧核糖＋酸＋二苯胺藍色紫外吸收嘌呤堿和嘧啶堿都含有共軛雙鍵體系，在260nm有最高吸收峰；根據(jù)A260/A280的比值判斷核酸樣品的純度純DNA：A260/A280≥1.8

純RNA：A260/A280≥2.0若樣品中含有雜質則A260/A280比值明顯降低可作為核酸變性和復性的指標，當核酸變性或降解時光吸收值顯著增加（增色效應），但核酸復性后，光吸收值又回復到原有水平（減色效應）。天然DNA變性DNA核苷酸總吸收值1232202402602800.10.20.30.4波長（nm）光吸收123核酸的光吸收值比各核苷酸光吸收值的和少30~40%，這是在有規(guī)律的雙螺旋結構中堿基緊密地堆積在一起造成的核酸的的變性:雙螺旋區(qū)氫鍵斷裂