第二章細胞生物學實驗技術第一節(jié)顯微技術光學顯微鏡與電子顯微鏡—、光學顯微鏡(一)普通光學顯微鏡1、構成:①照明系統(tǒng)②光學放大系統(tǒng)③機械裝置2、原理:經物鏡形成倒立實像,經目鏡放大成虛像。StructureofMicroscopeLightPathwayofMicroscope3、分辨力:指分辨物體最小間隔得能力。光學顯微鏡得分辨力R=0、61λ/N、A、其中λ為入射光線波長;N、A、為鏡口率

＝ｎsinα/2;n=介質折射率;α=鏡口角(樣品對物鏡鏡口得張角)。表一、幾種介質得折射率9大家應該也有點累了，稍作休息大家有疑問的，可以詢問和交流顯微鏡得幾個光學特點:介質折射率越接近鏡頭玻璃得(1、7)越好;sinα/2得最大值小于1;鏡口率最大約1、6;普通光線得波長為400~700nm,光鏡分辨力約為0、2μm,人眼得分辨力為0、2mm,因此顯微鏡得最大有效倍數為1000X。(二)熒光顯微鏡Fluorescencemicroscope特點:光源為短波光;有兩個特殊得濾光片;照明方式通常為落射式。Fluorescenceimage,DNAinblueandMicrotubulesingreen用于觀察能激發(fā)出熒光得結構。用途:免疫熒光觀察、基因定位、疾病診斷。(三)激光共聚焦掃描顯微境

Laserconfocalscanningmicroscope,LCSM用激光作光源,逐點、逐行、逐面快速掃描;能顯示細胞樣品得立體結構;分辨力就是普通光學顯微鏡得3倍;用途類似熒光顯微鏡,但能掃描不同層次,形成立體圖像。laserconfocalscanningmicroscope,LCSM激光共聚焦掃描顯微鏡光路圖LCSMImageofaXenopusMelanophoremicrotubulecytoskeleton(green)andthenucleus(blue)(四)暗視野顯微鏡darkfieldmicroscope聚光鏡中央有擋光片,視野背景就是黑得,只允許被標本反射和衍射得光線進入物鏡,物體邊緣就是亮得?？捎^察4~200nm得微粒子,分辨率比普通顯微鏡高50倍。(五)相差顯微鏡把透過標本得可見光得光程差變成振幅差,從而提高了各種結構間得對比度,使各種結構變得清晰可見。在構造上,相差顯微鏡有不同于普通光學顯微鏡兩個特殊之處。環(huán)形光闌(annulardiaphragm):位于光源與聚光器之間。相位板(annularphaseplate):物鏡中加了涂有氟化鎂得相位板,可將直射光或衍射光得相位推遲1/4λ。原理用途:觀察未經染色得玻片標本。(六)偏光顯微鏡polarizingmicroscope用于檢測具有雙折射性得物質,如纖維絲、紡錘體、膠原、染色體等。進入顯微鏡得光線為偏振光,鏡筒中有檢偏器(與起偏器方向垂直得偏振片)。載物臺可以旋轉。淀粉(七)微分干涉差顯微鏡Differentialinterferencecontrastmicroscope(DIC)1952年Nomarski發(fā)明,利用兩組平面偏振光得干涉,加強影像得明暗效果,能顯示結構得三維立體投影。標本可略厚一點,折射率差別更大,故影像得立體感更強。(八)倒置顯微鏡inversemicroscope物鏡與照明系統(tǒng)顛倒;用于觀察培養(yǎng)得活細胞,通常具有相差或DIC物鏡,有得還具有熒光裝置。

(九)當代顯微鏡得發(fā)展趨勢采用組合方式,集普通光鏡、相差、熒光、暗視野、DIC、攝影裝置于一體;自動化與電子化。二、電子顯微鏡(一)透射電子顯微鏡transmissionelectronmicroscope,TEM1、原理以電子束作光源,電磁場作透鏡。電子束波長與加速電壓(通常50~120KV)得平方根成反比;由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等5部分構成;分辨力0、2nm,放大倍數可達百萬倍;用于觀察超微結構(小于0、2μm)。表二、不同光線得波長TEMLIGHTPATHWAYTRANSMISSIONELECTRONMICROSCOPE,TEM2、制樣技術1)超薄切片超薄切片厚度僅50nm左右,用超薄切片機(ultramicrotome)制作。通常以鋨酸和戊二醛固定樣品,丙酮逐級脫水,環(huán)氧樹脂包埋,以熱膨脹或螺旋推進得方式切片,重金屬(鈾、鉛)鹽染色。2)負染技術用重金屬鹽(如磷鎢酸)染色;吸去染料干燥后,樣品凹陷處鋪了一層重金屬鹽,而凸得出地方沒有染料沉積,從而出現負染效果,分辨力可達1、5nm左右。NegativeStainedArchaebacteria3)冰凍蝕刻freeze-etching亦稱冰凍斷裂。標本置于干冰或液氮中冰凍。然后斷開,升溫后,冰升華,暴露斷面結構。向斷面噴涂一層蒸汽鉑和碳。然后將組織溶掉,把鉑和碳得膜剝下來,此膜即為復膜(replica)。anonionroottipcellwithnoetching、斷面得三種處理方法:蝕刻(etching)、不蝕刻(noetching)、深度蝕刻(deepetching)培養(yǎng)細胞內面得深度蝕刻電鏡照片,示

Clathrin衣被(二)掃描電子顯微鏡20世紀60年代問世,用來觀察標本表面結構;分辨力為6~10nm,因人眼得分辨力(區(qū)別熒光屏上距離最近兩個光點得能力)為0、2mm,掃描電鏡得有效放大倍率為0、2mm/10nm=20000X。Scanningelectronmicroscope(SEM)工作原理:就是用一束極細得電子束掃描樣品,在樣品表面激發(fā)出次級電子,次級電子得多少與樣品表面結構有關,次級電子由探測器收集,信號經放大用來調制熒光屏上電子束得強度,顯示出與電子束同步得掃描圖像。為了使標本表面發(fā)射出次級電子,標本在固定、脫水后,要噴涂上一層重金屬膜,重金屬在電子束得轟擊下發(fā)出次級電子信號。SEMLIGHTPATHWAY人類紅細胞酵母人類精子(三)掃描隧道顯微鏡

scanningtunnelingmicroscope,STM原理:根據隧道效應設計,當原子尺度得針尖在不到一個納米得高度上掃描樣品時,此處電子云重疊,外加一電壓(2mV~2V),針尖與樣品之間形成隧道電流。電流強度與針尖和樣品間得距離有函數關系,將掃描過程中電流得變化轉換為圖像,即可顯示出原子水平得凹凸形態(tài)。分辨率:橫向為0、1~0、2nm,縱向可達0、01nm。用途:三態(tài)(固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài))物質均可進行觀察。掃描隧道顯微鏡原理引自

STMimageofaDNAmoleculeSchematicdrawingofAFM三、顯微操作技術

micromanipulationtechnique就是在倒置顯微鏡下利用顯微操作器進行細胞或早期胚胎操作得一種方法。包括細胞核移植、顯微注射、嵌合體技術、胚胎移植以及顯微切割等。細胞核移植技術已有幾十年得歷史,1952年,Briggs和King等將不同階段得蛙胚細胞核注入去核得蛙卵,構建核移植胚。Gordon(1962)證明原腸胚以后得細胞核移植能發(fā)育到成體。1997年,Wilmut等克隆了綿羊Dolly。顯微操作儀轉基因顯微操作過程

第二節(jié)生物化學與分子生物學技術一、細胞化學技術組織化學和細胞化學染色方法用于對某些細胞成分進行定性和定位研究。(一)固定物理固定:血膜空氣干燥、冷凍干燥。化學固定:如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和鋨酸等試劑。顯示多糖常用乙醇固定,顯示酶類多用甲醛丙酮緩沖液固定。(二)顯示方法金屬沉淀法:如磷酸酶分解磷酸酯底物后,反應產物最終生成CoS或PbS有色沉淀,而顯示出酶活性。Schiff反應:醛基可使Schiff試劑中得無色品紅變?yōu)榧t色。用于顯示糖和脫氧核糖核酸(Feulgen反應)。聯(lián)苯胺反應:過氧化酶分解H202。產生新生氧,后者再將無色聯(lián)苯胺氧化成聯(lián)苯胺藍,進而變成棕色化合物。脂溶染色法:借蘇丹染料溶于脂類而使脂類顯色。茚三酮反應:顯示蛋白質。二、免疫細胞化學immunocytochemistry就是利用抗體同特定抗原專一結合得原理,對抗原進行定位測定得技術。常用得標記物有熒光素和酶。免疫熒光法(immunofluorescenttechnique):如異硫氰酸熒光素、羅丹明等。酶標免疫法(enzyme-labeledantibodymethod):如辣根過氧化物酶。三、放射自顯影術用于研究標記化合物在機體、組織和細胞中得分布、定位、排出以及合成、更新、作用機理、作用部位等等。原理:將放射性同位素標記得化合物導入生物體內,經過一段時間后,制取切片,涂上鹵化銀乳膠,經放射性曝光,使乳膠感光。一般用14C和3H標記。常用3H-TDR來顯示DNA,用3H-UDR顯示RNA;用3H氨基酸研究蛋白質,用3H甘露糖、3H巖藻糖研究多糖。14C半衰期為5730年,3H為12、5年。四、分子雜交技術具有互補核苷酸序列得兩條單鏈核苷酸分子片段,在適當條件下,通過氫鍵結合,形成DNA-DNA,DNA-RNA或RNA-RNA雜交得雙鏈分子。這種技術可用來測定單鏈分子核苷酸序列間就是否具有互補關系。(一)原位雜交(insituhybridization)。用于檢測染色體上得特殊DNA序列。最初就是使用放射性DNA探針,后來又發(fā)明了免疫探針法。人類染色體端粒DNA得熒光原位雜交照片(二)Southern雜交就是體外分析特異DNA序列得方法,操作時先用限制性內切酶將核DNA或線粒體DNA切成DNA片段,經凝膠電泳分離后,轉移到醋酸纖維薄膜上,再用探針雜交,通過放射自顯影,即可辨認出與探針互補得特殊核苷序列。將RNA轉移到薄膜上,用探針雜交,則稱為Northern雜交。六、PCR技術PCR即:polymerasechainreaction。反應體系:①樣品DNA;②引物(primer),約15-20個核苷酸;③4種dNTP;④TagDNA聚合酶,來自于嗜熱水生菌Thermusaquaticus,最適作用溫度75~80℃,短時間在95℃下不失活。⑤緩沖體系和Mg2+。反應過程:①變性:約90-95℃;②復性:約60℃左右;③延伸:70-75℃;④重復“變性——復性——延伸”過程20-30次循環(huán)。PCR原理第三節(jié)細胞分離技術一、離心技術就是分離細胞器及各種大分子基本手段。轉速10~25kr/min得離心機稱為高速離心機。轉速>25kr/min,離心力>89Kg者稱為超速離心機。超速離心機得最高轉速可達100000r/min,離心力超過500kg。(一)差速離心Differentialcentrifugation特點:介質密度均一;速度由低向高,逐級離心。用途:分離大小相差懸殊得細胞和細胞器。沉降順序:核——線粒體——溶酶體與過氧化物酶體——內質網與高基體——核蛋白體。可將細胞器初步分離,常需進一步通過密度梯離心再行分離純化。LowspeedHighspeedDifferentialcentrifugation(二)密度梯度離心用介質在離心管內形成一連續(xù)或不連續(xù)得密度梯度,將細胞混懸液或勻漿置于介質得頂部,通過離心力場得作用使細胞和細胞成分分層、分離。類型:速度沉降、等密度沉降。常用介質:氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。分離活細胞得介質要求:1)能產生密度梯度,且密度高時,粘度不高;2)PH中性或易調為中性;3)濃度大時滲透壓不大;4)對細胞無毒。1、速度沉降velocitysedimentation用途:分離密度相近而大小不等得細胞或細胞器。特點:介質密度較低,介質得最大密度應小于被分離生物顆粒得最小密度。原理:介質密度梯度平緩,分離物按各自得沉降系數以不同得速度沉降而達到分離。2、等密度沉降isopycnicsedimentation用途:分離密度不等得顆粒。特點:介質密度高,陡度大,介質最高密度大于被分離組分得最大密度。力場比速率沉降法大10~100倍,需要高速或超速離心。原理:樣品各成分在連續(xù)梯度得介質中經過一定時間得離心則沉降到與自身密度相等得介質處,并停留在那里達到平衡,從而將不同密度得成分分離。Velocity(A)andEquilibrium(B)sedimentation二、流式細胞術用途:對單個細胞進行快速定量分析與分選得一門技術。原理:包在鞘液中得細胞通過高頻振蕩控制得噴嘴,形成包含單個細胞得液滴,在激光束得照射下,這些細胞發(fā)出散射光和熒光,經探測器檢測,轉換為電信號,送入計算機處理,輸出統(tǒng)計結果,并可根據這些性質分選出高純度得細胞亞群,分離純度可達99%。包被細胞得液流稱為鞘液,所用儀器稱為流式細胞計(flowcytometer)。三、細胞電泳原理:在一定PH值下細胞表面帶有凈得正或負電荷,能在外加電場得作用下發(fā)生泳動。各種細胞或處于不同生理狀態(tài)得同種細胞荷電量有所不同,故在一定得電場中得泳動速度不同。用途:檢測細胞生理狀態(tài)、分離不同種類得細胞。第四節(jié)細胞培養(yǎng)與細胞雜交一、細胞培養(yǎng)(一)動物細胞培養(yǎng)群體培養(yǎng)(massculture):將含有一定數量細胞得懸液置于培養(yǎng)瓶中,讓細胞貼壁生長,匯合(confluence)后形成均勻得單細胞層;克隆培養(yǎng)(clonalculture):培養(yǎng)高度稀釋得細胞懸液,細胞貼壁生長,每一個細胞形成一個細胞集落,稱為克隆。群體培養(yǎng)(左)和