《缺血性腦卒中動(dòng)物模型評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范第1部分：嚙齒類動(dòng)物》編制說(shuō)明一、工作簡(jiǎn)況（一）任務(wù)來(lái)源缺血性腦卒中(cerebralischemicstroke,CIS)，指腦血循環(huán)障礙病因?qū)е履X血管堵塞或嚴(yán)重狹窄，使腦血流灌注下降，進(jìn)而缺血、缺氧導(dǎo)致腦血管供血區(qū)腦組織死亡。流行病學(xué)調(diào)查顯示，CIS是我國(guó)排名第二的致死性疾病，年發(fā)病率約為247/10萬(wàn)人，死亡率約為115/10萬(wàn)人，未來(lái)隨著人口結(jié)構(gòu)的老齡化，我國(guó)CIS的發(fā)病率將持續(xù)升高，高致死和致殘率將給社會(huì)和家庭造成嚴(yán)重負(fù)擔(dān)，因此，近年來(lái)CIS已經(jīng)成為重大慢性非傳染性疾病研究的熱點(diǎn)方向之一。利用嚙齒類構(gòu)建的缺血性腦卒中模型是國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用于CIS發(fā)病機(jī)制研究和藥物評(píng)價(jià)的動(dòng)物模型?；趶V東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所參與國(guó)家重點(diǎn)領(lǐng)域研發(fā)“十三五”項(xiàng)目（急性局灶性腦缺血后全腦保護(hù)評(píng)估體系及轉(zhuǎn)化研究）和主持的國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金“PFKFB3基因調(diào)控膠質(zhì)細(xì)胞糖酵解途徑參與缺血性腦卒中發(fā)生的作用機(jī)制研究”，我們?cè)陂_(kāi)展缺血性腦卒中嚙齒類模型制備技術(shù)研究基礎(chǔ)上，結(jié)合嚙齒類具有模型制備適用性和可控依據(jù)經(jīng)典的嚙齒類CIS模型方法，對(duì)缺血性腦卒中嚙齒類模型制備技術(shù)進(jìn)行規(guī)范，制定本標(biāo)準(zhǔn)。（二）協(xié)作單位廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所、中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院、南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院、深圳市藥品檢驗(yàn)研究院（深圳市醫(yī)療器械檢測(cè)中（三）主要工作過(guò)程1.起草階段并結(jié)合具體臨床應(yīng)用的實(shí)際需求為主要參考依據(jù)，提出編制團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《缺血性腦卒中動(dòng)物模型評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》的計(jì)劃。本標(biāo)準(zhǔn)由廣東省精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)應(yīng)用學(xué)會(huì)組織，廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所牽頭制定，其它單位共同參與起草，于2022年11月提交團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《缺血性腦卒中動(dòng)物模型評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》的立項(xiàng)申請(qǐng)書，經(jīng)學(xué)會(huì)秘書長(zhǎng)審批通過(guò)后，于11月1日正式發(fā)布立項(xiàng)公告，并于同日在全國(guó)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)平臺(tái)發(fā)布立項(xiàng)公示。立項(xiàng)公示后，起草工作組著手開(kāi)展標(biāo)準(zhǔn)的編制工作并組織多次起草工作組的會(huì)議討論。經(jīng)過(guò)多輪研討和修改，2023年6月在廣東省精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)應(yīng)用學(xué)會(huì)主辦的第三屆華南疾病模型與臨床研究論壇之疾病模型標(biāo)準(zhǔn)撰寫與宣講研討會(huì)上，本標(biāo)準(zhǔn)起草工作組就標(biāo)準(zhǔn)初稿內(nèi)容進(jìn)行了匯報(bào)，并同與會(huì)專家進(jìn)行了充分交流。經(jīng)研究，起草工作組形成共識(shí)并提出以下建議：在同一標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目下，將標(biāo)準(zhǔn)分為《缺血性腦卒中動(dòng)物模型評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范第1部份：嚙齒類動(dòng)物》和《缺血性腦卒中動(dòng)物模型評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范第2部份：非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物》兩個(gè)部分來(lái)進(jìn)行編制，2023年9月，《缺血性腦卒中動(dòng)物模型制備技術(shù)規(guī)范第1部分：嚙齒類動(dòng)物》獨(dú)立開(kāi)展了有關(guān)立項(xiàng)審查和發(fā)布工作。標(biāo)準(zhǔn)起草工作組于2024年9月完成了編寫，上報(bào)學(xué)會(huì)標(biāo)委會(huì)秘書處，于10月完成了對(duì)本標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容的審核和格式重排，并啟動(dòng)發(fā)布征求意見(jiàn)公示工作。2.征求意見(jiàn)階段2024年11月學(xué)會(huì)標(biāo)委會(huì)秘書處將標(biāo)準(zhǔn)編制說(shuō)明和征求意見(jiàn)稿通過(guò)全國(guó)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)平臺(tái)發(fā)布公示，面向相關(guān)行業(yè)的單位和個(gè)人征求意見(jiàn)。到2024年12月，共收集到？條征求意見(jiàn)，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)起草工作組討論，采納？條，不采納？條。3.審查及報(bào)批階段標(biāo)準(zhǔn)起草工作組將對(duì)收集到的意見(jiàn)進(jìn)行認(rèn)真分析和處理，對(duì)征求意見(jiàn)稿進(jìn)行最后修改，形成標(biāo)準(zhǔn)送審稿。由學(xué)會(huì)標(biāo)委會(huì)秘書處組織技術(shù)審查。標(biāo)準(zhǔn)起草工作組根據(jù)審查意見(jiàn)修改整理后，最終形成標(biāo)準(zhǔn)草案報(bào)批稿，報(bào)廣東省精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)報(bào)批。（四）起草組成員及其工作主要起草成員皆參與了本標(biāo)準(zhǔn)的研究、討論和不同章節(jié)的編二、標(biāo)準(zhǔn)編制原則和確定標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容（一）標(biāo)準(zhǔn)編制原則標(biāo)準(zhǔn)制定遵守國(guó)家和地方相關(guān)法律、法規(guī)、方針、政策，在廣東省精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)章程規(guī)定的業(yè)務(wù)范圍內(nèi)，符合精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)相關(guān)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)制定范圍，是學(xué)會(huì)疾病動(dòng)物模型分會(huì)發(fā)展規(guī)劃內(nèi)容。2.公正性原則標(biāo)準(zhǔn)制定遵循開(kāi)放、透明、公平、公正的原則，本著動(dòng)物模型制備需要滿足相似性、重復(fù)性、可依性、適用性和可控性、易行性和經(jīng)濟(jì)性的原則，吸納醫(yī)療機(jī)構(gòu)、檢測(cè)機(jī)構(gòu)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究機(jī)構(gòu)代表參團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)制定。3.先進(jìn)性原則按照有利于科學(xué)合理利用資源，有利于提高經(jīng)濟(jì)效益、社會(huì)效益、生態(tài)效益的原則，做到技術(shù)上先進(jìn)、經(jīng)濟(jì)上合理，有利于精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)行業(yè)發(fā)展。4.正確性原則標(biāo)準(zhǔn)編寫依據(jù)國(guó)家重點(diǎn)領(lǐng)域研發(fā)結(jié)果，編寫過(guò)程中，對(duì)技術(shù)方法、評(píng)價(jià)參數(shù)等內(nèi)容進(jìn)行核驗(yàn)，保證其正確性。通過(guò)使用精準(zhǔn)的描寫詞匯、緊湊嚴(yán)密的語(yǔ)句結(jié)構(gòu)來(lái)準(zhǔn)確表達(dá)目的，力求讓不同知識(shí)水平不同專業(yè)背景的人充分理解標(biāo)準(zhǔn)所述內(nèi)容。5.簡(jiǎn)明性原則標(biāo)準(zhǔn)編寫時(shí)注意標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容簡(jiǎn)潔明了，力求讓標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容通俗易懂，并通過(guò)使用大眾化語(yǔ)言使使用者在參照本標(biāo)準(zhǔn)時(shí)能夠正確理解和執(zhí)行。6.本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了嚙齒類（實(shí)驗(yàn)小鼠和大鼠）缺血性腦卒中模本標(biāo)準(zhǔn)適用于實(shí)驗(yàn)嚙齒類局部永久性和缺血再灌注腦卒中模型構(gòu)建及應(yīng)用評(píng)價(jià)。（二）標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容本標(biāo)準(zhǔn)由范圍、規(guī)范性引用文件、術(shù)語(yǔ)和定義、動(dòng)物質(zhì)量和飼養(yǎng)要求、動(dòng)物模型制備方法、評(píng)價(jià)方法和結(jié)果判定共7部分組成。主要技術(shù)內(nèi)容如下。本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了實(shí)驗(yàn)小鼠、大鼠缺血性腦卒中模型制備的動(dòng)物質(zhì)量、飼養(yǎng)要求、制備方法、評(píng)價(jià)方法和結(jié)果判定。本標(biāo)準(zhǔn)適用于嚙齒類動(dòng)物缺血性腦卒中模型構(gòu)建及應(yīng)用評(píng)價(jià)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB14922實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物、寄生蟲(chóng)學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)GB/T14924.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物配合飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB14924.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物配合飼料營(yíng)養(yǎng)成分GB14925實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境及設(shè)施3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1缺血性腦卒中cerebralischemicstroke是指各種原因?qū)е碌哪X組織血液供應(yīng)障礙，并由此產(chǎn)生的缺血缺氧性壞死，進(jìn)而出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙的一類臨床綜合征。3.2神經(jīng)功能評(píng)價(jià)量表neurologicalfunctionassessmentscale用于評(píng)估動(dòng)物模型神經(jīng)功能缺損程度和恢復(fù)情況的工具，評(píng)價(jià)內(nèi)容包括意識(shí)水平、感覺(jué)系統(tǒng)、運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)和骨骼肌協(xié)調(diào)等。3.3動(dòng)物行為評(píng)價(jià)annimalbehavioralassessment以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為對(duì)象，在自然界或?qū)嶒?yàn)室內(nèi)，以觀察和實(shí)驗(yàn)方式對(duì)動(dòng)物的行為信息進(jìn)行采集、分析和處理，評(píng)價(jià)動(dòng)物行為信息的生理和病理意義。3.4運(yùn)動(dòng)能力評(píng)價(jià)motorfunctionassessment利用不同動(dòng)物運(yùn)動(dòng)評(píng)價(jià)設(shè)備，如步態(tài)分析系統(tǒng)等，觀察動(dòng)物在不同情境下的運(yùn)動(dòng)行為變化，用于測(cè)試和評(píng)價(jià)動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)能4動(dòng)物質(zhì)量及飼養(yǎng)要求動(dòng)物質(zhì)量應(yīng)符合GB14922的要求。飼養(yǎng)環(huán)境應(yīng)符合GB14925的要求。飼料應(yīng)符合GB/T14924.2和GB14924.3的要求。5模型制備方法實(shí)驗(yàn)嚙齒類動(dòng)物缺血性腦卒中模型制備方法包括栓塞法、光化學(xué)法和電凝法等。5.1栓塞法實(shí)驗(yàn)小鼠/大鼠缺血性卒中模型構(gòu)建的經(jīng)典方法，通過(guò)頸外動(dòng)脈插入線栓或血栓等，導(dǎo)致大腦中動(dòng)脈阻塞和再灌注。具體操作如下：1)術(shù)前準(zhǔn)備。選擇小鼠（體重控制在25-30g）、大鼠（體重控制在250至300g術(shù)前動(dòng)物禁食12小醉、備皮、消毒等準(zhǔn)備工作。2)麻醉。通常采用吸入類麻醉劑進(jìn)行麻醉，手術(shù)過(guò)程中保溫。3)手術(shù)。從頸部正中切開(kāi)皮膚，利用鑷子鈍性分離頸部腺體組織、筋膜，暴露并分離頸總動(dòng)脈（CCA）、頸外動(dòng)脈（ECA）和頸ECA遠(yuǎn)心端和近心端（留長(zhǎng)線頭并從兩個(gè)結(jié)扎點(diǎn)中間剪斷ECA。然后在ECA近分叉處用眼科剪45°剪一小斜口并插入線栓，松開(kāi)ICA動(dòng)脈夾，緩慢向ICA推入線栓，當(dāng)線栓遇到輕微阻力時(shí)即可停止，線栓插入深度一般根據(jù)小鼠和大鼠體重和實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行調(diào)整，小鼠常見(jiàn)深度為9-10mm（25-30g大鼠常見(jiàn)深度為18-22mm（250-300g）。插入過(guò)程中避免用力過(guò)猛后松開(kāi)CCA結(jié)扎，縫合皮膚。阻斷血流造成腦局部缺血60分鐘后，拔出線栓實(shí)現(xiàn)再灌注。術(shù)后，注意保持傷口清潔干燥，防止注意觀察小鼠的生命體征變化，如呼吸、心率等。5.2光化學(xué)法實(shí)驗(yàn)小鼠/大鼠皮層缺血性腦卒中模型構(gòu)建的常用方法，實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)簡(jiǎn)單。利用光敏劑（如玫瑰紅）在特定強(qiáng)度光照下發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，在大腦的照射局部產(chǎn)生腦水腫和血小板微血栓，形成局灶性腦梗死。具體操作如下：1)術(shù)前準(zhǔn)備。術(shù)前動(dòng)物禁食12小時(shí)，自由飲備皮、消毒等準(zhǔn)備工作。2)麻醉。通常采用注射類麻醉劑進(jìn)行麻醉，手術(shù)過(guò)程中保溫。3)手術(shù)。將小鼠/大鼠頭部固定于腦立體定位儀上，在前囟旁劃定圓形區(qū)域，該區(qū)域以外進(jìn)行避光處理。從動(dòng)物眼底注射玫瑰紅溶液，開(kāi)啟激光發(fā)射器（532nm對(duì)圓形區(qū)域進(jìn)行激光照射8分鐘，形成局部永久缺血，縫合頭皮。實(shí)驗(yàn)小鼠和大鼠缺血性腦卒中永久閉塞模型構(gòu)建方法。利用開(kāi)顱手術(shù)暴露嚙齒類動(dòng)物腦中動(dòng)脈并進(jìn)行永久性阻斷。具體方法1)術(shù)前準(zhǔn)備。術(shù)前動(dòng)物禁食12小時(shí)，自由飲備皮、消毒等準(zhǔn)備工作。2)麻醉。通常采用吸入類麻醉劑進(jìn)行麻醉，手術(shù)過(guò)程中保溫。3)手術(shù)。在無(wú)菌條件下進(jìn)行手術(shù)操作，切開(kāi)小鼠/大鼠頭部皮膚，暴露顱骨。使用微型電凝器，將電凝探頭置于小鼠/大鼠大腦中動(dòng)脈的適當(dāng)位置，使大腦中動(dòng)脈永久性阻斷。注意控制電凝時(shí)間和強(qiáng)度，避免損傷周圍組織。注意觀察小鼠的生命體征變化，如呼吸、心率等。6評(píng)價(jià)方法6.1腦血流檢測(cè)采用激光散斑血流儀檢測(cè)動(dòng)物腦缺血情況。動(dòng)物麻醉后俯臥，頭部備皮消毒后，切開(kāi)皮膚，暴露顱骨，在激光散斑成像儀下，觀察腦血流圖像，選定損傷側(cè)缺血區(qū)域，測(cè)定10s內(nèi)平均血流值，同時(shí)，選定非損傷側(cè)相同區(qū)域測(cè)定血流值，評(píng)價(jià)大腦中動(dòng)脈阻斷后的缺血情況。6.2神經(jīng)損害嚴(yán)重程度評(píng)分造模前先按照附錄A對(duì)動(dòng)物進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，排除不滿足評(píng)分要求的動(dòng)物。造模后2小時(shí)，動(dòng)物完全清醒后，在安靜環(huán)境中，進(jìn)行神經(jīng)神經(jīng)損害嚴(yán)重程度評(píng)價(jià)。逐項(xiàng)評(píng)分，所有單項(xiàng)分?jǐn)?shù)相加則為動(dòng)物神經(jīng)損害程度評(píng)分，總分為18分。一般選擇3名觀察人員進(jìn)行量表評(píng)價(jià)，統(tǒng)計(jì)3名觀察員的平均值作為神經(jīng)功能評(píng)分量值。6.3運(yùn)動(dòng)行為評(píng)價(jià)采用疲勞轉(zhuǎn)棒裝置進(jìn)行運(yùn)動(dòng)行為評(píng)價(jià)。轉(zhuǎn)速設(shè)置從0rpm緩慢加速至40rpm，測(cè)試時(shí)間為300秒，測(cè)試時(shí)將動(dòng)物置于旋轉(zhuǎn)棒上，記錄動(dòng)物從旋轉(zhuǎn)棒上掉落的時(shí)間。造模前，按照上述參數(shù)設(shè)置對(duì)動(dòng)物進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練，待動(dòng)物從旋轉(zhuǎn)棒上掉落的時(shí)間穩(wěn)定按照上述參數(shù)設(shè)置開(kāi)展疲勞轉(zhuǎn)棒試驗(yàn)，記錄動(dòng)物從轉(zhuǎn)棒上掉落的時(shí)間，每天進(jìn)行3次試驗(yàn)，每次間隔30分鐘。根據(jù)3次測(cè)定的平均掉落時(shí)間評(píng)價(jià)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)能力。6.4腦梗死體積測(cè)定采用2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色評(píng)價(jià)動(dòng)物腦梗死體積。動(dòng)物安樂(lè)死后取腦，并在腦模具中將腦切成厚度相同的切片，隨后將切片置于TTC染液中，避光37℃烘箱孵育。待正常腦組織呈現(xiàn)出鮮紅色，腦梗部位呈現(xiàn)出蒼白色后，將腦片置于4%多聚甲醛中固定后拍照，并將圖像導(dǎo)入醫(yī)學(xué)圖像處理軟件ImageJ分別計(jì)算每張腦切片的面積，所有切片梗死灶所在半腦正常腦組織面積、對(duì)側(cè)正常半腦面積相加后乘以切片厚度，得到梗死灶所在半腦正常腦組織體積及對(duì)側(cè)正常半腦體積，并利用公式計(jì)算腦梗死體積比。6.5組織病理診斷動(dòng)物麻醉后放血，分別用生理鹽水和多聚甲醛對(duì)腦組織進(jìn)行灌注，分離腦組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明后進(jìn)行石蠟包埋制成蠟塊，在組織切片機(jī)上將蠟塊切成厚度為4μm的切片，切片應(yīng)包含整個(gè)梗死灶及周邊半暗帶組織，然后進(jìn)行蘇木素-伊紅或尼氏染色并封片。由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病理學(xué)專家進(jìn)行雙盲閱片診斷，觀察梗死灶和半暗帶組織神經(jīng)元壞死及炎癥細(xì)胞活化情況。7.1模型活體評(píng)價(jià)指標(biāo)1)腦血流。造模后，可見(jiàn)動(dòng)物腦缺血區(qū)域血管內(nèi)血流信號(hào)明顯減弱，表明動(dòng)物出現(xiàn)腦局部缺血。2)神經(jīng)損害嚴(yán)重程度評(píng)分。神經(jīng)損害嚴(yán)重程度評(píng)分越高說(shuō)明損分為嚴(yán)重?fù)p傷。造模后，模型組動(dòng)物神經(jīng)評(píng)分應(yīng)至少達(dá)到輕度損傷或以上。3)運(yùn)動(dòng)功能。造模后，模型組動(dòng)物從旋轉(zhuǎn)棒上掉落時(shí)間平均值應(yīng)顯著低于造模前。4)磁共振成像。必要時(shí)，造模小鼠通過(guò)磁共振掃描顯示典型的梗死特征。7.2腦梗死體積動(dòng)物處死后，TTC染色顯示腦梗死部位明顯的蒼白色?？赏ㄟ^(guò)下列公式計(jì)算動(dòng)物腦梗死體積百分比，腦梗死體積比（%）=（對(duì)側(cè)正常半腦體積-梗死灶所在半腦正常腦組織體積）×100%÷對(duì)側(cè)正常半腦體積。7.3組織病理動(dòng)物處死后，病理診斷可見(jiàn)梗死灶內(nèi)大量神經(jīng)細(xì)胞壞死，神經(jīng)元核固縮、胞漿呈嗜酸性，在半暗帶區(qū)可見(jiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度活化，膠質(zhì)細(xì)胞胞體增大和大量聚集以及炎癥細(xì)胞三、主要試驗(yàn)（或驗(yàn)證）的分析、綜述報(bào)告，技術(shù)經(jīng)濟(jì)論證，預(yù)期的經(jīng)濟(jì)效果標(biāo)準(zhǔn)編制相關(guān)單位，在國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“急性局灶性腦缺血后全腦保護(hù)評(píng)估體系及轉(zhuǎn)化研究”期間，團(tuán)隊(duì)完成從嚙齒類到非人靈長(zhǎng)類的腦缺血性卒中模型構(gòu)建，建立影像學(xué)、行為學(xué)的評(píng)價(jià)體系。項(xiàng)目的結(jié)題報(bào)告、相關(guān)的成果可體現(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)模型的可行性。并進(jìn)一步經(jīng)過(guò)文獻(xiàn)查閱、技術(shù)調(diào)研、咨詢、驗(yàn)證、收集和總結(jié)相關(guān)資料，對(duì)評(píng)價(jià)試驗(yàn)方案進(jìn)行了進(jìn)一步的優(yōu)化，具有較強(qiáng)的適用性、可行性。1.腦血流檢測(cè)。激光散斑血流檢測(cè)是評(píng)價(jià)嚙齒類腦缺血性卒中模型血管阻塞的重要手段(Yuetal.2010)，Pubmed檢索顯示該方法在372篇已發(fā)表的相關(guān)嚙齒類缺血性腦卒中模型論文中被應(yīng)用。我們使用光化學(xué)法構(gòu)建的小鼠缺血性腦卒中模型，對(duì)造模后24小時(shí)腦血流情況進(jìn)行測(cè)定，腦缺血區(qū)域的相對(duì)血流值（CBF）較對(duì)照組圖1小鼠缺血性腦卒中模型腦血流值測(cè)定2.神經(jīng)功能評(píng)分。依據(jù)常用的嚙齒類神經(jīng)功能評(píng)價(jià)量表開(kāi)展評(píng)價(jià)(Chenetal.2001,Hattorietal.2012)，Pubmed檢索顯示該方法在490篇已發(fā)表的相關(guān)嚙齒類缺血性腦卒中模型論文中被應(yīng)用。我們使用線栓法構(gòu)建的小鼠腦缺血性卒中模型，造模后24小時(shí)神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)價(jià)，與對(duì)照組進(jìn)行比較，模型組小鼠較對(duì)照組評(píng)分顯著升高，模型組評(píng)分為10.60±0.8718分，動(dòng)物表現(xiàn)為中度神經(jīng)功能圖2小鼠缺血性腦卒中模型神經(jīng)功能評(píng)分3.運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)。疲勞轉(zhuǎn)棒測(cè)試是評(píng)價(jià)嚙齒類缺血性腦卒中模型運(yùn)動(dòng)功能損傷的常用方法(Bernard,BalkayaandRex2016)，Pubmed檢索顯示該方法在195篇已發(fā)表的相關(guān)嚙齒類缺血性腦卒中模型論文中被應(yīng)用。我們使用光化學(xué)法構(gòu)建的小鼠缺血性腦卒中模型進(jìn)行運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)，造模24小時(shí)后，模型組小鼠在轉(zhuǎn)棒上停留時(shí)間較圖3小鼠缺血性腦卒中模型運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)4.腦梗死體積測(cè)定。2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色是觀察嚙齒類動(dòng)物腦缺血腦梗死體積的常用技術(shù)(Liuetal.2009)，Pubmed檢索顯示該方法在369篇已發(fā)表的相關(guān)嚙齒類缺血性腦卒中模型論文中被應(yīng)用。我們使用線栓法和光化學(xué)法構(gòu)建的小鼠缺血性腦卒中模型進(jìn)行腦梗死體積測(cè)定，造模后24小時(shí)，TTC染色顯示，造模后兩種模型腦中均出現(xiàn)明顯的梗死灶（圖4，白色箭頭所示）。圖4小鼠缺血性腦卒中模型腦梗死體積測(cè)定5.組織病理診斷。組織病理診斷是評(píng)價(jià)嚙齒類腦缺血模型組織細(xì)胞變化的經(jīng)典方法(Sommer2016)。我們使用線栓法和光化學(xué)法構(gòu)建的小鼠缺血性腦卒中模型，HE染色顯示，光化學(xué)法造模后7天，腦組織顯示明顯的腦梗死灶，梗死灶內(nèi)可見(jiàn)大量神經(jīng)細(xì)胞壞死，神經(jīng)元核固縮、胞漿嗜酸性等（圖5）。免疫熒光染色顯示，梗死灶內(nèi)神經(jīng)元特異性染色明顯減少（圖6，NeuN梗死灶周邊出現(xiàn)大量聚集，膠質(zhì)細(xì)胞胞體增大等病理改變。圖5小鼠缺血性腦卒中模型HE染色圖6小鼠缺血性腦卒中模型免疫熒光染色。GFAP，星形膠質(zhì)細(xì)胞；Iba-1，小膠質(zhì)細(xì)胞；NeuN，神經(jīng)元。四、標(biāo)準(zhǔn)涉及的相關(guān)知識(shí)產(chǎn)權(quán)說(shuō)明1.沒(méi)有違反相關(guān)法律法規(guī)及強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)，目前暫無(wú)相關(guān)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。2.參考的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)管理相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，與制定的團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)不沖突。GB14922實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物、寄生蟲(chóng)學(xué)等級(jí)及檢測(cè)GB/T14924.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物配合飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB14924.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物配合飼料營(yíng)養(yǎng)成分GB14925實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境及設(shè)施T/CALAS104實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)猴神經(jīng)行為評(píng)價(jià)規(guī)范3.2023年2月中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)發(fā)布了《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物缺血性腦卒中嚙齒類動(dòng)物模型評(píng)價(jià)規(guī)范》團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)，本標(biāo)準(zhǔn)與該標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容主要差別為，本標(biāo)準(zhǔn)除對(duì)模型評(píng)價(jià)技術(shù)進(jìn)行規(guī)范外，還對(duì)常用的嚙齒類缺血性腦卒中模型制備技術(shù)進(jìn)行了規(guī)范，同時(shí)，在模型評(píng)價(jià)方面，本標(biāo)準(zhǔn)在運(yùn)動(dòng)行為等指標(biāo)上與該標(biāo)準(zhǔn)也存在差異。五、采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的程度與水平的簡(jiǎn)要說(shuō)明目前，缺血性腦卒中造模和模型評(píng)價(jià)方法主要由國(guó)外實(shí)驗(yàn)室建立，我國(guó)在這方面的研究起步較晚，主要沿用國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道的評(píng)價(jià)方法。我們?cè)谇捌谘芯恐校⑷毖阅X卒中臨床前多中心評(píng)價(jià)體系（廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所，中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院通過(guò)構(gòu)建嚙齒類動(dòng)物模型，并通過(guò)神經(jīng)功能，梗死體積，學(xué)習(xí)記憶運(yùn)動(dòng)功能等方面進(jìn)行評(píng)價(jià)，建立了多中心評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，并在多個(gè)團(tuán)隊(duì)進(jìn)行測(cè)試，證明該方案漸變可行，完全滿足評(píng)價(jià)要求，具有推廣應(yīng)用價(jià)值，有效支撐標(biāo)準(zhǔn)制定。六、重大意見(jiàn)分歧的處理經(jīng)過(guò)和依據(jù)七、其他應(yīng)予說(shuō)明的事項(xiàng)參考文獻(xiàn)Bernard,R.,M.Balkaya&A.Rex.2016.BehavioralTestinginRodentModelsofStroke,PartI.InRodentModelsofStroke,ed.U.Dirnagl,199-223.NewYork,NY:SpringerNewYork.Chen,J.,Y.Li,L.Wang,Z.Zhang,D.Lu,M.Lu&M.Chopp(2001)Therapeuticbenefitofintravenousadministrationofbonemarrowstromalcellsaftercerebralischemiainrats.Stroke,32,1005-11.Han,J.,S.Yang,X.Hao,B.Zhang,H.Zhang,C.Xin&Y.Hao(2020)ExtracellularVesicle-DerivedmicroRNA-410FromMesenchymalStemCellsProtectsAgainstNeonatalHypoxia-IschemiaBrainDamageThr