第11章酶的作用機制和酶的調(diào)節(jié)第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)主要內(nèi)容酶的活性部位及其確定方法酶促反應(yīng)機制酶活性的別構(gòu)調(diào)節(jié)酶活性的共價調(diào)節(jié)同工酶第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)11.1、酶的活性部位（一）基本概念：酶的活性中心（activecenter）是指結(jié)合底物和將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的區(qū)域，通常是一級結(jié)構(gòu)相隔很遠，而三維結(jié)構(gòu)比較靠近的氨基酸殘基形成的三維實體。酶的活性中心包括兩個功能部位：結(jié)合部位和催化部位。1．結(jié)合部位（Bindingsite）酶分子中與底物結(jié)合的部位或區(qū)域一般稱為結(jié)合部位。此部位決定酶的專一性。2．催化部位（catalyticsite）酶分子中促使底物發(fā)生化學(xué)變化的部位稱為催化部位。此部位決定酶所催化反應(yīng)的性質(zhì)。第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)（二）酶活性部位的特點1.活性中心只占酶分子總體積的很小一部分，往往只占整個酶分子體積的1%-2%。2.酶的活性部位是一個三維實體，具有三維空間結(jié)構(gòu)。3.酶的活性部位并不是和底物的形狀正好互補的，而是在酶和底物的結(jié)合過程中，底物分子或酶分子、有時是兩者的構(gòu)象同時發(fā)生了一定的變化后才互補的，此時催化基團的位置正好處在所催化底物鍵的斷裂和即將生成鍵的適當(dāng)位置，這個動態(tài)辨認過程稱為誘導(dǎo)契合（induced-fit）.第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)4.酶的活性部位位于酶分子表面的一個裂隙（crevice）內(nèi).裂隙內(nèi)是一個相當(dāng)疏水的環(huán)境，從而有利于同底物的結(jié)合。5.底物靠次級鍵較弱的力與酶結(jié)合。6.酶的活性部位具有柔性和可運動性第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)課下習(xí)題：如何確定酶的活性部位？第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)11.2、酶促反應(yīng)機制酶促反應(yīng)中發(fā)生的最本質(zhì)變化是什么？第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)（一）基元催化的分子機制酶是最復(fù)雜的催化劑，它的催化作用包括若干基元催化?；呋怯赡承┗鶊F或小分子催化反應(yīng)的，包括酸堿催化、共價催化、和金屬離子催化等。這些小分子催化劑或催化基團不是親電體（eletrophilicgroup）就是親核體(nucleophilicgroup)，它們是電荷極化的結(jié)果。第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的水解——酸堿催化與共價催化生物體內(nèi)每時每刻都在發(fā)生著蛋白質(zhì)的水解反應(yīng)但是，生理pH下，沒有催化劑時，肽鍵極難水解。（為什么？）第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)酰胺氮上的孤對電子與相鄰羰基之間具有共振作用，形成共振雜化體，阻止了水對羰基的親核進攻。從化學(xué)的角度，如何幫助水實現(xiàn)對羰基的親核進攻？第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)1、酸堿催化（acid-basecatalysis）酸-堿催化可分為狹義的酸-堿催化和廣義的酸-堿催化。酶參與的酸-堿催化反應(yīng)一般都是廣義的酸－堿催化方式。廣義酸－堿催化是指通過質(zhì)子酸提供部分質(zhì)子,或是通過質(zhì)子堿接受部分質(zhì)子的作用，以穩(wěn)定過渡態(tài)，達到降低反應(yīng)活化能的一種催化機制。第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)酶分子中可作為酸堿催化的功能基團第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)影響酸堿催化反應(yīng)的因素包括酸堿強度及質(zhì)子傳遞的速率。His咪唑基的解離常數(shù)約6.0，咪唑基解離下來的質(zhì)子濃度與水中的[H+]相近，在中性條件下，一半以酸形式存在，一半以堿形式存在;同時，咪唑基接受質(zhì)子和供出質(zhì)子的速率十分迅速，半衰期小于10-10秒。所以，His是酶中最有效最活潑的一個催化功能基團。第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)2、共價催化（Covalentcatalysis）共價催化包括親核催化和親電催化。但由于參與共價催化的主要是親核基團，所以共價催化也稱為親核催化。第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)胰凝乳蛋白酶的Asp102、His57、Ser195組成了催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)（thecatalytictriad）第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)通過Asp102、His57、Ser195組成的質(zhì)子傳遞鏈，使Ser195失去質(zhì)子，生成強親核基團-O-第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)底物結(jié)合(step1),S195羥基對底物羰基碳發(fā)動親核進攻。(step2).底物羰基氧附近的酰胺區(qū)域可以穩(wěn)定氧負離子第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)氧離子洞第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)在His57幫助下，H2O對酯基的羰基碳發(fā)動親核進攻。同樣通過四面體中間體，生成羧基，離開活性中心。第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)胰凝乳蛋白酶催化蛋白質(zhì)的水解第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)絲氨酸蛋白酶的催化機制第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)共價催化是由親核催化劑加速反應(yīng)的，催化劑向反應(yīng)物的親電中心提供電子，形成共價配位鍵，并產(chǎn)生一個不穩(wěn)定的共價中間物。中間物的反應(yīng)性比原來的反應(yīng)物更大，將受到第二底物，如H2O分子進攻，生成最終產(chǎn)物第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)應(yīng)用舉例：有機磷殺蟲劑第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)3、金屬離子催化１）需要金屬的酶分類：

（1）金屬酶－metalloenzyme:含緊密結(jié)合的金屬離子。如Fe2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+、Mn2+

（2）金屬-激活酶（metal-activatedenzyme）:含松散結(jié)合的金屬離子，如Na+K+Mg2+Ca2+2）金屬離子的催化作用：通過結(jié)合底物為反應(yīng)定向。通過可逆的改變金屬離子的氧化態(tài)調(diào)節(jié)氧化還原反應(yīng)。通過靜電穩(wěn)定或屏蔽靜電荷。第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)金屬離子催化的例證：烯醇化酶第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)（二）酶具有高催化能力的原因1、底物和酶的鄰近效應(yīng)（approximation）與定向效應(yīng)（orientation）在酶促反應(yīng)中，由于酶和底物分子之間的親和性，底物分子有向酶的活性中心靠近的趨勢，最終結(jié)合到酶的活性中心，使底物在酶活性中心的有效濃度大大增加的效應(yīng)叫做鄰近效應(yīng)。定向效應(yīng)：當(dāng)專一性底物向酶活性中心靠近時，會誘導(dǎo)酶分子構(gòu)象發(fā)生改變，使酶活性中心的相關(guān)基團和底物的反應(yīng)基團正確定向排列，同時使反應(yīng)基團之間的分子軌道以正確方向嚴格定位，使酶促反應(yīng)易于進行。以上兩種效應(yīng)使酶具有高效率和專一性特點。第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)咪唑催化對-硝基苯酚乙酸酯的水解反應(yīng)第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)實驗結(jié)果表明，分子內(nèi)咪唑基參與的水解反應(yīng)速度比相應(yīng)的分子間反應(yīng)速度大24倍。說明咪唑基與酯基的相對位置對水解反應(yīng)速度具有很大的影響。第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)軌道定向(orbital-steering)假說示意圖第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)Rateenhancementbyentropyreduction.Shownherearereactionsofanesterwithacarboxylategrouptoformananhydride.TheRgroupisthesameineachcase.第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)2、誘導(dǎo)契合（inducedfit）和底物的形變（distortion）酶-底物復(fù)合物形成時，酶分子構(gòu)象發(fā)生變化，底物分子也常常受到酶的作用而發(fā)生變化，甚至使底物分子發(fā)生扭曲變形，從而使底物分子某些鍵的鍵能減弱，產(chǎn)生鍵扭曲，有助于過度態(tài)的中間產(chǎn)物形成,從而降低了反應(yīng)的活化能。第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)誘導(dǎo)契合模型與底物的形變第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)第4個糖殘基D環(huán)因空間原因必須由正常的椅式變形為能量較高的半椅式構(gòu)象。因此糖苷鍵的穩(wěn)定性降低，鍵容易從此斷裂。第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)3、電荷極化和多元催化酶催化反應(yīng)時常常是幾個功能團適當(dāng)排列共同作用。如胰凝乳蛋白酶活性中心處三個氨基酸殘基組成“電荷中繼網(wǎng)”，催化肽鍵水解；核糖核酸酶催化水解時，His12起廣義堿催化作用，接受一個質(zhì)子，而His119起廣義酸作用，和磷酸的氧原子形成氫鍵。第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)4、疏水微環(huán)境影響酶促反應(yīng)在酶表面的疏水裂縫（活性中心）中進行，如同在有機溶劑中反應(yīng)。疏水環(huán)境中介電常數(shù)比在水中低，兩個電荷之間的作用力顯著的增強，親核親電反應(yīng)均可加速。如溶菌酶Glu35的羧基在非極性區(qū)，催化功能增速3×106倍。酶的微環(huán)境還創(chuàng)造了溶液中不可能達到的條件，如同時存在高濃度的酸堿。第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)四、酶活性的別構(gòu)調(diào)節(jié)生物體內(nèi)酶催化反應(yīng)的調(diào)節(jié)可以通過改變酶結(jié)構(gòu)而使其催化活性發(fā)生改變，也可以通過改變酶含量來改變其催化速率，還可以通過以不同形式的酶在不同組織中的分布差異來調(diào)節(jié)代謝活動。第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)酶結(jié)構(gòu)的調(diào)解是通過對現(xiàn)有酶分子結(jié)構(gòu)的影響來改變酶的催化活性。這是一種快速調(diào)節(jié)方式。分為別構(gòu)調(diào)控和共價調(diào)控兩種機制。第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)別構(gòu)調(diào)控很多寡聚酶，當(dāng)它們的亞基上的配體結(jié)合部位與配體非共價可逆結(jié)合時，將發(fā)生構(gòu)象變化并影響同一酶分子上的其它亞基上的空活性部位的親和力，這一現(xiàn)象稱為酶的別構(gòu)調(diào)節(jié)（allostericregulation）。酶的別構(gòu)效應(yīng)包括涉及酶與底物結(jié)合時催化部位和催化部位之間的相互作用即同促效應(yīng)，和涉及酶與調(diào)節(jié)物結(jié)合時調(diào)節(jié)部位與活性部位之間的相互作用即異促效應(yīng)。具有這種調(diào)節(jié)作用的酶稱為別構(gòu)酶（allosericenzyme）。第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)凡能使酶分子發(fā)生別構(gòu)作用的物質(zhì)稱為效應(yīng)物（effector）或別構(gòu)劑。因別構(gòu)導(dǎo)致酶活性增加的物質(zhì)稱為正效應(yīng)物（positiveeffector）或別構(gòu)激活劑，反之稱為負效應(yīng)物（negativeeffector）或別構(gòu)抑制劑。第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)當(dāng)別構(gòu)酶的一個亞基與其配體（底物或別構(gòu)劑）結(jié)合后，能夠通過改變相鄰亞基的構(gòu)象而使其對配體的親和力發(fā)生改變，這種效應(yīng)就稱為別構(gòu)酶的協(xié)同效應(yīng)。別構(gòu)劑一般以反饋方式對代謝途徑的起始關(guān)鍵酶進行調(diào)節(jié)，常見的為負反饋調(diào)節(jié)。ABCDPE1E2E3En第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)典型的別構(gòu)酶－天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶（ATCase）ATCase的一個最有效的抑制劑是代謝途徑的終產(chǎn)物胞嘧啶三磷酸（CTP），而ATP是酶的激活劑。在E.coli中ATCase催化由氨甲酰磷酸和天冬氨酸生成氨甲酰天冬氨酸。第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)N-氨基甲酰磷酸與天冬氨酸的結(jié)合是協(xié)同的，協(xié)同結(jié)合使底物濃度只在一個很窄的范圍內(nèi)開啟N-氨甲酰天冬氨酸的合成。底物分子本身對別構(gòu)酶的調(diào)節(jié)作用稱為同促效應(yīng)。別構(gòu)激活別構(gòu)抑制V0[S]底物敏感區(qū)第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)CTP在不影響酶的Vmax的情況下，通過降低酶與底物的親和性來抑制ATCase；ATP可增強酶與底物的親和性，也不影響Vmax。這種非底物分子的調(diào)節(jié)物對酶的調(diào)節(jié)作用，稱為異促效應(yīng)。別構(gòu)激活別構(gòu)抑制V0[S]底物敏感區(qū)第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)Twoviewsoftheregulatoryenzymeaspartatetranscarbamoylase.(DerivedfromPDBID2AT2.)Thisallostericregulatoryenzymehastwostackedcatalyticclusters,eachwiththreecatalyticpolypeptidechains(inshadesofblueandpurple),andthreeregulatoryclusters,eachwithtworegulatorypolypeptidechains(inredandyellow).Theregulatoryclustersformthepointsofatrianglesurroundingthecatalyticsubunits.Bindingsitesforallostericmodulatorsareontheregulatorysubunits.Modulatorbindingproduceslargechangesinenzymeconformationandactivity.第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)別構(gòu)酶的基本性質(zhì)別構(gòu)酶一般是寡聚酶，通過次級鍵由多亞基構(gòu)成。因別構(gòu)酶有協(xié)同效應(yīng)，故其[S]對v的動力學(xué)曲線不符合米氏方程。效應(yīng)物可分為K型和V型兩種類型。別構(gòu)酶經(jīng)加熱或化學(xué)試劑處理，可引起別構(gòu)酶解離，失去調(diào)節(jié)活性，稱為脫敏作用。第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)多亞基調(diào)節(jié)亞基催化亞基協(xié)同效應(yīng)別構(gòu)激活劑別構(gòu)抑制劑正協(xié)同負協(xié)同Back第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)別構(gòu)酶的動力學(xué)[S]對v的動力學(xué)曲線不是雙曲線，而是S形曲線（正協(xié)同）或表觀雙曲線（負協(xié)同），兩者均不符合米氏方程。2米氏曲線1負協(xié)同3正協(xié)同321V0[S]V第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)正協(xié)同效應(yīng)：底物或調(diào)節(jié)物的結(jié)合大大增加了酶對后續(xù)底物分子的親和性。（S型曲線）負協(xié)同效應(yīng)：底物濃度較小的范圍內(nèi)，酶活力上升很快，隨后底物濃度雖有較大提高，但反應(yīng)速率升高很小，表現(xiàn)為負協(xié)同。（表觀雙曲線）第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)飽和比值（Rs）可用來鑒別不同的協(xié)同作用以及協(xié)同的程度。典型的米氏類型的酶Rs=81

具有正協(xié)同效應(yīng)的別構(gòu)酶Rs<81，Rs正協(xié)同效應(yīng)具有負協(xié)同效應(yīng)的別構(gòu)酶Rs>81，Rs負協(xié)同效應(yīng)第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)意義：在很小的濃度（底物、調(diào)節(jié)物）范圍內(nèi)嚴格控制酶活力，因此是生物代謝中許多代謝途徑的關(guān)鍵酶。別構(gòu)激活別構(gòu)抑制V0[S]底物敏感區(qū)2米氏曲線1負協(xié)同3正協(xié)同321V0[S]VBack第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)K型效應(yīng)物和V型效應(yīng)物BackK型V型第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)別構(gòu)模型齊變模型（WMC）別構(gòu)酶的所有亞基，或全部呈堅固緊密的，不利于結(jié)合底物的“T”狀態(tài)，或者全部是松散的，有利于結(jié)合底物的"R"狀態(tài)，這兩種狀態(tài)間的轉(zhuǎn)變對于每個亞基都是同時的，齊步發(fā)生的。"T"狀態(tài)中亞基的排列是對稱的，變成"R"狀態(tài)后亞基的排列仍然是對稱的。第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)序變模型（KNF）酶分子中的亞基結(jié)合小分子物質(zhì)（底物或調(diào)節(jié)物）后，亞基構(gòu)象逐個地依次變化，因此亞基有各種可能的構(gòu)象狀態(tài)。

Back第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)五、酶活性的共價調(diào)節(jié)共價調(diào)節(jié)即利用蛋白質(zhì)共價結(jié)構(gòu)的變化調(diào)節(jié)酶的活性，包括不可逆共價變化（酶原激活）和可逆共價變化（如磷酸化）兩種形式。第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)（一）不可逆共價調(diào)節(jié)——酶原的激活處于無活性狀態(tài)的酶的前體物質(zhì)就稱為酶原。酶原在一定條件下轉(zhuǎn)化為有活性的酶的過程稱為酶原的激活。酶原的激活過程通常伴有酶蛋白一級結(jié)構(gòu)的改變。酶原分子一級結(jié)構(gòu)的改變導(dǎo)致了酶原分子空間結(jié)構(gòu)的改變，使催化活性中心得以形成，故使其從無活性的酶原形式轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘拿?。舉例：消化系統(tǒng)蛋白酶原的激活，凝血機制。第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)消化系統(tǒng)蛋白酶原的激活第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)凝血機制第11章酶的作用機制和酶活性調(diào)節(jié)（二）可逆共價調(diào)控