胚胎工程與胚胎移植

1胚胎移植、引物、混凝土聯(lián)合新聞胚胎生物工程技術(shù)是通過人工方法對動物卵母細胞或胚胎進行重建的技術(shù)。包含胚胎移植、排卵控制、體外受精、胚胎性別控制、胚胎分割、胚胎冷凍、胚胎嵌合等內(nèi)容。目前,胚胎工程已在遺傳學、醫(yī)學、發(fā)育生物學、動物育種學上得到廣泛應用。2中國洛意技術(shù)部的發(fā)展2.1重視家兔胚胎的移植動物胚胎移植的技術(shù)程序為供、受體的同期發(fā)情、供體的超數(shù)排卵、胚胎采集、胚胎的評定、胚胎的保存與培養(yǎng)、胚胎移植等步驟。胚胎移植是配子與胚胎生物工程技術(shù)的重要基礎(chǔ)。1890年,WalterHrape首先獲得兔胚胎移植成功,隨后在小鼠、大鼠及多種哺乳動物上均獲成功。在奶牛的繁育中,胚胎移植技術(shù)已被證實是促進了奶牛繁育的一次重大變革,極大的提高了優(yōu)秀母牛的利用率,產(chǎn)生更多優(yōu)秀后備母牛和更多優(yōu)質(zhì)種公牛。在現(xiàn)場條件下,奶牛的鮮胚移植妊娠率已達到60%~85%,凍胚移植妊娠率達50%~70%。2.2微注射旋轉(zhuǎn)使用原核胚排卵控制分為排卵時間控制和排卵數(shù)量的控制?？刂婆怕褧r間的目的是得到特定發(fā)育階段卵母細胞,如做微注射轉(zhuǎn)基因使用的原核胚。排卵數(shù)量的控制又稱為超數(shù)排卵,是為了獲得更多的卵子。目前在控制排卵中常用的激素有FSH、LH、PMSG、HCG和PGF2a及類似物。2.3體外受精和顯微外科2.3.1東南角混合培養(yǎng)系統(tǒng)1951年Chang和Austin首次發(fā)現(xiàn)哺乳動物精子獲能現(xiàn)象,開創(chuàng)了哺乳動物體外受精研究的新紀元,第一次試管動物是1959年出生的試管兔。胚胎的體外受精技術(shù)主要有二種方法。一種是共培養(yǎng)系統(tǒng)。這一系統(tǒng)先在培養(yǎng)皿上貼壁培養(yǎng)輸卵管上皮細胞、滋養(yǎng)層細胞或顆粒細胞等,然后將未成熟卵母細胞和貼壁培養(yǎng)的細胞一起共培養(yǎng),繼而加入獲能精子產(chǎn)生受精卵,最后在條件培養(yǎng)基中培養(yǎng),生產(chǎn)出可用胚胎。另一種方法是人工合成培養(yǎng)系統(tǒng),主要是人工合成輸卵管液(SOF)。相對而言,人工合成輸卵管液系統(tǒng)的操作比較簡單,而且經(jīng)過近年來的研究和完善,SOF培養(yǎng)系統(tǒng)的培養(yǎng)效果已達到甚至超過共培養(yǎng)系統(tǒng)。體外受精所用的精子在大、中型動物上可采用人工采精獲得,小動物從附睪獲得。卵子來源有兩種方法,小動物采用超數(shù)排卵處理,從輸卵管采集成熟卵子或從卵巢采集未成熟卵子進行體外成熟。牛、羊等動物可利用活體采卵或屠宰卵巢獲得。目前制約體外受精的主要因素是:①在體外培養(yǎng)的卵母細胞,其細胞是否真正成熟,細胞質(zhì)是否真正成熟不僅影響到受精,而且對卵裂及胚胎發(fā)育甚至著床和出生后也有較大影響,應在培養(yǎng)條件上進行研究。②多精子受精難以控制,導致正常發(fā)育率低;可通過調(diào)整精子濃度或受精時間來控制。③體外受精的胚胎在體外發(fā)育至一定階段時發(fā)生發(fā)育阻斷(block),不同動物其阻斷的階段亦不同;運用共培養(yǎng)或在培養(yǎng)液中添控制特殊成分可使一部分胚胎通過發(fā)育阻斷階段繼續(xù)發(fā)育。季節(jié)性繁殖動物,在非繁殖季節(jié)內(nèi),其卵母細胞體外成熟比較困難。休止卵泡卵母細胞的體外成熟正在起步。2.3.2精卵質(zhì)內(nèi)注射隨著顯微操作技術(shù)和設備的完善,出現(xiàn)了顯微受精技術(shù)。這一技術(shù)是通過對動物配子進行顯微操作以使其受精。目前有透明帶下注射、透明帶鉆孔、透明帶部分切口和卵細胞質(zhì)內(nèi)注射等方法。前三種技術(shù)可排除透明帶對精子入卵的屏障作用(這時的精子能游動且能穿入卵質(zhì)膜),卵細胞質(zhì)內(nèi)注射可解除精子穿入透明帶和精卵質(zhì)膜兩重屏障作用。最早是Uehaya和Yanagimachi將倉鼠的精子顯微注射到倉鼠的卵母細胞內(nèi)獲得了原核,獲得了后代。用不活動的兔、牛精子注射到卵母細胞質(zhì)內(nèi)也獲得了后代。1993年我國首次獲得了顯微受精仔兔,隨后在小鼠上用附睪精子、球形精、次級精母細胞乃至初級精母細胞注射均已獲得正常發(fā)育后代。2.4胚胎切下和嵌入2.4.1其他的人工引物移植法胚胎分割是80年代發(fā)展起來的一種胚胎生物技術(shù),胚胎分割的方法有多種,用于致密桑椹胚和囊胚的切割方法可歸納為5類:即顯微玻璃針去帶分割法、顯微手術(shù)刀直接分割法、酶消化透明帶顯微玻璃針分割法、酶—機械去帶分割法和徒手刀片分割法。Spemann(1901)首次將蛙第一卵裂后的兩個球分開,人工地產(chǎn)生了雙胞胎。迄今為止,該技術(shù)已在小鼠、家兔、山羊、綿羊和奶牛上二分胚移植的成功報道很多,其移植的成功率(產(chǎn)仔率),小鼠36.7%(n=44),山羊41.7%,奶牛29.1%。奶牛四分割法,將6枚7日齡胚胎,分割成24枚1/4裸胚,分別移植給18頭受體牛,9頭懷孕,受胎妊娠率50%,胚胎移植妊娠率為150%。胚胎分割可使胚胎數(shù)量成倍的增長,特別是對繁殖率低、世代間隔較長的單胎動物尤為重要。也可得到遺傳性能相同的同卵雙(多)生動物且有利于性別控制。2.4.2實驗動物的嵌合體Mintz(1965)第一次得到了存活至成年的正常嵌合小鼠,1970年以來相繼獲得了小鼠、大鼠、兔的嵌合體。嵌合體的制作有兩種方法:一是聚合法,目前已廣泛用于實驗動物;二是注射法,即把細胞注入到囊胚內(nèi)。注射用的細胞可以是內(nèi)細胞團細胞,甚至可以是畸形瘤細胞和ES細胞。2.5流式細胞術(shù)組家畜的性別與其生產(chǎn)性能密切相關(guān),如奶牛生產(chǎn)。通過對胚胎進行有效的性別控制,可大大降低繁殖成本,提高繁殖生產(chǎn)性能。性別控制主要分兩個方面:一是精子分離;二是胚胎性別鑒定。精子分離有多種方法:梯度離心、免疫學方法、流式細胞儀等。胚胎性別鑒定技術(shù)是通過分子生物學的方法識別胚胎性別,有效控制性別比例,從而提高畜禽生產(chǎn)力。一般有細胞遺傳學分析,X-染色體關(guān)聯(lián)酶測定,胚胎發(fā)育速度的差異分析,雄性特性抗原探測,Y-染色體特異性DNA探針等。使用DNA擴增技術(shù),特別是聚合酶鏈式反應(PCR)技術(shù)的發(fā)展,準確率有顯著提高。如用X-染色體關(guān)聯(lián)酶測定8細胞小鼠胚胎,其準確率93.33%。雄性特異抗原法,運用胚胎細胞免疫分析,鑒定小鼠胚胎性別的準確性在81%~86%之間。利用Y染色體特異性DNA引物通過PCR技術(shù)對奶牛早期的胚胎進行胚胎性別鑒定,準確率達94%~100%。胚胎性別控制的成功,極大的增強了胚胎移植的目的性。2.6克隆牛單二年—動物克隆動物克隆即無性繁殖。是指用人工方法,取出核供體(胚胎細胞或體細胞)和核受體(去核的原核胚或成熟的卵母細胞),進行體外重構(gòu),體外培養(yǎng)、胚胎移植,擴繁同基因型動物。繼1987年胚胎細胞核移植成功后,已重復克隆牛達6個世代,已產(chǎn)生第3代克隆牛,并創(chuàng)由一枚胚胎克隆得到190枚克隆胚胎的記錄。1997年第一例胚胎克隆綿羊—多利羊誕生轟動了世界,它的深遠意義是體細胞克隆成功。我國也相繼研制成功克隆羊,并繁殖了后代。動物克隆技術(shù)突破了傳統(tǒng)的有性繁殖理論,該技術(shù)的應用可避免有性繁殖帶來的遺傳核漂變,完整地、原樣地復制后代,對遺傳資源的保護、優(yōu)良個體的擴群具有特珠意義。2.7冷凍研磨法配子與胚胎的冷凍保存即是在超低溫狀態(tài)下貯存精子、卵子或胚胎而不喪失其活力。胚胎保存,按胚胎的不同用途,分為短期保存和長期儲備冷凍保存。短期保存是將暫不使用的胚胎在37℃培養(yǎng)液中保存或在同種或異種動物的輸卵管內(nèi)保存數(shù)天,在0~4℃短期保存,移植給第2~3d受體母畜,且生理狀態(tài)不受影響。冷凍胚胎可長期保存,長途運輸,打破時間和空間的限制,隨時隨地移植,便于地區(qū)和國際間品種資源交流,對于一些瀕稀動物資源保種和優(yōu)良家畜品種的保種,通過保存胚胎,建立基因庫有重要的育種價植。卵母細胞的冷凍保存可為體外受精、核移植、基因轉(zhuǎn)移等生物技術(shù)提供充足的材料,同時也可為動物的資源保存提供可能。哺乳動物胚胎保存時間長短與保存溫度有很大關(guān)系,有人用液氮保存819d的山羊胚胎,移植受體的妊娠率仍有25%。液氮保存15年的綿羊冷凍精液,解凍后輸精的受胎率也可達46%。2.8es細胞的功能胚胎干細胞(ES細胞)和組織干細胞都稱為干細胞,是動物機體所有或某些組織細胞的祖代細胞,具有無限分裂和定向分化成一種或多種特定細胞的潛能。干細胞可由胚胎ICM和胎兒PGCs分隔克隆而來,并可在體外傳代并保留多能分化潛能和正常核型的干細胞系,可形成體內(nèi)各種類型的細胞和組織。體外培養(yǎng)的ES細胞并不完全等同于胚胎的內(nèi)細胞團細胞,體外培養(yǎng)條件的改變都能影響ES細胞的分化潛能,它可以分化成多種組織細胞,但不能分化成所有組織并最終發(fā)育成個體,因此它是“多能”的,而不是“全能”的,目前真正能從早期胚胎的內(nèi)細胞團中分離并建立ES細胞株的脊椎動物僅有小鼠和人。另外,小鼠8.5日齡胚的原始生殖細胞(PGCs)在飼養(yǎng)細胞上,當有干細胞因子(SCF)、白血病抑制因子(LIF)和堿性纖維母細胞生長因子(bFGF)存在時,能夠得到在體外傳代并保持其未分化狀態(tài)的細胞株。這種細胞叫胚胎生殖細胞(EGcells)。EG細胞不僅在形態(tài)上,而且當注入到囊胚中去或在體外誘導分化時具有與ES細胞類似的性質(zhì)。因而在廣義上這兩種細胞都稱為胚胎干細胞。ES細胞目前主要應用于:在ES細胞上進行遺傳操作,通過ES細胞介導制作遺傳工程動物;用于發(fā)育生物學和發(fā)育遺傳學的基礎(chǔ)研究;將ES細胞在體外進行定向分化,用于某些疾病治療,例如糖尿病、帕金森氏病等的細胞替代療法;用ES細胞建立藥物、化學品的體外胚胎毒性測試系統(tǒng)。此外,ES細胞技術(shù)與核移植技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)相結(jié)合能加快畜牧業(yè)上的優(yōu)良品種、生物醫(yī)學研究用的疾病動物模型以及作為生物反應器生產(chǎn)藥品動物的繁殖,擴大瀕危野生動物的種群,因而具有廣闊的應用前景。2.9基因技術(shù)的應用轉(zhuǎn)基因技術(shù)的簡單含義是將動物本身沒有的基因整合到動物的基因組中,定向改造動物的遺傳特征。其具體步驟是將外源基因轉(zhuǎn)移到動物的受精卵中,形成新的融合基因,在體內(nèi)整合和表達,產(chǎn)生新遺傳特性的動物。轉(zhuǎn)基因技術(shù)操作方法最常用、成功率較高的是顯微注射法。除此之外,還有反轉(zhuǎn)錄病毒感染法、胚胎干細胞介導法、染色體片段注射法、電轉(zhuǎn)移法等。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究已成為各國研究的熱點,在育種中已取得令人鼓舞的進展。例如,能改進畜禽的生產(chǎn)性能,美國已成功地研制出帶牛生長激素的轉(zhuǎn)基因豬,有生長快、體大、飼料利用率高的特點,澳大利亞研制的轉(zhuǎn)基因豬,瘦肉率達75%。抗病育種是畜禽選育上的難題,但我國工程院院士殷震已研制出抗豬瘟的轉(zhuǎn)基因豬個體;美國研制出抗口蹄疫的轉(zhuǎn)基因兔、抗白血病的轉(zhuǎn)基因雞。轉(zhuǎn)基因技術(shù)還可通過家畜生產(chǎn)醫(yī)藥制劑,此家畜稱為生物反應器?，F(xiàn)已研制通過豬獲得人血紅蛋白,可作為輔助輸血產(chǎn)品。3畜禽育種在現(xiàn)有技術(shù)下應用面臨的問題作為近代開展的生物技術(shù)研究,其基礎(chǔ)理論還十分薄弱,例如:基因組的重新編程的機制尚不清楚;研究手段、技術(shù)操作、儀器設備不完善、不配套;應用效果受較