曼地亞紅豆杉焦磷酸合成酶基因ggpps的序列克隆與分析

自紫杉醇具有確定抗癌效果以來，特別是當紅杉植物資源極其有限，成為臨床應(yīng)用的限制因素時，人們希望通過研究紫杉醇的生物合成，找到擴大藥物來源的有效方法。隨著植物次生代謝的分子生物學和某些關(guān)鍵酶的分子克隆及基因工程日益成為生命科學新的研究熱點的時候,人們有可能通過某一兩個關(guān)鍵酶的發(fā)現(xiàn)、純化和基因表達,從而使紫杉醇的合成得到突破并取得應(yīng)用效果。牛兒基牛兒基焦磷酸(geranyhlgeranylpyrophosphate,GGPP)為類異戊二烯化合物中的一種,是植物和某些細菌合成類胡蘿卜素和萜類等物質(zhì)的通用前體。紫杉醇的合成首先是通過GGPP的環(huán)化建立紫杉烷類物質(zhì)的骨架結(jié)構(gòu)taxa-4(5),11(12)-diene,然后進一步經(jīng)過氧化修飾和側(cè)鏈添加,最終得到具有活性的紫杉醇。GGPP合成酶催化法呢基焦磷酸(farnesylpyrophosphate,FPP)與異戊烯焦磷酸(isopentenyldiphosphate)縮合反應(yīng)產(chǎn)生GGPP,因而被認為是合成GGPP的關(guān)鍵酶。GGPP合成酶主要的作用是在次生代謝中,調(diào)控那些處于代謝分支點前體的代謝方向。因此,其克隆和表達特征的分析對于闡明紫杉醇和其他次生代謝產(chǎn)物的合成機理非常重要。而且GGPP在真核生物中還參與對包括Rho/Rac,Rap和Rab家族在內(nèi)的多種蛋白質(zhì)的翻譯后修飾,及蛋白質(zhì)的牛兒基牛兒基化,由于這種翻譯后加工的修飾對于蛋白質(zhì)在膜結(jié)構(gòu)(如細胞膜、高爾基體、核膜等)上,或是在胞質(zhì)中的特異性定位有重要意義,因而被認為可能與膜核蛋白或蛋白核蛋白之間的相互作用有關(guān)。本文從植物的GGPPScDNA出發(fā),通過對GenBank的同源掃描,篩選出具有代表性的序列,并通過CLUSTX軟件分析,獲得這些序列的保守性區(qū)域,然后以冷杉中GGPPS的全長cDNA(GenBankAccessionNo.AF081514)為模板,采用primerpremier5軟件分析,設(shè)計出簡并引物,從曼地亞紅豆杉新鮮枝葉中擴增出GGPPS基因片斷,為進一步闡明GGPPS在次生代謝途徑中的作用,尤其為闡明紫杉醇合成途徑中的分子調(diào)控機理,以及構(gòu)建高產(chǎn)紫杉醇的轉(zhuǎn)基因植株奠定了基礎(chǔ)。1材料和方法1.1pi東南角聚合酶para用于擴增GGPPS基因同源序列的紅豆杉品種為曼地亞紅豆杉(TaxusmediacvHicksii),紅豆杉科紅豆杉屬,是一種天然雜交品種,其母本為東北紅豆杉T.cuspidata,父本為歐洲紅豆杉T.baccata。為灌木型,四季常青樹,主根不明顯,側(cè)根發(fā)達,枝葉茂盛,萌發(fā)力強,耐修剪,耐寒,能耐-25℃的低溫。該品系是美國FDA(食品及藥物管理局)批準可以用作提取紫杉醇的紅豆杉之一,4～5年生的曼地亞紅豆杉葉子和樹枝中紫杉醇含量與生長70～80年天然紅豆杉樹皮的紫杉醇含量相當。GGPPS基因克隆所用載體為pGEM-TEasyVector(PromegaInc.),EscherichiacoliDH5αΔlacU169(ф80lacZΔM15)為本實驗室保存。1.2pp合成酶基因序列分析在GenBank中搜尋植物的GGPPS基因,得到一條來源于加拿大紅豆杉(Taxuscanadensis)的GGPPS基因(accessionNo.AF081514)和四條來源于冷杉(Abiesgrandis)的GGPPS基因(accessionNo.AF425235,AF513111,AF513112,AF513113)。使用CLUSTX(1.81)軟件分析這些來源的GGPP合成酶DNA序列,發(fā)現(xiàn)下面四個區(qū)域保守性很高(圖1),Ⅰ區(qū)620-640bp(序列:TGAATTTGA(T/C)TTCAA(T/G/C)(A/G)AGTA);Ⅱ區(qū)723-745(序列:ATGAGGTATTC(T/A)CTTCT(G/A)GCAGG);Ⅲ區(qū)1320-1348(序列:TGGG(C/T/A)AA(G/A)ACTGCAGGAAAGGATTTG);Ⅳ區(qū)1470-1490(TGTT(G/C)GGTCTTGCAGATTAC)。以AF081514為模板,采用primerpremier5軟件分析,運行結(jié)果表明Ⅱ區(qū)和Ⅳ區(qū)比較適合設(shè)計引物,依據(jù)上述信息設(shè)計PCR簡并擴增引物senseprimer:5′-ATGAGGTATTCWCTTCTRGC;antisenseprimer:5′-GTAATCTGCAAGACCSAACA。1.3凍融法提取離心管參照一步法異硫氰酸胍法進行改良,提取曼地亞植株中的總RNA。稱取新鮮的植物組織1.5g,加入0.15g石英砂,0.15g聚乙烯毗咯烷酮PVP,然后加入液氮,迅速研磨成均勻的粉末,轉(zhuǎn)入預(yù)冷的50ml離心管中。加入15ml變性液,-70℃凍融兩次,56℃溫育1～3min。將離心管放置于冰上,加入1.5ml2mol/L的NaAc(pH4.0),冰浴放置10min。4℃12000r/min離心10min,轉(zhuǎn)移上清至另一干凈的離心管中。加入5ml5mol/L的KAc,冰浴放置20min。4℃12000r/min離心10min,轉(zhuǎn)移上清至另一干凈的離心管中。加入15ml水飽和酚,3ml氯仿/異戊醇,振蕩使之混合均勻,冰浴放置10min。4℃15000r/min離心30min,轉(zhuǎn)移上清,加入等體積異丙醇,-20℃放置1h。4℃13000r/min離心25min,棄上清,用70%乙醇洗滌沉淀2次。晾干,用適量的DEPC處理水定容,經(jīng)紫外檢測和甲醛變性凝膠電泳檢測后分裝,-70℃保存。mRNA純化采用磁珠分離法(Promega公司)。1.4inhiptraceRT-PCR采用TakaRa公司生產(chǎn)的RT-PCR試劑盒,cDNA鏈合成反應(yīng)總體積為20μl,其中mRNA10ng,25mmol/LMgCl24μl,10×RNAPCRbuffer2μl,dNTPMixture(10mmol/Leach)2μl,RNAseInhibitor0.5μl,ReverseTranscriptase1μl,OligadT-Adaptorprimer1μl。反應(yīng)程序為45℃30min,99℃5min終止反應(yīng)。cDNA合成結(jié)束后,在體系中繼續(xù)添加25mmol/LMgCl26μl,10×RNAPCRbuffer8μl,TaKaRaTaq聚合酶0.5μl,25mmol/L上下游引物各1μl,總體積100μl,PCR擴增程序為95℃預(yù)變性5min,接著進行35個循環(huán)(94℃1min,45℃1min,72℃1min)的擴增,最后72℃溫育10min。1.5細胞度細胞的制備PCR產(chǎn)物經(jīng)膠純化回收Kit(Omega公司)純化,溶解于20μl10mmol/LTE(pH8.0)中,取7μlpGEMT-EasyVector(Promega)在4℃連接16h以上,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細胞,感受態(tài)細胞制備參照文獻。取200μl轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含IPTG和X-gal的Amp(60mg/L)LB平板,37℃培養(yǎng)過夜,白斑菌落即為陽性克隆。1.6陽性質(zhì)粒的檢測隨機挑選5個左右白斑菌落,接種于含Amp(60mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中,使用質(zhì)粒提取kit(Omega公司),提取質(zhì)粒,與空載體環(huán)化質(zhì)粒(藍斑菌落中含有的質(zhì)粒)進行0.7%瓊脂糖電泳比較,挑選其中分子量增大的質(zhì)粒,采用上文中的GGPPS簡并引物進行擴增,擴增結(jié)果與RT-PCR相同的質(zhì)粒為驗證的陽性質(zhì)粒,提交上海申友公司進行序列測定。1.7同源分析比較將克隆得到的GGPPS片斷核苷酸序列在GenBank中進行同源搜索,然后根據(jù)推斷得到的蛋白質(zhì)序列,運用blastP軟件進行同源分析比較。用PROSITE軟件在線分析該蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)域。用Clustalx(1.81)將其氨基酸序列與其他不同物種來源的GGPPS進行多序列同源比較,找出該序列中存在的保守結(jié)構(gòu)域。同時采用Phylip(Version3.6alpha)軟件包對選取的14種不同物種來源的GGPPS蛋白進行分析,作出進化上相互關(guān)系的預(yù)測。2結(jié)果與分析2.1總rna的完整性曼地亞紅豆杉總RNA的甲醛變性凝膠的電泳結(jié)果如圖2,從圖中可以清晰地看出3條rRNA條帶(5sRNA、18sRNA、28sRNA),其中28sRNA條帶的亮度大約為18sRNA的2倍,說明了總RNA良好的完整性。進一步通過紫外分光光度法測得吸光值A(chǔ)230,A260,A280分別為0.255,0.521,0.281,A260/A230為2.04,A260/A280為1.84。A260/A280比值介于1.7到2.0之間,A260/A230比值大于2.0,為典型的RNA吸收值,說明酚類、蛋白質(zhì)和無機鹽等雜質(zhì)已排除。異硫氰酸胍法經(jīng)過改良,可以從曼地亞紅豆杉枝葉中提取出完整和高純度的RNA,總RNA得率達到9.8mgRNA/g新鮮枝葉。2.2重組質(zhì)粒的制備通過RT-PCR,從曼地亞紅豆杉mRNA中成功地克隆到了一條片斷,大小600bp左右,符合引物設(shè)計推斷的片斷大小。PCR片斷純化后,TA克隆到pGEMT-easy載體上,藍白斑篩選獲得陽性轉(zhuǎn)化子,進一步提取質(zhì)粒,驗證轉(zhuǎn)化子大小,然后將分子量明顯增大的重組質(zhì)粒作為模板,用原引物進行PCR擴增,驗證重組質(zhì)粒插入片斷的大小。結(jié)果如圖3,表明重組質(zhì)粒中插入的片斷為RT-PCR克隆得到的片斷。2.3主要測定接口GGPPS基因序列(圖4)提交到GenBank(Accessionnumber:AY445650),通過BlastP在線比較,結(jié)果顯示曼地亞紅豆杉推斷的GGPPS與加拿大紅豆杉(Taxuscanadensis)(AAD16018.1)、擬南芥(Abiesgrandis)(AAL17614.2)、(AAN01133.1)、Abiesgrandis(AAN01134.1)、Abiesgrandis(AAN01135.1)、長春花(Catharanthusroseus)(CAA63486.1)、Sinapisalba(CAA67730.1)以及Heveabrasiliensis(BAB60678.1)的一致性分別達到98%,86%,83%,76%,76%,78%,77%和77%。用PROSITE軟件在線分析(/prosite/),在推導的GGPPS氨基酸序列中發(fā)現(xiàn)了一個符合多聚異戊二烯合成酶(包括GGPPS、FPPS、HPPS等結(jié)構(gòu)相似的酶)基因序列特征的天門冬氨酸富集區(qū),即46LIhDDlpcmDnddfRRG62,符合如下序列特征:(L/I/V/M)(2)xDDx(2,4)Dx(4)rr(G/H)(圖5)。2.4不同種類的pps蛋白進化分析從GenBank上選取不同來源的GGPPS蛋白序列,包括動物、植物、細菌、真菌、放線菌、古細菌,連同本研究中推斷的曼地亞紅豆杉GGPPS蛋白序列一起進行進化上的分析。通過PhylipVersion3.6(alpha)自展法(boostrap)運算1000次,結(jié)果(圖6)表明,GGPPS蛋白質(zhì)具有明顯的種族特異性,動物、植物、細菌、真菌和古細菌來源的GGPPS蛋白序列在進化上屬于不同的分支。但放線菌來源的GGPPS與植物親緣性高。細菌,尤其是古細菌來源的GGPPS與植物具有較近的親緣關(guān)系,真菌與動物較近。推斷的曼地亞紅豆杉GGPPS屬于植物支,靠近古細菌的分支。3對生物活性的影響植物基因的克隆首先是高質(zhì)量的RNA的提取,尤其是直接從植物組織中提取RNA,由于植株組織分化的緣故,植株中含有大量的纖維素和木質(zhì)素,細胞壁具有很強的抵御能力,而且,由于紫杉類植物能夠產(chǎn)生大量的次生代謝產(chǎn)物,其中包含有許多酚類和醌類物質(zhì),這些物質(zhì)的存在能夠和RNA穩(wěn)定地結(jié)合,影響了RNA的純度,植物組織中大量的多糖類物質(zhì)能夠有效的吸附RNA,造成RNA得率的下降。因此,在提取植物組織中RNA的同時,需要對已有的方法進行改進,本研究主要在以下4個方面進行了修正:(1)破碎植物組織,采用機械研磨的方法,添加適量的石英砂增加研磨效果,另外加入變性劑后,結(jié)合反復(fù)凍融,確保細胞破碎;(2)多次離心去雜,由于植物組織中含有許多纖維素類和木質(zhì)素類物質(zhì),當細胞破碎后,這些物質(zhì)往往干擾進一步的純化工作,如去蛋白和去多糖等,這時需要多次離心,將產(chǎn)生的細胞碎片及時清理;(3)防止酚類物質(zhì)氧化,添加聚乙烯毗咯烷酮(PVP)可以有效的起到抗氧化的作用,而且固體的PVP同樣具有增加研磨效果和吸附醌類物質(zhì)的作用;(4)去多糖,經(jīng)過多次試驗,發(fā)現(xiàn)醋酸鉀去多糖的效果非常明顯,而且操作簡便。本文第一次報道了從快生型樹種曼地亞紅豆杉中克隆GGPPS基因,推斷的蛋白質(zhì)序列作同源比較,結(jié)果顯示了它同不同物種來源的GGPPS都有同源性,尤其同加拿大紅豆杉的GGPPS的同源性高達98%。前人研究表明GGPPS蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上屬于多聚異戊二烯合成酶家族,我們通過PROSITE在線比較,發(fā)現(xiàn)該序列中存在一個保守的富含天門冬氨酸的基因序列DDXX(XX)D,其特征序列被歸納為:(L/I/V/M)(2)xDDx(2,4)Dx(4)rr(G/H),這個區(qū)域被認為是與IPP和烯丙基底物的結(jié)合有關(guān),特別是蛋白晶體結(jié)構(gòu)分析表明這個區(qū)域位于酶的催化活性位點,參與構(gòu)成與底物相結(jié)合的重要結(jié)構(gòu)。在曼地亞紅豆杉GGPPS蛋白中,符合上述特征的序列為:46LIhDDlpcmDnddfRRG62。據(jù)此,我們推斷該cDNA編碼的蛋白質(zhì)就是曼地亞紅豆杉的GGPPS。通過不同物種來源的GGPPS進化樹分析,表明曼地亞紅豆杉GGPPS位于植物家族分子,此外,與古細菌GGPPS也有較近的親緣關(guān)系。植物次生代謝產(chǎn)物是一個巨大的寶庫,包含著許多人類急需的醫(yī)藥、工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等原料,紫杉醇是其中最具代表性的一個。GGPP是植物萜類次生代謝的公共前體,因此,研究GGPPS對于闡明紅豆杉植株產(chǎn)生紫杉醇的機理具有重要意義。Gregroy等研究了GGPPS活性和紫杉醇合成的關(guān)系,研究發(fā)現(xiàn)