基因敲除技術(shù)的研究進(jìn)展

基因（gene）是核酸分子信息的遺傳單位。它是一個以多酚鏈或鈉序列信息為儲存所需的全部磷酸序列信息的序列?；蚯贸?Geneknockout)是指借助分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和動物胚胎學(xué)的方法,通過胚胎干細(xì)胞這一特殊的中間環(huán)節(jié)將小鼠的正常功能基因的編碼區(qū)破壞,使特定基因失活,以研究該基因的功能;或者通過外源基因來替換宿主基因組中相應(yīng)部分,以便測定它們是否具有相同的功能,或?qū)⒄；蛞胨拗骰蚪M中置換突變基因以達(dá)到靶向基因治療的目的?；蚯贸墙沂净蚬δ茏钪苯拥氖侄沃??；蚯贸亲?0世紀(jì)80年代末以來發(fā)展起來的一種新型分子生物學(xué)技術(shù),此后經(jīng)歷了將近20年的推廣和應(yīng)用,直到2007年10月8日,美國科學(xué)家CAPECCHI和OLIVERSMITHIES、英國科學(xué)家EVANS因?yàn)樵诶门咛ジ杉?xì)胞對小鼠基因進(jìn)行定向修飾原理方面的系列發(fā)現(xiàn)分享了2007年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎,基因打靶技術(shù)才獲得諾貝爾獎評審委員會的關(guān)注和肯定。通常意義上的基因敲除主要是應(yīng)用DNA同源重組原理,用設(shè)計(jì)的同源片段替代靶基因片段(即基因打靶),從而達(dá)到基因敲除的目的。隨著基因敲除技術(shù)的發(fā)展,除了基因打靶技術(shù)外,新的原理和技術(shù)也逐漸被應(yīng)用,比較成功的有RNA干擾技術(shù),同樣也可以達(dá)到基因敲除的目的。本文就基因打靶技術(shù)和RNA干擾技術(shù)兩個方面綜述了基因敲除的方法及其應(yīng)用。1基因打靶研究基因打靶技術(shù)(genetargeting)是指基因工程中利用活細(xì)胞染色體DNA可與外源DNA序列發(fā)生重組的性質(zhì),來進(jìn)行定點(diǎn)修飾改造染色體上某一目的基因的技術(shù),又稱為同源重組技術(shù)。胚胎干細(xì)胞(Embryonicstemcells,ESC)是早期胚胎細(xì)胞經(jīng)體外抑制分化培養(yǎng)建立的多能性細(xì)胞系,體外培養(yǎng)時保持了未分化狀態(tài),可以傳代增殖,在發(fā)育上類似于動物早期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞,具有與早期胚胎細(xì)胞相似的分化潛能和正常整倍體核型兩大特點(diǎn),是研究哺乳動物個體發(fā)育、胚胎分化以及性狀遺傳機(jī)制的理想模型。ESC分離和體外培養(yǎng)的成功及哺乳動物細(xì)胞中同源重組的存在奠定了基因敲除的技術(shù)基礎(chǔ)和理論基礎(chǔ),是進(jìn)行基因敲除研究不可替代的材料?；虼虬械闹饕襟E包括:(1)重組基因載體的構(gòu)建:把目的基因和細(xì)胞內(nèi)靶基因特異片段同源的DNA分子都重組到帶有標(biāo)記基因的載體上,此重組載體即為基因打靶載體,載體要包括外源目的基因、同源基因片段及標(biāo)記基因;(2)導(dǎo)入受體細(xì)胞:用電穿孔、顯微注射等方法把重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞核內(nèi);(3)篩選:用選擇性培養(yǎng)基篩選已擊中的細(xì)胞;(4)檢測:觀察被擊中細(xì)胞的生物學(xué)特征,將已擊中的胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)入胚胎使其生長,對轉(zhuǎn)基因動物進(jìn)行形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)檢測?；虼虬屑夹g(shù)進(jìn)行基因敲除目前使用相當(dāng)廣泛,根據(jù)其作用方式不同可分為:條件性基因敲除法、誘導(dǎo)性基因敲除法、基因捕獲技術(shù)基因敲除法等,這些方法都是建立在DNA基因同源重組技術(shù)原理基礎(chǔ)之上的,現(xiàn)分別展開敘述。1.1組織特異性基因敲除條件性基因敲除法是指將某個基因的修飾限制于小鼠某些特定類型的細(xì)胞或發(fā)育的某一特定階段的一種特殊的基因敲除方法。它實(shí)際上是在常規(guī)的基因敲除的基礎(chǔ)上,利用重組酶Cre介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性重組技術(shù),在對小鼠基因修飾的時空范圍上設(shè)置一個可調(diào)控的“按鈕”,從而使對小鼠基因組的修飾的范圍和時間處于一種可控狀態(tài)。自從1994年GU等的第一例應(yīng)用Cre-LoxP系統(tǒng)研制的組織特異性基因敲除小鼠問世以來,條件基因敲除技術(shù)迅速取代了傳統(tǒng)的完全基因敲除成為主流。條件基因敲除技術(shù)利用Cre-LoxP和FLP-FRT位點(diǎn)特異性重組酶系統(tǒng)使得時空特異性基因敲除變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)。在特定階段特定組織或細(xì)胞中表達(dá)Cre或FLP重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠通過與在基因組中引入LoxP或FRT序列的小鼠交配,可導(dǎo)致子代鼠中特定組織或細(xì)胞中的靶基因被刪除。基于Cre-LoxP系統(tǒng)的第二代小鼠模型可以克服重要功能基因敲除所導(dǎo)致的早期致死表型,模擬人類疾病相關(guān)的體細(xì)胞突變,并對突變進(jìn)行時空上的調(diào)控,提供了激動人心的新機(jī)會研究已知或者未知基因的在疾病的起始、發(fā)生和治療過程中的作用及其機(jī)制。近幾年來,利用細(xì)菌人工染色體(bacterialartificialchromosomes,BACs)構(gòu)建的Cre轉(zhuǎn)基因載體通過受精卵注射得到了許多與內(nèi)源性基因表達(dá)譜相似的Cre轉(zhuǎn)基因小鼠。2007年Xu等將兩種不同細(xì)胞特異性的Cre基因部分缺失的轉(zhuǎn)基因小鼠交配得到了恢復(fù)Cre重組酶活性的子代小鼠,從而對Cre在特定細(xì)胞中的表達(dá)達(dá)到了“雙重”限制。在構(gòu)建轉(zhuǎn)基因載體時,如果同時將Cre基因置于配體或藥物可誘導(dǎo)的啟動子控制下,就可同時實(shí)現(xiàn)在時間和空間水平上對Cre表達(dá)的精確調(diào)控。近幾年來研究者利用各種誘導(dǎo)系統(tǒng)結(jié)合細(xì)胞特異性啟動子構(gòu)建了多種在時空水平上可調(diào)控的Cre轉(zhuǎn)基因小鼠,為揭示靶基因在特定階段特定細(xì)胞中的功能提供了強(qiáng)為有力的工具。除了利用Cre轉(zhuǎn)基因小鼠,還可通過感染具有自我剪切功能的表達(dá)重組酶的逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒以及直接注射可透膜的Cre重組酶蛋白而實(shí)現(xiàn)重組,同時可以減少Cre重組酶的細(xì)胞毒性。近年來,研究者利用組織特異性基因敲除技術(shù)揭示了某些基因在組織器官發(fā)育、生理過程以及疾病發(fā)生中的重要功能。國內(nèi)一些研究者也自主研制成功了1O余種組織特異性Cre重組酶轉(zhuǎn)基因小鼠以及系列組織特異性條件基因敲除小鼠,通過對突變小鼠的表型分析,系統(tǒng)地揭示了Smad4基因在組織器官發(fā)育和穩(wěn)態(tài)維持以及相關(guān)疾病發(fā)生過程中的作用和機(jī)制。1.2lohp基因的誘導(dǎo)表達(dá)誘導(dǎo)性基因敲除法也是以Cre/Loxp系統(tǒng)為基礎(chǔ),利用控制Cre表達(dá)的啟動子的活性或所表達(dá)的Cre酶活性具有可誘導(dǎo)的特點(diǎn),通過對誘導(dǎo)劑給予時間的控制或利用Cre基因定位表達(dá)系統(tǒng)中載體的宿主細(xì)胞特異性和將該表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到動物體內(nèi)的過程在時間上的可控性,從而在LoxP動物的一定發(fā)育階段和一定組織細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)對特定基因進(jìn)行遺傳修飾之目的的基因打靶技術(shù)。誘導(dǎo)性基因敲除法主要有Cre/LoxP系統(tǒng)和誘導(dǎo)系統(tǒng)兩個部分組成。Cre/LoxP系統(tǒng)由源于大腸埃希菌噬菌體Pl的位點(diǎn)特異性重組酶Cre和其特定的識別和作用位點(diǎn)LoxP組成。其中Cre由343個氨基酸組成、分子量約38kD。其特定的作用位點(diǎn)LoxP為34bp的DNA序列:由8bp非對稱的核心序列和兩端各l3bp的反向重復(fù)序列構(gòu)成:5′-ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT-3′。Cre的特定作用位點(diǎn)LoxP的位置也極富變化,可以位于相同或不同的染色體或DNA分子上,LoxP之間既可同向排列,也可反向存在。重組反應(yīng)的形式究竟是缺失、插入、重復(fù)、倒位或易位中的哪一種,由兩個LoxP在DNA分子上的相對位置來決定。在同一DNA分子上,Cre介導(dǎo)兩個同向排列LoxP之間的DNA的缺失反應(yīng)。如果兩個LoxP位點(diǎn)呈反向排列,Cre則誘發(fā)倒位反應(yīng)。當(dāng)LoxP存在于不同的DNA分子上時,Cre則介導(dǎo)缺失、重復(fù)、插入及易位等反應(yīng)。LoxP轉(zhuǎn)基因動物是用常規(guī)基因打靶技術(shù)構(gòu)建的,基因組中待修飾區(qū)域的兩端各攜帶有1個LoxP位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因動物。構(gòu)建該轉(zhuǎn)基因動物的目的是為Cre介導(dǎo)的重組反應(yīng)提供作用底物。誘導(dǎo)系統(tǒng)是指其所攜帶的Cre基因的表達(dá),或所表達(dá)的Cre的酶活性具有可誘導(dǎo)特性的轉(zhuǎn)基因動物,或Cre基固可定位表達(dá)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)等。對Cre基因的表達(dá)具有可誘導(dǎo)特眭的轉(zhuǎn)基因動物來說,其控制Cre表達(dá)的啟動子的活性具有可誘導(dǎo)性,即Cre基因平時并不表達(dá),只有當(dāng)誘導(dǎo)劑存在時,控制Cre基因表達(dá)的啟動子才有轉(zhuǎn)錄活性,Cre才會表達(dá)。在Cre的酶活性具有可誘導(dǎo)特性的轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi),其Cre基因事先已經(jīng)過了改造,雖然該酶可組成性地表達(dá),但它卻沒有介導(dǎo)重組反應(yīng)的酶活性,只有當(dāng)誘導(dǎo)劑存在時,Cre的酶活性才能被激活。人們可以通過對誘導(dǎo)劑給予時間的預(yù)先設(shè)計(jì)的方式來對動物基因突變的時空特異性進(jìn)行人為控制,以避免出現(xiàn)死胎或動物出生后不久即死亡的現(xiàn)象。常見的幾種誘導(dǎo)性打靶類型如下:四環(huán)素誘導(dǎo)型;干擾素誘導(dǎo)型;激素誘導(dǎo)型;腺病毒介導(dǎo)型。誘導(dǎo)性基因敲除方法的優(yōu)點(diǎn)有:(1)誘導(dǎo)基因突變的時間可人為控制;(2)可避免因基因突變而致死胎的問題;(3)在2個LoxP位點(diǎn)之間的重組率較高;(4)如用病毒或配體/DNA復(fù)合物等基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)來介導(dǎo)Cre的表達(dá),則可省去建立攜帶Cre的轉(zhuǎn)基因動物的過程;(5)如果在Cre-ERT和Ad-Cre表達(dá)系統(tǒng)中采用組織細(xì)胞特異的啟動子來控制Cre的表達(dá),其誘導(dǎo)的基因重組的組織細(xì)胞特異性還可進(jìn)一步提高。1.3基因捕獲及其功能基因捕獲技術(shù)敲除基因的方法酷似以報告基因?yàn)檎T餌來捕獲基因。其基本過程是將一含報告基因的DNA載體隨機(jī)插入基因組,從而產(chǎn)生內(nèi)源基因失活突變,并通過報告基因的表達(dá)激活提示插入突變的存在,及突變內(nèi)源基因表達(dá)特點(diǎn)。通過篩選得到的插入突變的ES細(xì)胞克隆經(jīng)囊胚注射轉(zhuǎn)化為基因突變動物模型,進(jìn)而分析表型來研究突變基因功能。每一種ES細(xì)胞克隆中含有不同的突變基因,在短期內(nèi)可建立大量含不同基因突變的ES細(xì)胞克隆庫。突變基因的序列可通過基于PCR的一些方法鑒定,同時還可能發(fā)現(xiàn)一些在體內(nèi)表達(dá)或不表達(dá)的新基因。基因捕獲技術(shù)是大規(guī)模隨機(jī)基因敲除技術(shù)的方法之一。研究者利用位點(diǎn)特異性重組酶系統(tǒng)對傳統(tǒng)的基因誘捕策略進(jìn)行了改進(jìn)使條件性的基因誘捕成為可能。在小鼠ES細(xì)胞中進(jìn)行ENU誘變可以在ES細(xì)胞中直接進(jìn)行突變基因的篩選,使ENU誘變技術(shù)同樣適合于基因驅(qū)動的研究。而通過在cDNA樣品庫中檢測特定基因的剪接突變,使在ES細(xì)胞水平上進(jìn)行基因突變的篩選更加方便、有效。近幾年來,研究者成功地將不同的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)應(yīng)用到小鼠中,為大規(guī)模地研制基因突變小鼠以及構(gòu)建新的疾病模型提供了嶄新的途徑。在轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)基礎(chǔ)上,同時結(jié)合不同的誘導(dǎo)系統(tǒng)可以對基因突變實(shí)現(xiàn)時空水平上的調(diào)控。最近,利用位點(diǎn)特異性重組酶系統(tǒng)和轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的一種新的基因誘捕策略為在小鼠基因組范圍內(nèi)大規(guī)模地進(jìn)行基因突變提供了一種更方便、快捷的方法。根據(jù)報告基因在載體中的位置及報告基因激活表達(dá)的方式,基因捕獲分為3種類型:(1)通過增強(qiáng)子捕獲載體(enhancer-trapping)整合到順式增強(qiáng)子元件附近調(diào)控報告基因的表達(dá);(2)通過啟動子捕獲(promoter-trapping)載體體插入到內(nèi)源基因編碼區(qū)序列中產(chǎn)生融合轉(zhuǎn)錄本并表達(dá)報告基因;(3)基因捕獲載體中在無啟動子序列的報告基因上游和下游分別含有剪接受體(sp1iceacceptor,SA)和多聚腺苷酸加尾序列(polyA),當(dāng)含有順式作用的啟動子和增強(qiáng)子元件被捕獲基因轉(zhuǎn)錄激活時,載體中SA與內(nèi)源基因剪接供體(splicedonor,SD)作用產(chǎn)生上游內(nèi)源基因編碼序列與報告基因融合轉(zhuǎn)錄本,使內(nèi)源基因發(fā)生突變,同時報告基因的表達(dá)提示內(nèi)源基因的表達(dá)特點(diǎn)?；虿东@載體在基因組中也有“hot”和“cold”插入位點(diǎn)。但是計(jì)算機(jī)模擬顯示,按照單個克隆被捕獲的百分比,如果以多種類型的載體進(jìn)行足夠多次的突變實(shí)驗(yàn)所獲得的突變克隆就可以覆蓋整個ES細(xì)胞基因組中全部基因位點(diǎn)。因此,新型捕獲策略和載體不斷被設(shè)計(jì)應(yīng)用?；虿东@插入能提供三類數(shù)據(jù)作為突變篩選的依據(jù)——基因功能、表達(dá)模式及序列信息。而檢測突變策略的最重要指標(biāo)是誘變率。所有插入型誘變因素,包括以基因打靶方式導(dǎo)入基因組的載體,都有一定比率的插入而不產(chǎn)生突變或產(chǎn)生減效等位基因型突變(hypomorphicmutations)。越來越多成功事例的出現(xiàn)證明基因捕獲是一種富有成效的研究方法,能為闡釋哺乳動物基因組提供相當(dāng)多的功能學(xué)數(shù)據(jù)。如Ff1基因捕獲識別鑒定的新基因可直接從表型角度分析其功能,常可以確定其所在的分子通路;利用基因捕獲的方法還可以捕獲確定某一分子通路成員;最后,基因捕獲對于那些不能通過同源重組產(chǎn)生突變的模式生物研究有深遠(yuǎn)的意義。1.4其他方面的基因敲除基因打靶技術(shù)敲除基因的方法除了上述的三種方法外,還有其他很多也基于DNA同源重組技術(shù)原理的基因敲除方法,如基因插入突變技術(shù)、基因缺失技術(shù)、自殺質(zhì)粒構(gòu)建技術(shù)等,也被一些研究者們所重視。2突破基因敲除的路徑RNA干擾技術(shù)(RNAinterference,RNAi)是指通過利用短片段的雙鏈RNA促使特定基因的mRNA降解來高效、特異的阻斷特定基因的表達(dá),誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因沉默的表型。該系統(tǒng)能被siRNA的直接途徑或非病毒載體和病毒載體shRNA的表達(dá)在體內(nèi)外有效誘發(fā)。到目前為止,RNAi技術(shù)作為基因沉默的一個工具,被研究人員廣泛應(yīng)用到包括功能基因組學(xué)、藥物靶點(diǎn)篩選、細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路分析、疾病治療等研究領(lǐng)域。與傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)相比,RNAi技術(shù)具有投入少,周期短,操作簡單等優(yōu)勢。RNAi阻斷基因表達(dá)的機(jī)理:雙鏈RNA進(jìn)入細(xì)胞后,一方面能夠在Dicer酶的作用下被裂解成小分子干擾RNA(smallinterferingRNA,siRNA),而另一方面雙鏈RNA還能在RdRP(以RNA為模板指導(dǎo)RNA合成的聚合酶,RNA-directedRNApotyraerase,RdRP)的作用下自身擴(kuò)增后,再被Dicer酶裂解成siRNA。siRNA的雙鏈解開變成單鏈,并與某些蛋白形成復(fù)合物,Argonaute2是目前唯一已知的參與復(fù)合物形成的蛋白。此復(fù)合物同與siRNA互補(bǔ)的mRNA結(jié)合,一方面使mRNA被RNA酶裂解,另一方面以siRNA作為引物,以mRNA為模板,在RdRP作用下合成出mRNA的互補(bǔ)鏈。結(jié)果mRNA也變成了雙鏈RNA,它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。這些新生成的siRNA也具有誘發(fā)RNAi的作用,通過這個聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),細(xì)胞內(nèi)的siRNA大大增加,顯著增加了對基因表達(dá)的抑制。從21~23個核苷酸的siRNA到幾百個核苷酸的雙鏈RNA都能誘發(fā)RNAi,但長的雙鏈RNA阻斷基因表達(dá)的效果明顯強(qiáng)于短的雙鏈RNA。近些年來,RNAi技術(shù)成為基因敲除的熱點(diǎn),應(yīng)用相當(dāng)廣泛。例如,將針對M-BCR/ABL融合基因設(shè)計(jì)合成的dsRNA轉(zhuǎn)染慢性髓細(xì)胞白血病K562細(xì)胞系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)mRNA的轉(zhuǎn)錄和BCR/ABI癌蛋白的表達(dá)減少,基因被敲除,引起強(qiáng)烈的細(xì)胞凋亡反應(yīng);利用RNAi技術(shù)抑制白血病細(xì)胞多藥耐藥基因表達(dá),結(jié)果顯示不僅腫瘤細(xì)胞耐藥被逆轉(zhuǎn),而且還發(fā)現(xiàn)前列腺素E的合成和釋放減少,提示白血病細(xì)胞多藥耐藥基因不僅具有降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度抵抗藥物殺傷作用,而且還可能參與了前列腺素E等體內(nèi)化學(xué)遞質(zhì)的代謝,在自血病細(xì)胞的其他生物學(xué)行為中發(fā)揮作用;針對形成膠質(zhì)瘤的關(guān)鍵因子表皮生長因子受體獨(dú)特的外顯子1及S交接序列設(shè)計(jì)的siRNA可有效地抑制人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤系的表皮生長因子表達(dá),并且發(fā)現(xiàn)siRNA介導(dǎo)的表皮生長因子受體缺失可明顯引起膠質(zhì)瘤AKT磷酸化水平下降及P13K的抑制,細(xì)胞凋亡增加,細(xì)胞周期G2-M期阻滯。陳功星等為了研究特異siRNA作用于大腸癌細(xì)胞株SW480中PLK1(Polo-1ikekinase1)基因表達(dá)的mRNA對該細(xì)胞分裂生長的影響,設(shè)計(jì)了對應(yīng)于PLK1基因表達(dá)mRNA不同位點(diǎn)的10種特異siRNA,經(jīng)化學(xué)合成后,用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞,實(shí)時定量PCR檢測PLK1基因的表達(dá),觀察不同的siRNA作用強(qiáng)度,并計(jì)數(shù)細(xì)胞了解相應(yīng)細(xì)胞的生長情況,Western-blot觀察PLK1表達(dá)蛋白的變化和流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析細(xì)胞周期改變。發(fā)現(xiàn)10種siRNA均可敲除PLK1基因表達(dá)的20%以上,其中P1、P4和P93組敲除mRNA達(dá)80%以上,這3種siRNA及其混合物對PLK1基因mRNA的作用具有相應(yīng)濃度效應(yīng),在25nmol/L時達(dá)到最佳作用效果,而且相同濃度的混合物作用效果更好(超過95%),PLK1表達(dá)蛋白質(zhì)明顯降低,細(xì)胞周期在G2期受到阻礙。72h后的各種siRNA濃度下細(xì)胞生長變化與PLK1基因的mRNA水平變化相一致。結(jié)果表明化學(xué)合成的特異siRNA對SW480細(xì)胞中PLK1基因表達(dá)具有消除作用,混合物作用更強(qiáng),在細(xì)胞水平上抑制了SW480細(xì)胞的分裂生長。范鈺等根據(jù)STAT3基因特點(diǎn),設(shè)計(jì)合成STAT3siRNA,并轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116后,采用RT-PCR檢測STAT3mRNA,采用軟瓊脂集落培養(yǎng)試驗(yàn)檢測癌細(xì)胞錨著不依賴性增殖,采用Boyden小室模型試驗(yàn)檢測癌細(xì)胞的侵襲能力,結(jié)果表明STAT3siRNA可有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞集落生長和侵襲能力。運(yùn)用RNAi技術(shù)來誘導(dǎo)基因表達(dá)的沉默是一種制備基因功能缺失表型的有效的新方法。將RNAi技術(shù)用于基因敲除有其很大的優(yōu)點(diǎn):(1)比同源重組法更加簡便,周期大大縮短;(2)能夠快速而簡單地制備某個功能缺失表型;(3)RNAi技術(shù)也已經(jīng)可以通過shRNA表達(dá)盒子能夠在細(xì)胞中像在動物模型中一樣產(chǎn)生有效的、穩(wěn)定的和可調(diào)節(jié)的基因沉默作用;(4)對于哺乳動物,如對于一些敲除后小鼠在胚胎時就會死亡的基因,可以在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中利用RNAi技術(shù)研究它的功能;(5)由于RNAi能高效特異的阻斷基因的表達(dá),它成為研究信號傳導(dǎo)通路的良好工具;(6)RNAi還被用來研究在發(fā)育過程中起作用的基因,如可用RNAi來阻斷某些基因的表達(dá),來研究他們是否在胚胎干細(xì)胞的增殖和分