顆粒污泥中微生物種群多樣性及空間分布研究

0厭氧顆粒污泥中微生物的研究進(jìn)展厭氧消化過程是一種由不同性質(zhì)和功能的厭氧微生物組成的連續(xù)生物化學(xué)過程。厭氧微生物，尤其是呼吸類細(xì)菌，對(duì)溫度和ph等環(huán)境因素有很強(qiáng)的敏感，這使得厭氧反應(yīng)的操作和應(yīng)用受到一定的限制。因此,對(duì)厭氧顆粒污泥中的微生物種群進(jìn)行研究具有深遠(yuǎn)的意義。長(zhǎng)期以來(lái),對(duì)厭氧顆粒污泥中微生物相的研究主要采用電子顯微鏡觀察、限制性培養(yǎng)基培養(yǎng)以及產(chǎn)甲烷活性測(cè)定等傳統(tǒng)方法,盡管這些方法曾經(jīng)有力地推動(dòng)了厭氧微生物學(xué)的發(fā)展,但它們存在自身固有的一些缺陷。分子生物技術(shù)可以在一定程度上克服這些缺陷,因此近年來(lái)被認(rèn)為是一種可以對(duì)微生物種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究的新的具有更多優(yōu)勢(shì)的方法。這種方法以核酸分子(DNA或RNA)為研究對(duì)象,可在無(wú)需純培養(yǎng)和不擾動(dòng)環(huán)境樣品的情況下,對(duì)樣品中的微生物直接進(jìn)行研究。分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于自然界和反應(yīng)器污泥樣品中微生物種群結(jié)構(gòu)的研究,本文簡(jiǎn)要介紹了幾種常用的分子生物技術(shù),在此基礎(chǔ)上,以小試高效厭氧反應(yīng)器中的顆粒污泥作為研究對(duì)象,利用這些技術(shù)分析了不同負(fù)荷條件下厭氧顆粒污泥內(nèi)微生物的含量變化和群落結(jié)構(gòu)。1探針的特異性利用分子生物技術(shù)對(duì)微生物種群進(jìn)行研究,主要是基于16SrDNA進(jìn)行的。根據(jù)待測(cè)微生物體內(nèi)16SrDNA中的某段特異性序列,根據(jù)不同的目的設(shè)計(jì)特異性不同的引物或探針,其特異性可以在界、門、綱、目、科、屬、種甚至菌株等水平上顯示。本文中詳細(xì)介紹的分子生物學(xué)方法主要包括:實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-timequantitativePolymeraseChainReaction,RQ-PCR)、熒光原位雜交(FluorescenceInSituHybridization,FISH)、變性梯度凝膠電泳(DenaturingGradientGelElectrophoresis,DGGE)和測(cè)序、相似性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。1.1熒光顯微鏡技術(shù)FISH是將一小段(通常15~30個(gè)堿基)用熒光物質(zhì)標(biāo)記過的DNA或RNA序列作為探針,直接投加到環(huán)境樣品中,利用其與樣品中同源性微生物細(xì)胞內(nèi)核酸分子的堿基互補(bǔ)配對(duì)特性,在熒光顯微鏡下,直接觀察和探測(cè)特定微生物的空間分布與數(shù)量關(guān)系的技術(shù)。這種技術(shù)還可以用不同修飾核苷酸分子標(biāo)記不同的DNA探針,再用不同的熒光素分子檢測(cè)不同的探針分子,因此可以在熒光顯微鏡下在同一張切片上同時(shí)觀察幾種DNA探針的定位,直接得到它們的相關(guān)位置和順序。采用這一技術(shù)可以同時(shí)對(duì)不同類群的細(xì)菌在細(xì)胞水平上進(jìn)行原位的定性定量分析和空間位置標(biāo)示。1.2熒光信號(hào)檢測(cè)實(shí)時(shí)定量PCR(RTQ-PCR)是綜合PCR、分子雜交和酶動(dòng)力學(xué)的一種新技術(shù),它根據(jù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescenceresonanceenergytranslation,FRET)的原理進(jìn)行,在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)的積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。Ct值(每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))與起始模板的關(guān)系研究表明,每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系,起始拷貝數(shù)越多,Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可做出標(biāo)準(zhǔn)曲線,其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù),縱坐標(biāo)代表Ct值。因此,只要獲得未知樣品的Ct值,即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。1.3電泳檢測(cè)dna分子解鏈的方法DGGE的基本原理是:DNA雙鏈結(jié)構(gòu)經(jīng)變性劑(目前常用的變性劑有尿素和甲酰胺)處理后會(huì)部分解鏈,一旦解鏈,其在凝膠電泳中的遷移速率會(huì)急劇下降。由于A-T堿基對(duì)的結(jié)合力較G-C堿基對(duì)更弱,因此含有較多A-T堿基對(duì)的DNA分子解鏈需要的變性劑濃度較低,即堿基序列有差別的DNA分子解鏈需要不同變性劑濃度。選取合適范圍的變性梯度后,變性劑的濃度由上到下,從低到高成線性梯度。電泳開始時(shí),DNA在膠中的遷移速率僅與分子大小有關(guān),而一旦DNA到達(dá)該DNA變性濃度位置時(shí),DNA雙鏈解鏈,遷移速率大大降低,從而使堿基組成有差異的DNA片段在凝膠的不同位置形成條帶,根據(jù)電泳條帶的多寡和條帶的位置可以初步對(duì)樣品中微生物種群進(jìn)行研究。由于G、C含量高的區(qū)域具有較高的解鏈溫度,將一段長(zhǎng)度為30~50bp富含G、C的DNA堿基片段,即“GC夾板”(GC-clamp),附加到引物的一端,有助于DGGE檢出率的提高。1.4序列分析的基本原理DGGE分析后即可觀察到微生物種群的豐度信息,但對(duì)種群結(jié)構(gòu)的全面研究需要將DGGE分離的條帶切下,進(jìn)一步測(cè)序,作相似性分析,最終構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。目前有很多生物公司都可以提供測(cè)序商業(yè)服務(wù),測(cè)得未知的序列后,將它們與基因庫(kù)中已知的序列進(jìn)行比對(duì),可以初步確定未知基因的種類。目前有不少軟件可以幫助進(jìn)行序列比較,兩條序列之間的雙重比對(duì)最常用的是BLAST程序,多個(gè)序列之間的多重比對(duì)常用CLUSTALW。應(yīng)用這些程序可以按照與測(cè)得序列的相似性高低列出已知序列名單、相似性程度以及這些序列相對(duì)應(yīng)的微生物種類。最常用的基因庫(kù)是GenBank,它是美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院維護(hù)的基因序列數(shù)據(jù)庫(kù),匯集并注釋了所有公開的核酸以及蛋白質(zhì)序列。GenBank與日本DNA數(shù)據(jù)庫(kù)(DDBJ)以及歐洲生物信息研究院的歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)(EMBL)一起,都是國(guó)際核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)合作的成員。所有這三個(gè)中心都可以獨(dú)立地接受數(shù)據(jù)提交,而三個(gè)中心之間則逐日交換信息,并制作相同的充分詳細(xì)的數(shù)據(jù)庫(kù)向公眾開放。更為精確的微生物分類還取決于系統(tǒng)發(fā)育分析(phylogeneticanalysis),即根據(jù)能反映微生物親緣關(guān)系的生物大分子(如16SrDNA)的序列同源性,計(jì)算不同物種之間的遺傳距離,然后采用聚類分析等方法,將微生物進(jìn)行分類,并將結(jié)果用系統(tǒng)發(fā)育樹(phylogenetictree)表示。計(jì)算菌屬、菌種之間的遺傳距離可以采用不同方法,如Jukes-Cantor方法。在計(jì)算遺傳距離之后,構(gòu)建進(jìn)化樹時(shí)有許多種方法,基于距離的和基于特征符的如最大簡(jiǎn)約性法(MaximumParsimonymethods,MP)和最大可能性法(MaximumLikelihoodmethods,ML),基于算法的和基于標(biāo)準(zhǔn)的如除權(quán)配對(duì)法(UPGMAM)和鄰位相連法(Neighbor-joining,NJ)等。在進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析時(shí)常用到的一些軟件包括MEGA、ARB和PHYLIP等。2采用分子生物技術(shù)研究了厭氧顆粒污泥中的微生物群2.1產(chǎn)甲烷顆粒污泥樣品的制備試驗(yàn)中產(chǎn)甲烷顆粒污泥樣品取自本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的一個(gè)小試厭氧反應(yīng)器,反應(yīng)器總體積15L。接種污泥為處理實(shí)際淀粉廢水的EGSB內(nèi)的顆粒污泥。試驗(yàn)進(jìn)水為葡萄糖自配水,按COD:N∶P約為400∶2.5~5∶1的比例投加尿素和磷酸二氫鉀,反應(yīng)器內(nèi)pH值控制在6.8~7.2之間,溫度在35℃左右。在反應(yīng)器啟動(dòng)與穩(wěn)定運(yùn)行的過程中,每隔一定時(shí)間從反應(yīng)器底部取出泥樣,共取得3個(gè)產(chǎn)甲烷顆粒污泥樣品,其中樣品A:啟動(dòng)后第1d取得,即接種污泥;樣品B:運(yùn)行25d后取得,反應(yīng)器的COD負(fù)荷約為20kg/(m3·d);樣品C:運(yùn)行75d后取得,反應(yīng)器COD負(fù)荷為35kg/(m3·d)。2.2產(chǎn)甲烷顆粒污泥的主要細(xì)菌分布對(duì)3個(gè)污泥樣品進(jìn)行FISH實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖1。發(fā)現(xiàn):在樣品A、B、C中真細(xì)菌含量均明顯高于古細(xì)菌;真細(xì)菌主要分布在顆粒污泥外層,古細(xì)菌主要分布在內(nèi)層,而顆粒中心則基本未表現(xiàn)出生物活性;且隨著反應(yīng)器COD負(fù)荷的增加以及運(yùn)行時(shí)間的延長(zhǎng),古細(xì)菌的分布更趨向于顆粒污泥的中心區(qū)域。在產(chǎn)甲烷顆粒污泥中,水解菌、發(fā)酵產(chǎn)酸菌以及產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌等真細(xì)菌并不是十分嚴(yán)格的厭氧細(xì)菌,且通常這些真細(xì)菌直接吸收和利用原廢水中的有機(jī)基質(zhì),所以這些細(xì)菌通常會(huì)生長(zhǎng)分布在顆粒污泥的外層;而顆粒污泥中主要的古細(xì)菌是其中的產(chǎn)甲烷細(xì)菌,它們是嚴(yán)格的厭氧細(xì)菌,且利用真細(xì)菌的代謝產(chǎn)物,因此,在3個(gè)樣品中,古細(xì)菌均分布在顆粒污泥的內(nèi)層。2.3產(chǎn)甲烷絲菌的相對(duì)含量PCR對(duì)顆粒污泥中真細(xì)菌和古細(xì)菌種群的數(shù)量關(guān)系的研究對(duì)3個(gè)污泥樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR試驗(yàn),根據(jù)各自的克隆質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品,確定了厭氧顆粒污泥樣品中古細(xì)菌與真細(xì)菌的相對(duì)含量(本文中所稱某種細(xì)菌的含量均指其16SrDNA拷貝數(shù)),以及甲烷髦毛菌在古細(xì)菌中相對(duì)含量,結(jié)果如圖2。發(fā)現(xiàn):厭氧產(chǎn)甲烷顆粒污泥樣品A、B、C中,古細(xì)菌與真細(xì)菌在總細(xì)菌中的相對(duì)含量,隨著反應(yīng)器有機(jī)負(fù)荷的增加而增加;甲烷髦毛菌在古細(xì)菌中的相對(duì)含量也有同樣趨勢(shì),負(fù)荷增長(zhǎng)到35kgCOD/(m3·d)時(shí),產(chǎn)甲烷絲菌上升到33%,增加了約1倍。厭氧反應(yīng)器的啟動(dòng)過程實(shí)際上主要就是產(chǎn)甲烷菌的培養(yǎng)過程,隨著COD負(fù)荷的逐漸提高以及運(yùn)行時(shí)間的延長(zhǎng),古細(xì)菌的相對(duì)數(shù)量逐漸增多。厭氧反應(yīng)器中乙酸是主要的產(chǎn)甲烷基質(zhì)(一般來(lái)說有70%左右的甲烷來(lái)自乙酸的氧化分解),而甲烷髦毛菌是乙酸營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷細(xì)菌,且對(duì)基質(zhì)的親和力較高,故其在厭氧反應(yīng)器中占有較高的比例。2.4古細(xì)菌種群的變化對(duì)3個(gè)顆粒污泥樣品同時(shí)進(jìn)行總DNA提取、純化,經(jīng)過PCR擴(kuò)增后再進(jìn)行DGGE分析,最終得到其中真細(xì)菌和古細(xì)菌的DGGE圖譜,如圖3和圖4所示。一般認(rèn)為,在DGGE圖譜上,每一條帶代表某種特定的微生物,且亮度相對(duì)大的條帶代表樣品中的優(yōu)勢(shì)微生物。因此,圖3表明:與接種污泥A相比,在小試反應(yīng)器中運(yùn)行不同時(shí)間后的樣品B和C中真細(xì)菌的種類和優(yōu)勢(shì)菌種均發(fā)生了一定的變化;且樣品B與C的真細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)基本相似。圖4表明,隨著反應(yīng)器COD負(fù)荷的增加以及運(yùn)行時(shí)間的延長(zhǎng),顆粒污泥中古細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)發(fā)生較明顯的變化,接種泥樣A中各菌種數(shù)量上相對(duì)均勻,而反應(yīng)器運(yùn)行不同時(shí)間后的樣品B和C中占優(yōu)勢(shì)的古細(xì)菌種類逐漸減少。真細(xì)菌生長(zhǎng)迅速,易于死亡。接種污泥在接種之前已在常溫、半封閉狀態(tài)下放置了2個(gè)月左右,待反應(yīng)器運(yùn)行后,真細(xì)菌的活性逐漸恢復(fù),故接種污泥與小試反應(yīng)器運(yùn)行后的樣品之間,真細(xì)菌種群相似性較低;隨著反應(yīng)器穩(wěn)定的運(yùn)行,顆粒污泥中真細(xì)菌的種群結(jié)構(gòu)沒有因?yàn)镃OD負(fù)荷的增加以及運(yùn)行時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)生顯著的變化。古細(xì)菌生長(zhǎng)易于受到環(huán)境因素的影響,進(jìn)水成分和COD負(fù)荷的差異會(huì)導(dǎo)致古細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)發(fā)生較明顯變化。接種污泥是處理生產(chǎn)實(shí)際淀粉廢水的厭氧顆粒污泥,進(jìn)水成分復(fù)雜,經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)酸過程后,生成的甲烷前體物種類也較復(fù)雜,因此,其古細(xì)菌種類較多。而小試厭氧反應(yīng)器的進(jìn)水為葡萄糖自配水,甲烷前體物種類較單一,使運(yùn)行后期的樣品中優(yōu)勢(shì)菌種的種類明顯減少;且接種污泥對(duì)應(yīng)的COD負(fù)荷較低,隨著COD負(fù)荷的逐漸增加,古細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)不斷地發(fā)生變化。即與真細(xì)菌相比,古細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)更易受到進(jìn)水成分和COD負(fù)荷改變的影響,這與其他學(xué)者的研究結(jié)果相符。2.5甲烷桿菌屬中的多態(tài)性分布將古細(xì)菌DGGE圖譜中有代表性的7個(gè)條帶自上至下編號(hào),如圖4所示。對(duì)7個(gè)條帶切膠回收并測(cè)序,其序列輸入Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),并提交序列(AccessionNo.:DQ272259~DQ27225965),進(jìn)而繪制系統(tǒng)發(fā)育樹,見圖5?？芍?其中3個(gè)序列3、4和6與甲烷桿菌屬中的模式菌種(Methanobacteriumformicicum)相似性達(dá)98%以上;序列5與甲烷微粒菌屬中的模式菌種(Methanocorpusculumparvum)相似性達(dá)99%;序列7與甲烷髦毛菌屬中的菌種(Methanosaetaharundinacea)相似性達(dá)99%;序列1與可培養(yǎng)微生物相似性低,與其他學(xué)者在厭氧反應(yīng)器及自然厭氧環(huán)境中獲得的克隆序列(Unculturedarchaeon)相似性達(dá)98%以上;而序列2與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中已有序列相似性均低于95%,很可能是一種未知古細(xì)菌。因此,本研究中的小試厭氧產(chǎn)甲烷反應(yīng)器內(nèi),最適合生長(zhǎng)的古細(xì)菌主要包括甲烷微粒菌、甲烷桿菌和甲烷髦毛菌等。3微生物群落的變化本文利用分子生物技術(shù)對(duì)小試厭氧反應(yīng)器中處于不同運(yùn)行階段的厭氧顆粒污泥中微生物種群進(jìn)行研究,考察了種群多樣性、特征微生物的空間分布和定量關(guān)系進(jìn)行研究,結(jié)果表明:1)真細(xì)菌主要分布在顆粒污泥外層,古細(xì)菌主要分布在內(nèi)層,而顆粒中心則基本未表現(xiàn)出生物活性;且隨著反應(yīng)器有機(jī)負(fù)荷的增加以及運(yùn)行時(shí)間的延長(zhǎng),古細(xì)菌分布更趨向于顆粒污泥的中心區(qū)域。2)厭氧顆粒污泥中真細(xì)菌數(shù)量高于古細(xì)菌,且隨著反應(yīng)器有機(jī)負(fù)荷的增加以及運(yùn)行時(shí)間的延長(zhǎng),古細(xì)菌在所有微生物中的比例有所提高,其中甲烷髦毛菌