外源基因表達(dá)產(chǎn)物的純化外源基因表達(dá)產(chǎn)物的純化外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離與純化是進(jìn)一步開展其功能研究和應(yīng)用開發(fā)的重要環(huán)節(jié)。每個(gè)生物細(xì)胞往往都含有大量不同結(jié)構(gòu)和功能的蛋白質(zhì)及DNA、RNA、多糖和脂類等眾多的非蛋白質(zhì)，要將目標(biāo)蛋白從如此眾多的物質(zhì)中分離出來而又要保證其結(jié)構(gòu)與功能的完整性，是一件精細(xì)、復(fù)雜，而又十分重要的工作。外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離與純化是進(jìn)一步開不同表達(dá)形式采取不同的策略分泌型重組蛋白，通常體積大、濃度低，因此應(yīng)在純化之前采用沉淀或超濾等方法先進(jìn)行濃縮處理包涵體重組蛋白，應(yīng)先離心回收包涵體融合型重組蛋白，一般是胞內(nèi)可溶性的，擬首先選用親和層析進(jìn)行純化不同表達(dá)形式采取不同的策略分泌型重組蛋白，通常體積大、濃度低分離純化常用的方法超濾分子大小、性狀離心密度層析帶電特性、吸附性、分子大小等電泳帶電特性、分子大小分離純化常用的方法超濾鹽析蛋白質(zhì)在高濃度中性鹽溶液中會(huì)沉淀析出，稱為鹽析鹽析原理：高濃度鹽離子與蛋白質(zhì)分子爭(zhēng)奪水化水，破壞蛋白質(zhì)分子表面的水膜，同時(shí)鹽離子也會(huì)影響蛋白質(zhì)分子所帶電荷，從而引起蛋白質(zhì)沉淀，但通常不會(huì)引起蛋白質(zhì)的變性。鹽析蛋白質(zhì)在高濃度中性鹽溶液中會(huì)沉淀析出，稱為鹽析透析法透析袋只用于除鹽類和小分子雜質(zhì)透析法透析袋超濾超濾是一種加壓膜分離技術(shù)，即在一定的壓力下，使小分子溶質(zhì)和溶劑穿過一定孔徑的特制的薄膜，而使大分子溶質(zhì)留在膜的一邊膜有各種不同的類型和規(guī)格優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，成本低廉，不需增加任何化學(xué)試劑，實(shí)驗(yàn)條件溫和超濾超濾是一種加壓膜分離技術(shù)，即在一定的壓力下，使小分子溶質(zhì)離心原理：當(dāng)含有細(xì)小顆粒的懸浮液靜置不動(dòng)時(shí)，由于重力場(chǎng)的作用使得懸浮的顆粒下沉或上浮離心就是利用離心機(jī)轉(zhuǎn)子高速旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力，加快沉降速度，把樣品中不同沉降系數(shù)的物質(zhì)分離開微粒在重力場(chǎng)下移動(dòng)的速度與微粒的大小和密度有關(guān)，并且又與重力場(chǎng)的強(qiáng)度及液體的粘度有關(guān)離心原理：當(dāng)含有細(xì)小顆粒的懸浮液靜置不動(dòng)時(shí)，由于重力場(chǎng)的作用電泳電泳層析利用物質(zhì)在固定相與流動(dòng)相之間不同的分配比例，達(dá)到分離目的。系統(tǒng)的組成:固定相流動(dòng)相待分離的樣品層析利用物質(zhì)在固定相與流動(dòng)相之間不同的分配比例，達(dá)到分離目的層析層析的種類凝膠過濾層析離子交換層析親和層析層析層析的種類凝膠層析---分子篩層析1、分子量大的物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠粒子內(nèi)部，所以大分子物質(zhì)遷移速度快；2、小分子物質(zhì)要通過凝膠網(wǎng)孔進(jìn)入凝膠粒子內(nèi)部，遷移速度慢。凝膠層析---分子篩層析1、分子量大的物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠粒子內(nèi)凝膠層析---分子篩層析分子篩是具有三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，有天然的，也可人工合成。根據(jù)網(wǎng)孔不同可制成不同規(guī)格。凝膠層析---分子篩層析分子篩是具有三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，離子交換層析原理：離子交換劑中所含的可解離基團(tuán)在水溶液中能與溶液中的其它陽離子或陰離子起交換作用，電荷不同的物質(zhì)，對(duì)管柱上的離子交換劑有不同的親和力離子交換基團(tuán)在水溶液中解離后，能吸引水中被分離物的離子，各種物質(zhì)在離子交換劑上的離子濃度與周圍溶液的離子濃度保持平衡狀態(tài)洗脫時(shí)，通過改變pH，增加鹽濃度，離子被取代而解吸下來。離子交換層析原理：離子交換劑中所含的可解離基團(tuán)在水溶液中能與12346789105pH+-蛋白質(zhì)凈電荷等電點(diǎn)吸附陰離子交換劑吸附陽離子交換劑pH<pI（+）pH=pI（0）pH>pI（-）12346789105pH+-蛋等電點(diǎn)吸附陰離子交換劑吸附陽離子交換層析的基本操作離子交換層析的基本操作離子交換層析操作步驟層析柱平衡平衡緩沖液的用量至少為柱體積的2倍平衡緩沖液的流速可略高于正常操作流速平衡終點(diǎn)以流出液的離子濃度、導(dǎo)電性、pH值與緩沖液一致為準(zhǔn)，其中pH值最重要離子交換層析操作步驟層析柱平衡離子交換層析操作步驟上樣:為了達(dá)到滿意的分離效果，進(jìn)樣量一般為介質(zhì)交換容量的10-20%為了避免進(jìn)樣溶液中的離子強(qiáng)度過高，樣品濃度不宜太高交換容量：離子交換劑中全部可交換的離子或功能基團(tuán)的總數(shù)離子交換層析操作步驟上樣:離子交換層析操作步驟洗脫恒定洗過階段洗脫梯度洗脫離子交換層析操作步驟洗脫離子交換層析操作步驟產(chǎn)品收集根據(jù)洗脫的方式采取合適的收集方式離子交換層析操作步驟產(chǎn)品收集親和層析將具有特殊結(jié)構(gòu)的親和分子制成固相吸附劑放置在層析柱中，當(dāng)被分離的蛋白混合液通過層析柱時(shí)，與吸附劑具有親和能力的蛋白質(zhì)就會(huì)被吸附而滯留在層析柱中。那些沒有親和力的蛋白質(zhì)直接流出。選用適當(dāng)?shù)南疵撘?，改變結(jié)合條件將被結(jié)合的蛋白質(zhì)洗脫下來，這種分離純化蛋白質(zhì)的方法稱為親和層析。親和層析將具有特殊結(jié)構(gòu)的親和分子制成固相吸附劑放置在層析柱中親和層析生物分子中有些分子的特定結(jié)構(gòu)能同其他分子相互識(shí)別并結(jié)合，如酶與底物的識(shí)別結(jié)合、受體與配體的識(shí)別結(jié)合、抗體與抗原的識(shí)別結(jié)合，這種結(jié)合既是特異的，又是可逆的，改變條件可以使這種結(jié)合解除。生物分子間的這種結(jié)合能力稱為親和力。親和層析生物分子中有些分子的特定結(jié)構(gòu)能同其他分子相互識(shí)別并結(jié)親和層析非特異性洗脫:改變緩沖液的pH、離子強(qiáng)度、介電常數(shù)、溫度特異性洗脫：再次利用生物學(xué)特異性只洗脫和配基專一作用的酶，不洗脫由于非專一吸附上去的雜蛋白再生：親和層析拄可在一次層析后用大量洗脫劑連續(xù)洗滌，然后再用平衡緩沖液平衡，經(jīng)處理后的層析柱能再次使用。親和層析非特異性洗脫:親和層析優(yōu)點(diǎn)：1.純