固相萃取法分離鑒定菊科植物款冬

款冬花是薔薇科植物的款冬發(fā)芽。具有潤(rùn)肺、益氣、止咳、粘液等功效。主要產(chǎn)于中國(guó)東北、華北、華東、西北、湖南、江西、貴州、云南、西藏等地。1儀器、試劑和試藥WatersH-CLASSUPLC色譜儀(Waters公司);二極管陣列檢測(cè)器(Waters公司);ASE350型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Heidolph公司);KQ-500DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)XS105DU十萬(wàn)分之一電子分析天平(上海托利多有限公司);Mili-Q超純水系統(tǒng)(Millipore公司)。CleanetPCX固相萃取小柱(500mg/6mL，天津博納艾杰爾科技有限公司)。對(duì)照品克氏千里光堿(批號(hào):ZZS19072502)由上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司提供;對(duì)照品的純度大于98%;乙腈、甲醇、甲酸和甲酸銨均為質(zhì)譜級(jí)(Fisher)，其他試劑為分析純?？疃ǚ謩e采自河北省和甘肅省，經(jīng)中國(guó)食品藥品檢定研究院中藥民族藥檢定所研究員鑒定為菊科植物款冬TussilagofarfaraL．的干燥花蕾。2方法和結(jié)果2.1條件1色譜柱:WatersCORTECSUPLCC2.2溶液的制備2.2.1對(duì)照溶液的制備取克氏千里光堿對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1mL含20μg的溶液，即為對(duì)照品溶液。2.2.2固相萃取萃取液的制備取款冬花粉末(過(guò)四號(hào)篩)2.0g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，加甲醇40mL，超聲處理(功率300W，頻率40kHz)30min，過(guò)濾，殘?jiān)?mL甲醇洗滌2次，過(guò)濾，合并濾液，50℃減壓回收溶劑至約1mL，后加入0.5%的硫酸水溶液10mL溶解或混懸，進(jìn)行固相萃取;固相萃取具體流程為:先用5mL甲醇活化陽(yáng)離子固相萃取柱(CleanetPCX,500mg/6mL)后，用0.5%硫酸水溶液平衡固相萃取柱，然后將上述硫酸水的樣品溶液加至固相萃取柱上，甲醇20mL淋洗除雜，濃度為8%氨水-甲醇=1∶3溶液10mL洗脫，收集洗脫液，50℃減壓回收溶劑至約2mL，加入甲酸1mL，用水定容至5mL,0.22μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，即為供試品溶液。2.3方法研究2.3.1檢測(cè)限和定量限精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，加甲醇配制成2.048、5.12、10.24、20.48、40.96、81.82μg·mL以定量離子對(duì)的色譜峰信噪比S/N=3對(duì)應(yīng)的最低濃度為檢測(cè)限(LOD)，以定量離子對(duì)色譜峰信噪比S/N=10對(duì)應(yīng)的最低濃度為定量限(LOQ)，檢測(cè)限為0.05μg·mL2.3.2精密度測(cè)試精密吸取克氏千里光堿對(duì)照品溶液1μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定其峰面積，RSD分別為0.63%(n=6)，見(jiàn)表1，結(jié)果表明儀器精密度良好。2.3.3溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取同一供試品溶液(編號(hào)1)，分別于配制后0、2、4、8、12和24h，按前述色譜條件測(cè)定峰面積，克氏千里光堿峰面積平均值為769844,RSD為0.76%，結(jié)果表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。2.3.4重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果取本品粉末(編號(hào)1),2.00g，共6份，按前述方法測(cè)定，結(jié)果克氏千里光堿平均含量為0.00534%,RSD為2.44%，表明本試驗(yàn)重復(fù)性良好。2.3.5加樣回收率和rsd率取已知含量的同一批樣品(編號(hào)1),6份，每份1.0g，分別置具塞錐形瓶中，再分別依次精密加入濃度為40.96μg·mL上述結(jié)果表明，6份克氏千里光堿的平均回收率為89.46%,RSD值為2.80%，該方法準(zhǔn)確率高。2.4克氏千里光堿含量測(cè)定分別準(zhǔn)確稱(chēng)取不同產(chǎn)地的款冬花藥材2.0g，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，依據(jù)外標(biāo)法計(jì)算克氏千里光堿的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。3討論3.1款冬花中克氏千里光堿的檢測(cè)克氏千里光堿具有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)，采用二極管陣列檢測(cè)器掃描220nm左右具有最大吸收峰(圖3)，通過(guò)固相萃取技術(shù)富集樣品中的克氏千里光堿并除去大部分干擾成分，同時(shí)借助UPLC較高的靈敏度，可實(shí)現(xiàn)UPLC-DAD法對(duì)款冬花中克氏千里光堿的準(zhǔn)確測(cè)定。3.2里西啶氧化物的分離能力本研究考察了不同配比乙腈-水以及含有甲酸、甲酸銨等含酸溶液作為流動(dòng)相對(duì)吡咯里西啶生物堿的分離能力的影響。通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相比例，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)最終確定流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液(15∶85)恒流洗脫，在該系統(tǒng)下5min內(nèi)能夠完成對(duì)克氏千里光堿的分離，并且峰形對(duì)稱(chēng)，理論塔板數(shù)高，能夠達(dá)到定量測(cè)定的要求。3.3克氏千里光堿含