一、基因診斷的概念和特點(diǎn)二、基因診斷的主要技術(shù)方法三、常見的基因異常及其檢測四、疾病的基因診斷(自習(xí))五、基因診斷在法醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用第一節(jié)基因診斷(gene

diagnosis)2023/6/41當(dāng)前第1頁\共有53頁\編于星期五\21點(diǎn)

基因診斷通常是指利用分子生物學(xué)的方法技術(shù)，直接檢測體內(nèi)DNA的結(jié)構(gòu)變異或RNA的水平變化，從而對(duì)疾病作出診斷的方法。一、基因診斷的概念和特點(diǎn)（一）概念

適用于遺傳性疾病、感染性疾病、腫瘤等多種疾病的診斷，以及個(gè)體識(shí)別和親子鑒定等法病學(xué)領(lǐng)域。2023/6/42當(dāng)前第2頁\共有53頁\編于星期五\21點(diǎn)（二）特點(diǎn)--以已知基因作為檢測對(duì)象（l）特異性強(qiáng)：直接檢測導(dǎo)致疾病發(fā)生的基因變化；（2）靈敏度高：所采用的分子雜交和聚合酶鏈反應(yīng)等技術(shù)都具有信號(hào)放大作用；（3）取樣便利：一般不受組織或時(shí)相的限制；（4）早期診斷：易在疾病尚無臨床表現(xiàn)時(shí)作出診斷；（5）應(yīng)用廣泛：可檢測自體基因和外源基因。一、基因診斷的概念和特點(diǎn)2023/6/43當(dāng)前第3頁\共有53頁\編于星期五\21點(diǎn)(一)核酸分子雜交（NAhybridization）(二)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)(三)單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（SSCP）(四)DNA分子多態(tài)性（DNApolymorphism）分析(五)限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）分析(六)顯微切割（microdissection）技術(shù)4(七)DNA序列測定（DNAsequencing）二、基因診斷的主要技術(shù)方法2023/6/44當(dāng)前第4頁\共有53頁\編于星期五\21點(diǎn)(一)核酸分子雜交4.DNA芯片(DNAchip)技術(shù)

Southern/DNA印跡、Northern/RNA印跡(第七/六章)和Western/蛋白質(zhì)印跡(第九/二章)其他雜交方法:1.斑點(diǎn)印跡(dotblotting)與狹縫雜交2.組織原位雜交(tissureinsituhybridization)3.等位基因特異性寡核苷酸雜交(allele-specificoligonucleotidehybridization,ASOH)二、基因診斷的主要技術(shù)方法2023/6/45當(dāng)前第5頁\共有53頁\編于星期五\21點(diǎn)61.斑點(diǎn)印跡(dotblotting)雜交將核酸(DNA或RNA)樣品點(diǎn)在NC膜上，變性后與標(biāo)記探針結(jié)合，顯影或顯色，密度測量，與對(duì)照品比較確定所測核酸量的高低。方法：應(yīng)用：主要用于檢測細(xì)胞基因拷貝數(shù)的變化或者mRNA含量的變化。便于大規(guī)模檢測和篩選；容易出現(xiàn)假陽性。特點(diǎn)：2023/6/46當(dāng)前第6頁\共有53頁\編于星期五\21點(diǎn)Slot-blot結(jié)果GS-670型光密度掃描儀(Bio-Rad)

當(dāng)前第7頁\共有53頁\編于星期五\21點(diǎn)82.組織原位雜交(tissureinsituhybridization)組織或細(xì)胞(新鮮組織切片、細(xì)胞涂片或石蠟切片)樣品做適當(dāng)處理(如固定劑固定、蛋白酶消化)，使其通透性增大，標(biāo)記探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與核酸雜交。方法：應(yīng)用：被檢測基因或mRNA在細(xì)胞內(nèi)的檢測及定位。特點(diǎn)：不需提取被檢核酸，可確定被檢核酸細(xì)胞內(nèi)定位。1986創(chuàng)建的熒光原位雜交(FISH)用于特定基因的定位及其缺失、擴(kuò)增或重排的檢測。2023/6/48當(dāng)前第8頁\共有53頁\編于星期五\21點(diǎn)2023/6/49當(dāng)前第9頁\共有53頁\編于星期五\21點(diǎn)原癌基因ERBB-2(Her-2)，基因擴(kuò)增熒光原位雜交檢測2023/6/410當(dāng)前第10頁\共有53頁\編于星期五\21點(diǎn)熒光原位雜交2023/6/411當(dāng)前第11頁\共有53頁\編于星期五\21點(diǎn)3.等位基因特異性寡核苷酸雜交(ASOH)根據(jù)已知基因突變位點(diǎn)的堿基序列，設(shè)計(jì)和制備與野生型或突變型基因序列片段互補(bǔ)的兩種探針，分別與被檢DNA進(jìn)行雜交，確定基因突變存在與否，分辨純/雜合子。方法：應(yīng)用：基因結(jié)構(gòu)變異所致疾病的診斷。特點(diǎn)：雜交條件要求嚴(yán)格，以避免出現(xiàn)假陽性或假陰性。2023/6/412當(dāng)前第12頁\共有53頁\編于星期五\21點(diǎn)N：正?；颍籋：雜合子基因；M：突變基因ASO1ASO2NHMASOH示意圖2023/6/413當(dāng)前第13頁\共有53頁\編于星期五\21點(diǎn)4.DNA芯片(DNAchip)技術(shù)DNA點(diǎn)陣(DNAarray)——把多種已知序列的DNA片段排列在固體支持物上，同時(shí)對(duì)樣品中的多種核酸進(jìn)行檢測和分析。方法：應(yīng)用：單核苷酸多態(tài)性(SNP)、基因表達(dá)譜和遺傳性疾病的分析；病原微生物的大規(guī)模檢測。DNA微陣列(DNAmicroarray)——通過計(jì)算機(jī)控制點(diǎn)樣和圖像掃描的高密度集成探針的雜交技術(shù)。2023/6/414當(dāng)前第14頁\共有53頁\編于星期五\21點(diǎn)(二)PCR技術(shù)(第七/七章)1.PCR技術(shù)的原理以DNA分子為模板，加入與擬擴(kuò)增DNA片段兩端分別互補(bǔ)的一對(duì)寡核苷酸鏈作為引物，在DNA聚合酶的催化下，按照半保留復(fù)制的形式分別合成兩股新的DNA互補(bǔ)鏈，可使兩引物間的DNA片段拷貝數(shù)增加一倍。

多次重復(fù)這一過程，可使這段DNA拷貝數(shù)隨復(fù)制次數(shù)以指數(shù)形式擴(kuò)增。二、基因診斷的主要技術(shù)方法2023/6/415當(dāng)前第15頁\共有53頁\編于星期五\21點(diǎn)2.基因診斷中常用的PCR及其衍生技術(shù)(1)DNA的微量分析

總RNA(或mRNA)ss-cDNAds-cDNAPCR擴(kuò)增PCR法靈敏度高，對(duì)模板DNA純度要求不高，且樣品用量極微(如一滴血、一根頭發(fā)等)。(2)RT-PCR(reversetranscriptional-PCR)2023/6/416當(dāng)前第16頁\共有53頁\編于星期五\21點(diǎn)17(3)巢式-PCR(nestedPCR)用2對(duì)引物(外引物、內(nèi)引物)擴(kuò)增，大大提高了擴(kuò)增的特異性(4)不對(duì)稱PCR(asymmetricPCR)2個(gè)引物濃度不等，一般采用50:1或100:1的摩爾比，主要獲取單鏈DNA作構(gòu)象分析或用作探針。2023/6/417當(dāng)前第17頁\共有53頁\編于星期五\21點(diǎn)18(5)多重PCR(multiplexPCR)在同反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物，同時(shí)擴(kuò)增同一DNA樣品中的多個(gè)不同序列區(qū)域，且每對(duì)引物所擴(kuò)增的產(chǎn)物長度都不同，可根據(jù)電泳結(jié)果判斷是否存在某些基因片段的缺失或長度改變。(6)等位基因特異性PCR(AS-PCR)

針對(duì)等位基因的序列差異區(qū)域設(shè)計(jì)引物，使引物的3’端與等位基因序列的差異堿基對(duì)應(yīng)，僅能與突變型或野生型互補(bǔ)。2023/6/418當(dāng)前第18頁\共有53頁\編于星期五\21點(diǎn)(7)原位PCR(insituPCR,IS-PCR)技術(shù)

1)細(xì)胞和組織經(jīng)固定劑固定、蛋白酶消化，使細(xì)胞獲得適度的通透性，既利于PCR反應(yīng)試劑到達(dá)靶位，又可防止擴(kuò)增產(chǎn)物從細(xì)胞內(nèi)漏出；

2)把載玻片的靶DNA進(jìn)行常規(guī)PCR(病毒RNA的擴(kuò)增用RT-PCR);

3)最后通過間接法(原位雜交)或直接法(PRC過程中加入標(biāo)記)檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。2023/6/419當(dāng)前第19頁\共有53頁\編于星期五\21點(diǎn)（8）實(shí)時(shí)熒光定量PCR

PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而使熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)；每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。2023/6/420當(dāng)前第20頁\共有53頁\編于星期五\21點(diǎn)21(三)單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析利用單個(gè)或多個(gè)堿基不同、但序列長度相等的雙鏈核酸分子，經(jīng)變性成單鏈后可具有不同的構(gòu)象而在中性PAGE電泳中的遷移率不同；(singlestrandcomformationpolymorphism,SSCP)與正常的電泳圖型對(duì)照，出現(xiàn)新條帶即可判定存在堿基變異。二、基因診斷的主要技術(shù)方法2023/6/421當(dāng)前第21頁\共有53頁\編于星期五\21點(diǎn)與PCR聯(lián)用稱為PCR-SSCP；廣泛用于大批樣品基因突變的檢測(初篩)。2023/6/422當(dāng)前第22頁\共有53頁\編于星期五\21點(diǎn)231.限制性片段長度多態(tài)性的檢測3.單核苷酸多態(tài)性2.數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性的檢測(四)DNA分子多態(tài)性(DNApolymorphism)分析(singlenucleotidepolymorphism,SNP)(variablenumberoftandemrepeats,VNTR)(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)二、基因診斷的主要技術(shù)方法2023/6/423當(dāng)前第23頁\共有53頁\編于星期五\21點(diǎn)24VNTR的重復(fù)序列出現(xiàn)次數(shù)在6次100次之間；小衛(wèi)星DNA(minisatelliteDNA):重復(fù)單元長度為6~70bp；微衛(wèi)星DNA(microsatelliteDNA):重復(fù)單元長度為1~6bp。短串聯(lián)重復(fù)DNA(shorttandemrepeatDNA,STRDNA):重復(fù)單元長度為2~6bp。根據(jù)重復(fù)單元長度可分為：2023/6/424當(dāng)前第24頁\共有53頁\編于星期五\21點(diǎn)25不同個(gè)體間重復(fù)單元[如(CA)n/(TG)n]的拷貝數(shù)(即出現(xiàn)的頻率)不同，因而產(chǎn)生多態(tài)性，稱為VNTR多態(tài)性。VNTR多態(tài)性：限制酶識(shí)別位點(diǎn)限制酶識(shí)別位點(diǎn)2023/6/425當(dāng)前第25頁\共有53頁\編于星期五\21點(diǎn)26(五)限制酶譜分析當(dāng)某種限制酶的切點(diǎn)改變時(shí)(由點(diǎn)突變、單個(gè)堿基的插入或缺失引起)，用該種限制酶切割后得到的DNA片段的大小和數(shù)目都隨之發(fā)生變化，通過電泳分析即可作出判斷。PCR-RFLP設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增引物，使擴(kuò)增片段包括某一個(gè)或數(shù)個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列，在PCR擴(kuò)增后用該限制酶切割PCR產(chǎn)物，根據(jù)電泳后酶切片段長度變化，即可作出診斷。二、基因診斷的主要技術(shù)方法2023/6/426當(dāng)前第26頁\共有53頁\編于星期五\21點(diǎn)ABCDEFG－＋DEFBGCA-GAATTC--CTTAAG-EFBG－＋C+DAEcoRⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的變化2023/6/427當(dāng)前第27頁\共有53頁\編于星期五\21點(diǎn)28(六)顯微切割(microdissection)技術(shù)是應(yīng)用激光捕獲顯微鏡，在高倍鏡下選擇幾個(gè)甚至一個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分析；可用于石蠟包埋組織進(jìn)行回顧性診斷。2.染色體的顯微切割。1.組織細(xì)胞的顯微切割是切割分裂中期的染色體的目的區(qū)域，如某些斷裂或易位、倒位位點(diǎn)的染色體片段，再進(jìn)行后續(xù)分析。二、基因診斷的主要技術(shù)方法2023/6/428當(dāng)前第28頁\共有53頁\編于星期五\21點(diǎn)

瑞士MIICellCut全自動(dòng)激光顯微切割（熒光）系統(tǒng)

可通過紫外激光切割需要分離的組織，然后通過有黏性的Eppendorff管蓋進(jìn)行收集，這樣就可以將特定類型的細(xì)胞從組織切片上分離下來。2023/6/429當(dāng)前第29頁\共有53頁\編于星期五\21點(diǎn)可以準(zhǔn)確、快速、無損傷地分離出純凈的特定細(xì)胞或組織，保持細(xì)胞內(nèi)生物分子的完整性，以便用于后續(xù)的DNA、RNA和蛋白質(zhì)分析。配有近紅外激光(波長810nm)；紫外激光(波長349nm)；紅色、綠色、藍(lán)色三種熒光濾光片。美國Arcturus公司的Veritas激光捕獲顯微分離儀2023/6/430當(dāng)前第30頁\共有53頁\編于星期五\21點(diǎn)PICS

Altra

II流式細(xì)胞儀(分析分選)2023/6/431當(dāng)前第31頁\共有53頁\編于星期五\21點(diǎn)32(七)DNA序列測定該法是基因診斷所有的技術(shù)方法中最準(zhǔn)確最可靠的—種。缺點(diǎn)：費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、費(fèi)用高。二、基因診斷的主要技術(shù)方法2023/6/432當(dāng)前第32頁\共有53頁\編于星期五\21點(diǎn)33(一)點(diǎn)突變的檢測三、常見的基因異常及其檢測(二)大片段核苷酸丟失或插入的檢測(三)基因重排的檢測(四)基因擴(kuò)增的檢測(五)DNA多態(tài)性的檢測(六)基因表達(dá)異常的檢測(七)病原體基因的檢測2023/6/433當(dāng)前第33頁\共有53頁\編于星期五\21點(diǎn)34(一)點(diǎn)突變的檢測

狹義的點(diǎn)突變指堿基替代，分為單點(diǎn)突變和多點(diǎn)突變；廣義的點(diǎn)突變還包括少數(shù)核苷酸的缺失或插入。1.已知點(diǎn)突變的檢測突變位點(diǎn)已被闡明的遺傳病，可采用PCR等位基因特異性寡核苷酸雜交(PCR/AS0H)檢測。三、常見的基因異常及其檢測2023/6/434當(dāng)前第34頁\共有53頁\編于星期五\21點(diǎn)PCR/AS0H

檢測:(1)根據(jù)突變點(diǎn)上下游的序列設(shè)計(jì)合成引物，PCR擴(kuò)增出突變區(qū)的DNA片段。(2)將PCR產(chǎn)物用斑點(diǎn)或狹縫點(diǎn)樣器點(diǎn)在尼龍膜上，以紫外線照射固定。(3)針對(duì)上述每種突變位點(diǎn)，分別合成2個(gè)寡核苷酸探針；其中一個(gè)具有正常的堿基序列，另一個(gè)則具有突變的堿基序列。(4)分別預(yù)雜交、雜交、洗膜、放射自顯影或顯色。(5)分析正常探針及突變探針分別雜交得到的顯影或顯色圖譜，即可作出基因診斷2023/6/435當(dāng)前第35頁\共有53頁\編于星期五\21點(diǎn)N：正常基因；H：雜合子基因；M：突變基因ASO1ASO2NHM(PCR/AS0H檢測示意圖)2023/6/436當(dāng)前第36頁\共有53頁\編于星期五\21點(diǎn)2.未知點(diǎn)突變的檢測初篩：PCR-SSCP分析法確認(rèn)：DNAsequencing。2023/6/437當(dāng)前第37頁\共有53頁\編于星期五\21點(diǎn)PCR-SSCP:廣泛用于大批樣品基因突變的檢測(初篩)。2023/6/438當(dāng)前第38頁\共有53頁\編于星期五\21點(diǎn)3.少數(shù)核苷酸缺失或插入的檢測可供選擇的方法：PCR-RFLP分析、AS-PCR、PCR-SSCP及DNA測序等2023/6/439當(dāng)前第39頁\共有53頁\編于星期五\21點(diǎn)鐮形細(xì)胞貧血原因：β-珠蛋白鏈第6位密碼子GAG→GTG，造成Glu→Val所致。方法：設(shè)計(jì)一對(duì)引物PCR擴(kuò)增可得294bp，OxaNI

消化，電泳。294191103bpAA：正常人BB：純合子病人CC：雜合子病人結(jié)果：2023/6/440當(dāng)前第40頁\共有53頁\編于星期五\21點(diǎn)(二)大片段核苷酸丟失或插入的檢測1.中等長度(0.5-1.5kb)的DNA片段缺失或插入，可用一對(duì)引物的普通PCR檢測。2.若基因較大度(大于1.5kb)，且多個(gè)位點(diǎn)存在插入或缺失、位點(diǎn)間距離較遠(yuǎn)，宜采用多重PCR法檢測。5’3’3’5’（多重PCR的引物設(shè)計(jì)示意圖）三、常見的基因異常及其檢測2023/6/441當(dāng)前第41頁\共有53頁\編于星期五\21點(diǎn)DMD基因定位于人類X染色體短臂Xp21.2上。位于該區(qū)的dystrophin(肌營養(yǎng)不良蛋白)基因的突變或部分缺失，是導(dǎo)致DMD的原發(fā)病因。

dystrophin基因中有9個(gè)易發(fā)生缺失的熱點(diǎn)區(qū)片段,它們分別位于外顯子4、8、12、17、19、44、45、48和51。杜氏肌營養(yǎng)不良癥(Duchennemusculardystrophy,

DMD)2023/6/442當(dāng)前第42頁\共有53頁\編于星期五\21點(diǎn)多重PCR法檢測中的基因突變同時(shí)用2對(duì)引物雙重?cái)U(kuò)增dystrophin基因外顯子17和48區(qū)域內(nèi)的2個(gè)片段，可檢測出75％左右的基因缺失型患者；

若同時(shí)用9對(duì)引物多重?cái)U(kuò)增，則可以檢測到90％左右的基因缺失型患者。2023/6/443當(dāng)前第43頁\共有53頁\編于星期五\21點(diǎn)(三)基因重排的檢測基因從一條染色體的正常位置轉(zhuǎn)移到其他染色體的某個(gè)位置稱基因易位或重排。1.熒光原位雜交技術(shù)(FISH)。2.PCR擴(kuò)增可用不同顏色的熒光標(biāo)記DNA探針，可在染色體上定位基因或DNA片段及它們彼此間的排序。

前提條件是已知重排基因和位點(diǎn)的序列。三、常見的基因異常及其檢測2023/6/444當(dāng)前第44頁\共有53頁\編于星期五\21點(diǎn)熒光原位雜交（雙色FISH）2023/6/445當(dāng)前第45頁\共有53頁\編于星期五\21點(diǎn)(四)基因擴(kuò)增的檢測基因擴(kuò)增指基因拷貝數(shù)增加的現(xiàn)象,可增加幾十到上千倍?？捎么郎y基因的DNA片段或cDNA片段為探針，基因組DNA采用適當(dāng)?shù)南拗泼该盖泻笞鱏outhern印跡雜交分析。三、常見的基因異常及其檢測2023/6/446當(dāng)前第46頁\共有53頁\編于星期五\21點(diǎn)

(五)DNA多態(tài)性的檢測

1.限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)2.數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)多性多態(tài)性位點(diǎn)周圍DNA序列已知時(shí)，可用PCR/RFLP分析。針對(duì)串聯(lián)重復(fù)序列兩側(cè)的DNA序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增后電泳。三、常見的基因異常及其檢測2023/6/447當(dāng)前第47頁\共有53頁\編于星期五\21點(diǎn)1.mRNA的相對(duì)定量分析

(1)斑點(diǎn)雜交或狹線雜交放射或非放射標(biāo)記的cDNA探針與待測RNA雜交，經(jīng)顯影或顯色，與正常對(duì)照比較即可定量待測RNA。(2)RT-PCR法

對(duì)電泳凝膠中的擴(kuò)增產(chǎn)物cDNA行光密度掃描，計(jì)算模板mRNA的量；若dNTPs帶放射性標(biāo)記，作放射活性測定，并由此推算mRNA的含量。(六)基因表達(dá)異常的檢測三、常見的基因異常及其檢測2023/6/448當(dāng)前第48頁\共有53頁\編于星期五\21點(diǎn)2.mRNA的絕對(duì)定量分析

(1)采用一系列已知不同濃度的與待測mRNA序列相同但長度不同的內(nèi)對(duì)照mRNA，在同一體系中一同進(jìn)行RT-PCR(加32p-dCTP)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離，分別測定兩者放射性強(qiáng)度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線即可查出特異mRNA的量。(2)用熒光定量PCR法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物定量。3.mRNA的長度分析(2)先分析RT-PCR產(chǎn)物電泳條帶長度，后測序確認(rèn)。(1