關于分子熒光光度法第1頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月

第一節(jié)概述一、光致發(fā)光物質分子吸收特定波長的光能后，由基態(tài)躍遷至激發(fā)態(tài)。處于激發(fā)態(tài)的物質分子是不穩(wěn)定的，可能通過輻射（發(fā)光）或非輻射的形式放出多余的能量，由激發(fā)態(tài)重新回到基態(tài)。物質分子吸收外來光被激發(fā)后所產(chǎn)生的發(fā)光現(xiàn)象，叫光致發(fā)光。熒光10-9~10-6s實用磷光10-3~10s不實用二、熒光光度法利用測量熒光強度而建立起來的一類測定物質含量的分析方法，稱為熒光光度法，即熒光法。

第2頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月

優(yōu)點：靈敏度高，10-7~10-9g/ml，比紫外分光光度法靈敏度高10~1000倍。第二節(jié)基本原理一、熒光的產(chǎn)生基態(tài)激發(fā)光激發(fā)態(tài)去激發(fā)基態(tài)（一）激發(fā)處于基態(tài)的物質分子吸收光能時，其電子對中的一個電子被激發(fā)到某一較高能級?；鶓B(tài)單重態(tài)所有電子都自旋配對的分子電子態(tài)。激發(fā)態(tài)激發(fā)單重態(tài)S1S2……

激發(fā)三重態(tài)T1T2……(二)去激發(fā)指分子中處于激發(fā)態(tài)的電子以輻射或非輻射方式回到基態(tài)的過程。第3頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月輻射躍遷

熒光去激發(fā)磷光振動馳豫無輻射躍遷

內(nèi)轉移

（熱的形式）體系間跨越外轉移1、振動馳豫

同一電子能級中，電子由高振動能級躍遷到低振動能級，并將能量以熱的形式傳遞給溶劑分子，這一過程稱振動馳豫。2、內(nèi)轉移兩個相鄰電子能級相距較近，以致其振能級重疊時，電子由高電子能級躍遷至低電子能級，同時將能量以熱的形式傳遞給溶劑分子。第4頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月

意義：無論分子中的電子最初被激發(fā)至哪一激發(fā)單重態(tài)（如S1、S2、S3……)，它都能通過內(nèi)轉移和振動馳豫到達S1的最低振動能級上。一般情況下，S1與S0之間很難發(fā)生內(nèi)轉移；T1與S0之間發(fā)生內(nèi)轉移的幾率要大些。3、體系間跨越

電子由激發(fā)單重態(tài)向激發(fā)三重態(tài)的無輻射躍遷稱為體系間跨越。常見于含重原子(I、Br)的有機分子中。4、外轉移

激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子或其它溶質相互作用，以熱的形式失去多余的能量回到基態(tài)，這一過程叫分子的外轉移。外轉移后，分子的熒光或磷光減弱或消失，稱“猝滅”或“熄滅”。磷光壽命長，發(fā)生外轉移機率大，所以室溫下很難見到磷光。第5頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月

5、熒光發(fā)射

電子由第一激發(fā)單重態(tài)S1（最低振動能級）躍遷至基態(tài)S0而發(fā)射的光叫熒光。6、磷光發(fā)射

電子由第一激發(fā)三重態(tài)T1躍遷至基態(tài)S0而發(fā)射的光叫磷光。

躍遷方式時間振動馳豫10-12~10-14S

內(nèi)轉移10-11~10-13S

熒光10-6~10-9S

磷光10-4~10S第6頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月二、影響熒光的因素

熒光效率：

ψf=

發(fā)射熒光的分子數(shù)被激發(fā)的分子總數(shù)熒光效率越大，表示分子產(chǎn)生熒光的能力越強。1、分子結構

(1)π→π*躍遷能產(chǎn)生較強熒光?！a(chǎn)生熒光的主要躍遷類型

(2)含π-π共軛體系的有機分子，電子共軛程度越大，熒光效率越大。

(3)剛性結構和共平面效應：隨分子的剛性和共平面性增加，電子共軛程度亦增加，熒光效率增大。

(4)取代基效應：斥電子基→ψf↑

吸電子基→ψf↓

重原子→ψf↓第7頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月2、環(huán)境因素

(1)溫度溫度↑→熒光效率↓

(2)溶劑極性↑→熒光↑

(3)溶液pH值影響熒光物質存在形式。因此要嚴格控制溶液pH值。

(4)熒光熄滅劑（鹵素離子、重金屬離子等等）3、熒光物質濃度自熄滅：當熒光物質高到一定濃度時，熒光分子間碰撞增多，使熒光強度減弱的現(xiàn)象。第8頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月原理圖熒光測量應在垂直激發(fā)光方向上進行。一、光源特點：光強度大，適用范圍寬。常用：高壓汞燈，氙燈，溴鎢燈，激光，脈沖激光二、單色器干涉濾光片，光柵三、樣品池石英杯四、檢測器光電倍增管第三節(jié)熒光光度計日立850型熒光分光光度計第9頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月第四節(jié)

定量分析方法原理：一定條件下，熒光強度（If)與濃度(c)呈線性關系。

If=Kc

定量分析的依據(jù)方法：標準曲線法和標準對比法第10頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月第五節(jié)分析條件的選擇線性范圍、激發(fā)光波長、熒光波長、散射光的排除一、線性范圍的選擇熒光物質濃度較低時，熒光強度與物質濃度呈線性關系。二、選擇激發(fā)波長和熒光波長1、激發(fā)波長的選擇激發(fā)光譜：將光源發(fā)射的激發(fā)光用單色器單色后照射物質，連續(xù)改變激發(fā)光波長，固定熒光發(fā)射波長，測定相應的熒光強度，所得熒光強度-激發(fā)波長圖譜，稱激發(fā)光譜。一般選擇最大激發(fā)波長作為激發(fā)光波長。第11頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月2、熒光波長的選擇

熒光光譜：用最大激發(fā)波長的激發(fā)光照射熒光物質時，依次測定所發(fā)射的各波長的熒光強度，所得熒光強度-熒光波長圖譜，稱為熒光光譜。一般選擇熒光強度最強的波長作為測定波長。三、散射光干擾的排除1、散射光當用一束光照射溶液時，大部分光被吸收和透過，還有小部分被溶劑分子碰撞而向四面八方散射，這種光稱散射光。瑞利散射光波長與激發(fā)光波長一樣拉曼散射光波長比激發(fā)光波長長第12頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月2、消除方法（1）選擇適宜的激發(fā)光波長用不同波長的激發(fā)光照射某一熒光物質，所產(chǎn)生的熒光峰位波長相同，但產(chǎn)生的拉曼散射光峰位各不相同。所以，可通過選擇某一適宜的激發(fā)波長，使產(chǎn)生的拉曼散射光峰位遠離熒光峰位而不干擾。（2）選擇合適的溶劑

拉曼散射光主要來源于溶劑。不同溶劑產(chǎn)生的拉曼散射光波長不同，所以，通過選擇不同溶劑使散射光波長遠離熒光波長，而消除其干擾作用。第13頁，課件共20頁，創(chuàng)作于2023年2月第六節(jié)應用因熒光光度法具有靈敏度高、選擇性好、取樣量少等優(yōu)點，而被廣泛應用于醫(yī)學檢驗、藥物分析、環(huán)境監(jiān)測和衛(wèi)生防疫等領域。