生物制藥工藝學(xué)基因藥物第1頁/共56頁

在未形成概念前，20世紀(jì)70年代就開始臨床實驗，由于實驗未取得成果，而且沒有得到NIH的批準(zhǔn)，廣受抨擊。

80年代，在動物身上進(jìn)行了大量試驗，為其臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1990年9月，臨床實驗正式開始?；颊呤且幻紘?yán)重聯(lián)合免疫缺陷癥的年輕姑娘，她從父母處各繼承了一個缺陷的ada基因，造成體內(nèi)缺乏腺苷酸脫氨酶。我國復(fù)旦大學(xué)的薛京倫研究小組，做了世界上首例血友?。禄蛑委煛５?頁/共56頁第3頁/共56頁

成功地對先天性重癥免疫缺陷癥進(jìn)行基因治療的法國基因治療組組長艾倫·費(fèi)希爾博士（左）和成員瑪麗娜·卡巴甘那卡勃博士（右）。第4頁/共56頁2002年10月,一名法國男孩在接受試驗性基因治療后罹患白血病，而基因治療很可能是白血病發(fā)病的原因。

Fisher說，他非常希望這種基因治療方法從總體而言利大于弊。除基因治療之外，治療SCID的另一種治療方法是近親的骨髓移植。除非骨髓移植非常匹配，否則手術(shù)的失敗率是25%。他強(qiáng)調(diào)說，這一失敗率比現(xiàn)在接受基因治療的11例患者的并發(fā)癥發(fā)生率高2倍以上。第5頁/共56頁從基因角度：對缺陷的基因進(jìn)行原位修復(fù)用正常有功能的基因置換有缺陷的基因增補(bǔ)缺陷基因（不需要去除異?；?，而是另外轉(zhuǎn)入與缺陷基因同源的有功能的基因來彌補(bǔ)缺陷的基因）第6頁/共56頁從治療角度導(dǎo)入基因以改變患者細(xì)胞的基因表達(dá)導(dǎo)入基因：缺陷基因相對應(yīng)的有功能的同源基因缺陷基因無關(guān)的治療基因第7頁/共56頁第8頁/共56頁第9頁/共56頁基因治療的兩種形式體細(xì)胞基因治療種系基因治療只限于某一體細(xì)胞的基因的改變只限于某個體的當(dāng)代對缺陷的生殖細(xì)胞進(jìn)行矯正當(dāng)代及子代第10頁/共56頁2、基因治療的方式基因矯正或置換基因增補(bǔ)基因封閉其他第11頁/共56頁3、導(dǎo)入的方式體外導(dǎo)入（exvivo）體外將基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)再將這種基因修飾過的細(xì)胞回輸病人體內(nèi)使這種帶外源基因的細(xì)胞在體內(nèi)表達(dá)達(dá)到治療或預(yù)防的目的第12頁/共56頁第13頁/共56頁體內(nèi)導(dǎo)入（invivo）外源基因直接導(dǎo)入體內(nèi)有關(guān)的組織細(xì)胞使其進(jìn)入相應(yīng)的細(xì)胞并表達(dá)第14頁/共56頁基因治療的基本程序治療性基因的選擇基因載體的選擇病毒載體非病毒載體靶細(xì)胞的選擇體細(xì)胞生殖細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移間接體內(nèi)療法直接體內(nèi)療法外源基因表達(dá)的篩選

利用載體中的標(biāo)記基因回輸體內(nèi)第15頁/共56頁目前臨床試驗的治療基因：合適的能達(dá)到治療/預(yù)防的目的基因的cDNA目的基因的cDNA的獲得cDNA文庫中目的基因的克隆人工合成基因片段PCR法篩選擴(kuò)增目的基因

二、治療的基因的選擇第16頁/共56頁三、載體系統(tǒng)--運(yùn)送基因的工具病毒載體非病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體腺病毒腺相關(guān)病毒單純胞疹病毒哺乳動物人工染色體脂質(zhì)體裸DNA基因縫合線法

第17頁/共56頁逆轉(zhuǎn)錄病毒載體第18頁/共56頁逆轉(zhuǎn)錄病毒的生活周期進(jìn)入宿主細(xì)胞雙鏈RNA

逆轉(zhuǎn)錄酶

雙鏈DNA前病毒

整合到宿主細(xì)胞基因組DNA中宿主細(xì)胞RNA聚合酶IImRNA

病毒RNA基因組作為合成相應(yīng)

病毒蛋白質(zhì)的模板包裝成新的病毒顆粒，離開宿主第19頁/共56頁逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建長末端重復(fù)序列包裝信號LTRφgagpolenvLTR調(diào)節(jié)和啟動轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生病毒核心蛋白產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生病毒外膜蛋白包裝信號LTRφ目的基因標(biāo)記基因LTR

逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的一般結(jié)構(gòu)重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體第20頁/共56頁假病毒顆粒的產(chǎn)生病毒復(fù)制需要的gag，pol，env基因已經(jīng)預(yù)先整合進(jìn)包裝細(xì)胞的基因組第21頁/共56頁第22頁/共56頁第23頁/共56頁腺病毒DNA載體的特點(diǎn)

基因重排低外源基因于病毒DNA重組后能穩(wěn)定復(fù)制幾個周期

安全性能好不整合人的染色體DNA，不會導(dǎo)致惡性腫瘤

宿主范圍廣對受體細(xì)胞是否處于分裂期要求不嚴(yán)格

使用效果好外源基因在載體上容易高效表達(dá)

第24頁/共56頁3、腺相關(guān)病毒（adenoassociatedvirus，AAV）屬于細(xì)小病毒科，其成熟病毒顆粒中有的含正鏈DNA，有的含負(fù)鏈DNA。不能獨(dú)立繁殖，其繁殖依賴于輔助病毒（腺病毒或皰疹病毒）?；蚪M僅5kb，有兩個ORF，5’和3’端各有一個由145個氨基酸組成的反向重復(fù)序列（ITR），對病毒的復(fù)制、整合、包裝等有重要調(diào)控作用。第25頁/共56頁優(yōu)點(diǎn)：1)、反向末端重復(fù)序列中沒有轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，減少激活原癌基因的可能性2）、宿主廣，只能形成慢性感染3）、可發(fā)生位點(diǎn)特異性整合，有利于表達(dá)4）、熱穩(wěn)定性好，而作為輔助病毒的腺病毒在60℃即被滅活5）、安全性較好，本身不致病第26頁/共56頁4、單純皰疹病毒（herpessimplevirus，HSV）雙鏈DNA病毒，基因組大小152kb，可缺失多個基因仍保持復(fù)制能力。特點(diǎn)：1）、序列清楚2）、可容納至少30kb外源基因3）、宿主廣，可侵染脊椎動物各種細(xì)胞4）、重組病毒培養(yǎng)過程中易得到較高滴度5）、從外周進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)，不影響神經(jīng)元功能但表達(dá)產(chǎn)物對多種類型宿主有毒性，且可引起嚴(yán)重免疫反應(yīng)，要進(jìn)入臨床仍需改進(jìn)第27頁/共56頁5、痘病毒載體痘苗病毒為線形雙鏈的有包膜病毒,其核心顆粒不依賴宿主細(xì)胞而獨(dú)立引進(jìn)轉(zhuǎn)錄和復(fù)制,宿主范圍廣泛，易于培養(yǎng)；痘苗病毒基因組中大量非必需基因的缺乏并不影響其在宿主細(xì)胞的復(fù)制能力,可允許在同一或不同非必需區(qū)插入多個基因痘苗病毒缺點(diǎn)是載體對細(xì)胞的毒性,同時病毒能被人體的補(bǔ)體系統(tǒng)滅活并降解第28頁/共56頁表常用病毒載體得特征和適用范圍病毒載體生物學(xué)特性適用范圍反轉(zhuǎn)錄病毒載體可感染分裂細(xì)胞；整合到染色體中表達(dá)時間長有致癌的危險Exvivo基因治療腫瘤基因治療

腺病毒載體可感染分裂和非分裂細(xì)胞不整合到染色體中外源基因表達(dá)水平高表達(dá)時間較短免疫原性強(qiáng)Invivo基因治療腫瘤基因治療疫苗

AAV病毒載體可感染分裂和非分裂細(xì)胞整合到染色體中無致病性；免疫原性弱；可長期表達(dá)外源基因在骨骼肌、心肌、肝臟、視網(wǎng)膜等組織中表達(dá)水平較高Invivo基因治療Exvivo基因治療遺傳疾病的治療獲得性慢性疾病的基因治療

HSV病毒載體具嗜神經(jīng)性，可逆軸突傳遞可潛伏感染，容量大可感染分裂和非分裂細(xì)胞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療腫瘤的基因治療第29頁/共56頁第30頁/共56頁四、靶細(xì)胞1、造血細(xì)胞常用反轉(zhuǎn)錄病毒，體外基因轉(zhuǎn)移，彌散的組織多，分散廣。對轉(zhuǎn)入外源基因的細(xì)胞可檢驗，考慮安全性及有效性。2、肌肉細(xì)胞常用。肌肉細(xì)胞分布廣，含量豐富，為“永久性”細(xì)胞，基因不會因分裂而丟失；細(xì)胞長而大，且為多核細(xì)胞，基因易轉(zhuǎn)移和表達(dá)。為“非生命”器官，安全；溶酶體少，外源DNA不易被降解，基因存活時間長；血流豐富，產(chǎn)物可釋放入血第31頁/共56頁3、皮膚表皮涂抹或膚內(nèi)注射裸露DNA活脂質(zhì)體包裹DNA。安全、簡便，易行，但皮膚不斷更替。4、其他如肝細(xì)胞、靜脈注射等。第32頁/共56頁五、轉(zhuǎn)移方法1、化學(xué)法DNA介導(dǎo)：用磷酸鈣微量沉淀外源DNA，然后與靶細(xì)胞混合。染色體介導(dǎo)：用秋水仙素處理使染色體固縮，破碎，差速離心，分離出染色體，與受體細(xì)胞混合。脂質(zhì)體介導(dǎo)：臨床已用受體介導(dǎo)：外源DNA與某些細(xì)胞特異性受體的多肽配基形成復(fù)合物，與受體結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞第33頁/共56頁2、物理法直接注射法，顯微注射法，電穿透法等3、病毒介導(dǎo)目前最常用和最成熟的方法第34頁/共56頁六、基因治療的臨床試驗當(dāng)前基因治療試驗：治療性試驗基因標(biāo)記非治療性試驗第35頁/共56頁治療性試驗1、遺傳性疾病2、惡性腫瘤（1）抑癌基因或細(xì)胞因子基因治療（2）自殺基因系統(tǒng)（3）抑制血管生成（4）反義藥物（5）導(dǎo)入MHCI類抗原基因（6）導(dǎo)入MDR1(MultidrugResistance)基因3、病毒性感染4、其他第36頁/共56頁第37頁/共56頁第38頁/共56頁第39頁/共56頁第40頁/共56頁遺傳疾病缺失的基因產(chǎn)物細(xì)胞類型嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷腺苷酸脫氫酶T/B淋巴細(xì)胞慢性肉牙腫瘤細(xì)胞色素b中性粒細(xì)胞戈謝病糖腦苷酶巨噬細(xì)胞鐮刀狀細(xì)胞貧血β珠蛋白紅細(xì)胞α和β地中海貧血α和β珠蛋白紅細(xì)胞Lesch-Nyhan癥群次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基底神經(jīng)節(jié)Ducheme肌委縮萎縮素肌肉細(xì)胞帕金森病多巴胺腦黑質(zhì)肺氣腫α1抗胰蛋白酶肺上皮細(xì)胞囊性纖維化CF跨膜傳導(dǎo)調(diào)控劑肺/胰上皮細(xì)胞苯丙酮尿癥苯丙氨酸羥化酶肝細(xì)胞家族性高膽固醇血癥低密度脂蛋白受體肝細(xì)胞血友病A和B凝血因子Ⅷ和Ⅸ血小板、肝細(xì)胞第41頁/共56頁

遺傳性單基因疾病腺苷脫氨酶(ADA)缺乏的

嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)第42頁/共56頁腺苷脫氨酶(ADA)缺乏的

嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)第一個基因臨床治療的方案(1990.9.14,NIH)病因:淋巴細(xì)胞缺乏ADA酶腺苷、dATP堆積破壞免疫功能患兒很少活到成年治療策略：淋巴細(xì)胞ADA酶恢復(fù)至正常水平的

5%-10%

維持免疫系統(tǒng)功能改善病人癥狀第43頁/共56頁第44頁/共56頁治療基本步驟:ADA基因+逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入患者淋巴細(xì)胞體外擴(kuò)增回輸病人體內(nèi)淋巴細(xì)胞ADA酶恢復(fù)至正常水平的5%-10%

維持免疫系統(tǒng)功能,改善病人癥狀第45頁/共56頁第46頁/共56頁惡性腫瘤的細(xì)胞因子基因治療基因工程“瘤苗”策略a：將刺激免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子基因(IL-2/IL-12/IFN-γ)轉(zhuǎn)導(dǎo)腫瘤細(xì)胞，提高腫瘤細(xì)胞的免疫原性轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞因子基因的腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)持續(xù)分泌細(xì)胞因子增強(qiáng)抗腫瘤的免疫反應(yīng)，形成局部的抗腫瘤免疫微環(huán)境引發(fā)全身的抗腫瘤免疫機(jī)能第47頁/共56頁策略b：引入抑瘤基因，如p53基因今又生（Gendicine）是世界上第一個獲得批準(zhǔn)臨床使用的抗腫瘤基因藥，由正常人腫瘤抑制基因p53

和改構(gòu)的5型腺病毒基因重組而成。

通常判斷一個抗癌基因必須同時具備以下條件：

1、在該腫瘤中該基因發(fā)生了變化，包括突變、缺失、甲基化等。

2、將該基因的野生型導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞能夠部分或全部抑制其表型。

3、該基因在該腫瘤相應(yīng)的正常組織中存在正常表達(dá)。第48頁/共56頁P(yáng)53結(jié)構(gòu)示意圖P53基因產(chǎn)物是一種核磷酸化蛋白，能夠與8種以上細(xì)胞蛋白結(jié)合，生物學(xué)活性是引起細(xì)胞周期阻滯，誘導(dǎo)凋亡和細(xì)胞分化。大約50%的人類腫瘤中存在p53基因的變化第49頁/共56頁TheH2alphahelix,showningoldandcomprisedofre