摘要題目：龍蝦殼中提取蛋白質(zhì)工藝條件的研究摘要本實(shí)驗(yàn)探究以龍蝦殼為原料提取龍蝦殼蛋白質(zhì)最佳工藝條件。在破碎龍蝦殼后，用堿溶液溶解蛋白質(zhì)，再加入無機(jī)鹽析出蛋白質(zhì)的方法使蛋白質(zhì)得到分離。采取正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，由NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度為三個(gè)單因素，單因素和正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相結(jié)合得出最佳實(shí)驗(yàn)條件。三因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響強(qiáng)弱順序?yàn)榉磻?yīng)溫度＞反應(yīng)時(shí)間＞氫氧化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)，提取蛋白質(zhì)的最佳工藝條件為：NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，反應(yīng)時(shí)間為4.5h小時(shí)，反應(yīng)溫度110℃。關(guān)鍵詞：龍蝦殼；蛋白質(zhì)；提取；正交法Abstract湖南理工學(xué)院本科畢業(yè)綜合訓(xùn)練目錄AbstractInthisstudy,theoptimumtechnologicalconditionsofextractingproteinfromlobstershellwerestudied.Afterthelobstershellisbroken,theproteinisdissolvedinalkalisolution,andthentheproteinisseparatedbyaddinginorganicsalt.Orthogonalexperimentaldesignwasadopted,andthreesinglefactorsweremassfractionofNaOH,reactiontimeandreactiontemperature.Theoptimalexperimentalconditionswereobtainedbycombiningsinglefactorandorthogonalexperimentaldesign.Theorderofinfluenceofthethreefactorsontheexperimentwasthereactiontemperature>reactiontime>sodiumhydroxidemassfraction.Theoptimaltechnologicalconditionsofproteinextractionwere:massfractionofNaOH10%,reactiontime4.5h,reactiontemperature110℃.Keywords:lobstershell;Protein;Extraction;Theorthogonalmethod.

湖南理工學(xué)院本科畢業(yè)綜合訓(xùn)練目錄目錄摘要 [29]。1.4.2化學(xué)分析法蛋白質(zhì)水解成氨基酸后，檢測出各氨基酸總量，用RP-HPLC樣品進(jìn)行分離，色譜柱選用C18硅膠柱。蛋白質(zhì)的種類除受氨基酸個(gè)數(shù)影響外，氨基酸的排列順序也會(huì)對(duì)此造成影響。用Edman反復(fù)降解法對(duì)樣品進(jìn)行處理，再用cDNA推導(dǎo)即可得到完整的蛋白質(zhì)組成和排序。1.5實(shí)驗(yàn)研究的目的與意義小龍蝦產(chǎn)業(yè)日漸成熟，具有極大的開發(fā)利用潛力。加工龍蝦廢棄物,進(jìn)行蛋白質(zhì)提取的研究使廢棄的資源得到利用、環(huán)境得到保護(hù)，還能促進(jìn)新型食品的開發(fā)，將資源得到最大限度的利用，創(chuàng)造出更大的經(jīng)濟(jì)效益，延伸產(chǎn)業(yè)鏈，推動(dòng)可持續(xù)發(fā)展。

湖南理工學(xué)院本科畢業(yè)綜合訓(xùn)練第2章實(shí)驗(yàn)部分第2章實(shí)驗(yàn)部分2.1儀器、試劑與藥品原料：廢棄的小龍蝦蝦殼試劑：鹽酸、乙醇、氫氧化鈉、高錳酸鉀、氯化鈉等均為分析純；蛋白質(zhì)標(biāo)樣。儀器：分析天平；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；調(diào)溫恒溫電熱套；紅外光譜儀。2.2試驗(yàn)內(nèi)容流程圖廢棄龍蝦蝦殼→洗滌晾干→脫色脫鈣處理→提取蛋白質(zhì)→減壓過濾→分離蛋白質(zhì)→重結(jié)晶蛋白質(zhì)→紅外表征龍蝦殼脫色脫鈣處理方案一：破碎龍蝦殼，取1mol·L-1鹽酸浸泡，軟化蝦殼后清水洗滌至pH值為7，于濃度為2mol·L-1氫氧化鈉溶液中回流10小時(shí)，過濾。濾液冷卻后用鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2，沉降、過濾，烘干。方案二：破碎龍蝦殼，取1mol·L-1鹽酸浸泡24h，軟化蝦殼，用清水洗凈至pH=7，再將蝦殼裝入蒸餾燒瓶中，加入適量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液，加熱回流1h，沉降、過濾，烘干待用。方法三：將龍蝦殼破碎，用濃度為1mol·L-1的鹽酸浸泡24h，軟化蝦殼，用清水洗凈至pH=7，用適量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液浸泡2d，過濾，烘干待用。方法四：將龍蝦殼破碎，用適量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液浸泡24h，脫去蝦殼中的黃色素，過濾、洗凈，用4~6%鹽酸浸泡，使蝦殼完全軟化，脫去蝦殼中的碳酸鈣，再過濾，水洗至中性，烘干待用。研究表明，蝦殼中的紅色素不溶于水，與水混合呈黃色混濁物，易溶于乙醇、四氯化碳、石油醚及色拉油。該色素可以與溴發(fā)生加成反應(yīng)，與高錳酸鉀發(fā)生氧化反應(yīng)。經(jīng)過對(duì)比，方法一脫鈣除色效果更好。2.2.2蛋白質(zhì)的提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)本試驗(yàn)采用三因素三水平L9(33)的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，選用反應(yīng)時(shí)間(A)、反應(yīng)溫度(B)、NaOH濃度(C)3個(gè)研究因素，按下表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以蛋白質(zhì)的提取量為參考指標(biāo)，經(jīng)過分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定最佳提取工藝條件。選取實(shí)驗(yàn)各因素及水平見表1，實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表2表1試驗(yàn)各因素及水平表水平因素A實(shí)驗(yàn)時(shí)間(h)B實(shí)驗(yàn)溫度(℃)CNaOH濃度(%)141001025110153612020實(shí)驗(yàn)步驟按正交實(shí)驗(yàn)條件要求，將固定質(zhì)量已脫色脫鈣烘干的蝦殼，放入圓底燒瓶，在一定溫度、pH值和所需時(shí)間下進(jìn)行脫蛋白質(zhì)反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，用0.1％的高錳酸鉀溶液浸泡除去紅色素，當(dāng)顏色變?yōu)樯钭厣珪r(shí)反應(yīng)完成，進(jìn)行減壓過濾，濾液用鹽酸調(diào)節(jié)pH值，往溶液中加入氯化鈉分離蛋白質(zhì)，再經(jīng)過減壓過濾，固體即為蛋白質(zhì)。2.2.3蛋白質(zhì)的提純對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行脫色重結(jié)晶。在80～90℃下烘干，稱重。

湖南理工學(xué)院本科畢業(yè)綜合訓(xùn)練第3章實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析探討第3章實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析探討本實(shí)驗(yàn)以蛋白質(zhì)的提取產(chǎn)量為目的，因此產(chǎn)量越大實(shí)驗(yàn)越成功，所以，挑出每個(gè)因素中K值最大的水平，根據(jù)表2中K的綜合數(shù)據(jù)比較得出A因素（反應(yīng)時(shí)間）：K1＞K2＞K3B因素（反應(yīng)溫度）：K2＞K1＞K3C因素（NaOH濃度）：K1＞K2＞K3從實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表2）中可得到蛋白質(zhì)產(chǎn)量的影響因素大小順序?yàn)椋悍磻?yīng)溫度（B）＞反應(yīng)時(shí)間(A)＞NaOH濃度(C)。對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果的數(shù)據(jù)，從不同水平條件下對(duì)蛋白質(zhì)提取量上看第2次試驗(yàn)（ABC）蛋白質(zhì)提取量最大，而分析K值時(shí)發(fā)現(xiàn)，在選定的因素水平表范圍內(nèi)，可能存在更好的搭配，該方案不在9個(gè)實(shí)驗(yàn)方案中，這體現(xiàn)了正交試驗(yàn)優(yōu)點(diǎn)。通過因素與指標(biāo)間的關(guān)系趨勢(shì)圖（圖2）進(jìn)行分析找出最佳條件表2正交試驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析表（從100g烘干蝦殼中提?。?shí)驗(yàn)A實(shí)驗(yàn)時(shí)間B實(shí)驗(yàn)溫度CNaOH濃度蛋白質(zhì)提取量序號(hào)(h)(℃)(%)(g)11111.4121221.5431331.1642121.2452231.3362311.2873130.8283211.4093320.92K14.113.474.09K23.854.273.79K33.143.363.22K1/31.371.161.36K2/31.281.421.26K3/31.041.121.07R(極差值)0.330.30.29A—K值與反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系，此時(shí)橫坐標(biāo)代表反應(yīng)時(shí)間B—K值與反應(yīng)溫度的關(guān)系，此時(shí)橫坐標(biāo)代表反應(yīng)溫度C—K值與NaOH濃度的關(guān)系，此時(shí)橫坐標(biāo)代表NaOH濃度圖2正交實(shí)驗(yàn)單因素變化趨勢(shì)分析圖如圖2，反應(yīng)時(shí)間對(duì)龍蝦殼蛋白質(zhì)的提取量有很大影響。蝦殼蛋白質(zhì)提取量隨時(shí)間延長而減少，可能是因?yàn)闀r(shí)間關(guān)系蛋白質(zhì)本身水解了，導(dǎo)致產(chǎn)量變少。NaOH濃度對(duì)蛋白質(zhì)提取量具有一定的影響。在10~20%范圍內(nèi)，隨著NaOH濃度升高，蛋白質(zhì)提取呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，以NaOH為10%時(shí)提取量最高。由圖2極差分析可知，溫度在蛋白質(zhì)提取過程中對(duì)龍蝦殼蛋白質(zhì)的產(chǎn)量影響最大，溫度在水平因素2.0時(shí)蛋白質(zhì)的提取量高于水平因素1.0時(shí)的提取量，在水平因素1.0與水平因素3.0時(shí)，提取量基本相等。這可能由于溫度在1.0時(shí)不能完全溶解，而在高于3.0時(shí)，會(huì)引起龍蝦殼蛋白質(zhì)的熱變性。因此，將提取溫度定在2.0左右較為合適。即取溫度為110℃。3.1各單因素對(duì)龍蝦蛋白質(zhì)提取量影響分析3.1.1反應(yīng)時(shí)間對(duì)龍蝦蛋白質(zhì)提取量的影響通過以上分析，反應(yīng)時(shí)間對(duì)龍蝦殼蛋白質(zhì)的提取量有較大影響，為了進(jìn)一步確定最佳提取時(shí)間，設(shè)置時(shí)間為3h，3.5h，4h，4.5h，5h，5.5h進(jìn)行蛋白質(zhì)提取的反應(yīng)，確定蛋白質(zhì)的最佳提取時(shí)間，結(jié)果如表3和圖3所示，隨著提取時(shí)間的不同蛋白質(zhì)的產(chǎn)量也不同，蝦殼蛋白質(zhì)提取量開始時(shí)隨時(shí)間的延長而增加，然后再隨時(shí)間的增加而產(chǎn)量下降（見圖3）?？赡艿脑蚴?，當(dāng)反應(yīng)提取時(shí)間低于3h時(shí)，龍蝦殼先需一定的溶脹時(shí)間，再經(jīng)過一定時(shí)間完全溶解，還有部分蛋白質(zhì)未完全溶解；而反應(yīng)時(shí)間過長，蛋白質(zhì)的水解程度加強(qiáng)，導(dǎo)致提取產(chǎn)量降低，所以由表3和圖3可知最佳時(shí)間定為4.5h合適。表3反應(yīng)時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取量的影響（從100g烘干蝦殼中提?。r(shí)間（h）33.544.555.5產(chǎn)量（g）0.961.241.461.511.321.17圖3反應(yīng)時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取量的影響（從100g烘干蝦殼中提取）3.1.2氫氧化鈉濃度對(duì)龍蝦殼蛋白質(zhì)提取量的影響由分析可知，NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)龍蝦殼蛋白質(zhì)的提取量有一定影響，為找出最佳NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件，進(jìn)一步設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，設(shè)置NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%，8%，10%，12%，14%，16%，反應(yīng)時(shí)間設(shè)為4.5h。結(jié)果如表4和圖45示，蛋白質(zhì)的提取量隨濃度的升高而增加在10%時(shí)達(dá)到峰值，此時(shí)蛋白質(zhì)的提取量為1.48g，隨后提取量隨濃度增加而降低。原因可能是溶液中的蛋白質(zhì)在高濃度堿的催化下可能發(fā)生了水解，蛋白質(zhì)含量減少，所以實(shí)驗(yàn)將提取蛋白質(zhì)的NaOH最佳濃度定為10%。表4NaOH濃度對(duì)蛋白質(zhì)提取量的影響（從100g烘干蝦殼中提?。㎞aOH濃度（%）6810121416產(chǎn)量（g）0.961.141.481.371.211.04圖4NaOH濃度對(duì)蛋白質(zhì)提取量的影響（從100g烘干蝦殼中提取）3.1.3反應(yīng)溫度對(duì)龍蝦殼蛋白質(zhì)提取量的影響通過以上分析，反應(yīng)溫度在蛋白質(zhì)提取過程中對(duì)龍蝦殼蛋白質(zhì)的提取量影響最大，溫度在110℃時(shí)蛋白質(zhì)的提取量稍高于100℃時(shí)的提取量。為了得到最佳反應(yīng)溫度，針對(duì)反應(yīng)溫度這一因素對(duì)龍蝦殼蛋白質(zhì)提取量的影響進(jìn)行了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)如下，將NaOH濃度、反應(yīng)時(shí)間定為10%和4.5h，將提取溫度范圍縮小，分別設(shè)為100℃，105℃，110℃，115℃，120℃。結(jié)果如表5和圖5所示，蛋白質(zhì)的提取量隨溫度變化而不同，在110℃時(shí)達(dá)到最大值1.54g，提取產(chǎn)量最高，溫度較低或者較高其產(chǎn)量均降低。正如上面所分析的，溫度較低時(shí)龍蝦殼的蛋白質(zhì)不能完全溶解，而溫度較高時(shí)，龍蝦殼蛋白質(zhì)易發(fā)生熱變性。因此，實(shí)驗(yàn)提取的最佳溫度為110℃。 表5反應(yīng)溫度對(duì)龍蝦殼蛋白質(zhì)提取量的影響（從100g烘干蝦殼中提?。┓磻?yīng)溫度（℃）100105110115120 產(chǎn)量（g）0.871.331.521.351.06圖5反應(yīng)溫度對(duì)龍蝦殼蛋白質(zhì)提取量的影響（從100g烘干蝦殼中提?。?.2蛋白質(zhì)的表征利用紅外光譜法對(duì)所提取的樣品和蛋白質(zhì)標(biāo)樣進(jìn)行表征，表征所得結(jié)果如圖6所示。圖中在3423cm-1有一寬的吸收峰，明顯說明有-OH存在，而1636cm-1處有強(qiáng)峰可以看出有C=O存在，所以物質(zhì)中肯定有一個(gè)-COOH；1404cm-1說明存在C-N；1037cm-1有強(qiáng)峰可以看出有C-O，在712cm-1處可以得出有N-H。通過以上分析，可以看出實(shí)驗(yàn)所得樣品與圖7標(biāo)樣紅外光譜圖相近，說明該樣品是蛋白質(zhì)。圖6蛋白質(zhì)樣品紅外光譜圖圖7蛋白質(zhì)標(biāo)樣紅外光譜圖

湖南理工學(xué)院本科畢業(yè)綜合訓(xùn)練第4章結(jié)論第4章結(jié)論通過正交試驗(yàn)與單因素試驗(yàn)相結(jié)合得出從龍蝦殼中提取蛋白質(zhì)的最佳工藝條件為：NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，反應(yīng)時(shí)間為4.5小時(shí)，反應(yīng)溫度為110℃。固定反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度時(shí)，堿濃度對(duì)蛋白質(zhì)提取量有一定影響，開始時(shí)，蛋白質(zhì)的提取量隨NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大而增大，當(dāng)NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，提取量達(dá)到最大1.48g（從100g烘干的龍蝦殼中提?。?，然后隨NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大而減少。固定堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)與反應(yīng)溫度時(shí)，反應(yīng)時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取量影響較大。開始時(shí)，龍蝦殼蛋白質(zhì)提取量隨時(shí)間的增大而增大，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為4.5h時(shí)，達(dá)到最大量1.51g(從100g烘干的龍蝦殼中提?。缓箅S時(shí)間的增大而減少。固定堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，反應(yīng)時(shí)間為4.5h時(shí)，反應(yīng)溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取量影響很大。蛋白質(zhì)的提取量隨反應(yīng)溫度的升高而升高，在110℃時(shí)達(dá)到頂峰，此時(shí)蛋白質(zhì)的提取量為1.52g(從100g烘干的龍蝦殼中提取)，之后蛋白質(zhì)的提取量開始隨溫度的升高而減少。此實(shí)驗(yàn)原料來源豐富價(jià)格低廉，制備工藝簡單明了，生產(chǎn)過程可控，產(chǎn)品市場前景好，具有可觀的經(jīng)濟(jì)效益和良好的應(yīng)用前景。湖南理工學(xué)院本科畢業(yè)綜合訓(xùn)練致謝參考文獻(xiàn)丁純梅，陶庭先，吳之傳.龍蝦殼的綜合利用[J].化學(xué)世界，1995,8:444-445.蔣挺大.殼聚糖[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2000.戴鵬,鄭金路,劉炳榮,等.甲殼素與殼聚糖的化學(xué)改性及應(yīng)用[J].高分子通報(bào),2020(07)：1-17汪曉鵬.天然高分子材料—甲殼質(zhì)和幾丁聚糖的優(yōu)異性質(zhì)和廣泛應(yīng)用[J].西部皮革,2020,486(21):30-31.舒新亞，龔珞軍.淡水小龍蝦健康養(yǎng)殖實(shí)用技術(shù)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2006.李龍,陶薇薇.甲殼質(zhì)在廢水處理中的應(yīng)用[J].上海環(huán)境科學(xué),1988(11):42-45.郎亞軍,張苓花,王運(yùn)吉.甲殼素研究和應(yīng)用[J].中國食品添加劑,2004(01):83-86.陳西廣.甲殼素/殼聚糖結(jié)構(gòu)形態(tài)與生物材料功效學(xué)研究[J].中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2020(9)：126-140戚瑞玲,宋加玉,解力.殼聚糖含量的測定[J].預(yù)防醫(yī)學(xué)論壇,2003,9(005):2+27.QinY，LuX，SunN，etal．Dissolutionorextractionofcrustaceanhellsusingionicliquidstoobtainhighmolecularweightpurifiedchitinanddirectproductionofchitinfilmsandfibers［J］．GreenChemistry，2010，12(6):968－971．QinY，RogersＲD，DalyDT．Processforformingfilms，fibers，andbeadsfromchitinousbiomass:US2012115729［P］．2012連海蘭，袁楊，洪樞，等．一種低共熔離子液提取蝦蟹殼中甲殼素的方法［P］．江蘇:CN105622781A，2016焦雪峰.蝦青素在化妝品中的應(yīng)用[J].廣東化工，2006(1):13-15.李兆華，劉鵬.蝦青素的功能及應(yīng)用進(jìn)展[J].食品與藥品，2005(9):17-20.呂玉華，徐學(xué)明.飼用色素蝦青素的生產(chǎn)及應(yīng)用[J].中國飼料，1998(17):12-15.姜啟興，夏文水.甲殼類下腳