復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)DNAsequencing技術(shù)的發(fā)展 Walter 1975DNAsequencingdeveloped:WalterGilbertandAllanMaxamofHarvardUniversityandFredSangerofCambridgeUniversitysimultaneouslycomeupwithtwotechniquesfordeterminingtheexactsequenceofbasesthatmakeupagene.GilbertandSangersharethe1980NobelPrize(alsowithPaul方末端終止法Sanger-Coulsondideoxyorenzymatic)sequencing化學(xué)裂解法Maxam-Gilbertchemical)DNA300～500技術(shù)由三部分產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的 段,差別僅1個(gè)堿基在變性的聚丙烯酰胺凝膠上電泳膠的放射性自顯影技術(shù)末端終止法 DNA合成的底 ordiphosphate

3’-5’phosphodiesterPhosphodiesterbondsin-O-P-O- O

3’-5’Phosphodiester H

3’-5’phosphodiester-O-P-O- H -O-P-O- O HH HDNADNAHDNApolymeraseIfragmentHHHDideoxySequencingofHReactionRequirementsDideoxySequencingof同位素32P35S基本原

DNA序列其獨(dú)特性在 采用聚丙烯酰胺區(qū)分長(zhǎng)度僅差1個(gè)堿基的單鏈DNA一個(gè)樣品的4 可以在一個(gè)泳道內(nèi)電泳，從而降 泳道間遷移率差異對(duì)精確性的影響過模板反反應(yīng)后的變性、毛細(xì)管電數(shù)據(jù)分模板DNA用質(zhì)粒抽提或膠純化試劑盒得到的質(zhì)?；騊CR產(chǎn)物模 在滅菌水里如ddH2O,超純水；注意不 通過紫外分光光度計(jì)測(cè)定模板濃度（〉0.1ug/ul質(zhì)量(OD260/OD280在1.6-1.8之間反 結(jié)果一般包括個(gè)文件1）.abi件，即測(cè)

序列有重復(fù) 突 是同語(yǔ)言有關(guān) ,黑猩猩也含有這 .人類因與黑猩猩foxP2順序只有極少差N冬氨酸T氨酸S,絲氨酸;Q,谷胺酰氨酸 引自:Nature418:869-872,一 缺失(genelosses)點(diǎn)突變--類轉(zhuǎn)換:一種嘌呤轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N嘌呤,A→G或顛換:一種嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N嘌呤,或相反C→A或A→T核苷酸插入或缺失突堿基代換會(huì)產(chǎn)生4種不同義突變:不改變氨基酸順序的堿基代 子發(fā)生改變的堿基代無(wú)義突變:產(chǎn)生終止 的突變,使翻譯終止,產(chǎn)連讀突變:終止 ,產(chǎn)生延伸的多錯(cuò)義突變的堿基代換發(fā)生 的突變, 位置,將終止 子,使翻譯延續(xù),產(chǎn)生延長(zhǎng)的多肽鏈. 子的讀框,但會(huì)增加或減少突 基數(shù)不成倍數(shù),使后續(xù) 缺失(gene （genetranslocationand某一在腫瘤細(xì)胞中從的正常位置轉(zhuǎn)移到其它染色體的某個(gè)位置上稱為易位或重排。易位與重排易使癌被激活，或是抑癌失活，從而使細(xì)胞。細(xì)胞癌的編碼序列在DNA Burkitt淋巴瘤（8q24異位,激活C-myc）。其它類型 突二 突變的檢測(cè)方 （allelespecificoligonucleotide,單鏈構(gòu)象多態(tài)性（singlestrandconformationpolymorphism,SSCP） （一）的檢 段，稱RFLP。AlleleIIAllele

Allele Allele

BclIRFLP（血友病等 等 特異性寡核苷酸探針及斑點(diǎn)雜交結(jié)探 正常探雜交結(jié)突變探突變型遺傳病的直 診 突變體富集（mutant-enriched 存在已知的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，用連續(xù)二次的巢式PCR來(lái)擴(kuò)增包括存在酶位點(diǎn)編碼子的DNA片段相應(yīng)的內(nèi)切酶消化擴(kuò)增的DN 段，野生型因被酶切而不能進(jìn)入第二次PCR擴(kuò)增，而突變型則能完整進(jìn)入第二次PCR擴(kuò)增并得到產(chǎn)物的富集?；瘜W(xué)（Chemicalcleavageofmismatch,基本原理 化學(xué)試劑，故又發(fā)展了碳化二亞胺檢測(cè)法refractory ARMS法與 法靈敏度比ARMS技 文單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single-strandconformational 32P-dNTP摻入PCR↓↓單鏈↓ ↓

2、4、5.該法簡(jiǎn)單快速，被廣泛用于未知突變的檢測(cè)。由于該法的簡(jiǎn)便快速，特別適合大樣本突變研究的 變性高效液相色譜(DenaturingHighPerformanceLiquidChromatographyDHPLC) 技術(shù)特點(diǎn)(HighResolutionMelt,原 變化從而雙鏈DNA在升溫過程中先后解開，形成不同融解曲線形狀 條件突變檢測(cè)靈敏HRM DNA甲基化檢在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，DNA甲基化主要發(fā)生在CpG二核苷胞嘧啶的第五位碳原子上，這樣的胞嘧啶也叫做5胞嘧啶，如圖所，胚胎及維DNA亞硫酸鹽相關(guān)方法缺點(diǎn)CGGC將相對(duì)而言，Southern方法較復(fù)雜存在著酶不完全消化引起的假陽(yáng)性的問題不適用于混合亞硫鹽甲基化的胞嘧啶則不受影響。這樣DNA包含的甲基化信息就可轉(zhuǎn)化為序列亞硫酸氫 法（Bisulfitesequencing 處理的序列比較,判斷CpG位點(diǎn)是否 JiangM,etal.Rapid ficationofDNAmethylationbymeasuringrelativepeakheightsindirectbisulfite-pcrsequencingtraces.LabInvest2010;90(2):282-90.甲基化特異性的PCR（Methylation-specific MSPCR是一種快速檢測(cè)方法，只需要及少量DNA樣本。MSPCR方法是以引物中所有CpG位點(diǎn)胞嘧啶均甲基片段難擴(kuò)增，或特異性差等問題，整個(gè)CpG島軟件主要作用是輔助設(shè)計(jì)出具有甲基化(methylation)或硫化(bisulphite)的特殊聚合酶鏈鎖反應(yīng)的引物(primers)。在進(jìn)行DNA甲 目前這套專利權(quán)仍屬于 結(jié)合亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法（combined 甲基化敏感性單鏈構(gòu)象分析sistrand ysis，MS- 被分離開，隨后行單鏈構(gòu)象多性分 組整體水平的甲基化檢甲基 分析針對(duì)所有的CpG島設(shè)計(jì)探序列制作 ，甲基 Infinium探針設(shè)

原理（探針設(shè)計(jì)型磁珠、U型磁珠。M型磁珠尾部為U型磁珠尾部為A，用來(lái)檢測(cè)未甲基化位點(diǎn)。G仍為G，與MMG變?yōu)镚，與U型磁珠配對(duì)，延伸后U型磁珠發(fā)光。Infinium針只使用一種磁珠，探針末端為C。配對(duì)后只摻入單個(gè)堿基（ddNTP-BioT，ddNTP-DNP）。根據(jù)熒光類型判斷摻入的堿基類型，第一部 組DNA的提完全可 條件成熟 2：RNA酶必須要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在市售RNA酶后進(jìn)行再處理，配制成10mg/ml。否則可能的是不僅沒有RNA，連DNA也被消化 第二部分亞硫酸氫鈉修 2：加5.5ul新鮮配制的3M342℃水浴4：10mM對(duì)苯二酚（氫醌）