ICS65.020.30CCSB44ICS65.020.30CCSB44廣 東 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB44/T2339—2021實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原抗體液相芯片法定性分析LaboratoryanimalsQualitativeanalysisofpathogenantibodieswithsuspensionarraymethod20212021101820220118廣東省市場監(jiān)督管理局發(fā)布目 次前言 II112范引文件 13語定義 14略語 1526要備材料 2728495附錄A（料）抗的制備 7前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。（GD/TC93）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原抗體液相芯片法定性分析范圍本文件規(guī)定了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原抗體的液相芯片定性分析方法。本文件適用于基于液相芯片方法的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原抗體的定性分析。（GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T19495.2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求下列術(shù)語和定義適用于本文件。液相芯片技術(shù)suspensionarraytechnologyxMAP100多重免疫熒光抗體檢測MFIA在xMAP縮略語BSA牛血清白蛋白（bovineserumalbumin）CPE細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathiceffect）EDC碳酰二亞胺（ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimidehydrochloride）ELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzymelinkedimmunosorbentassay）MFI中位熒光強(qiáng)度值（medianfluorescenceintensity）MFIA多重免疫熒光試驗(yàn)（multiplexedfluorometricimmunoassay）PBS磷酸鹽緩沖液（phosphatebufferedsaline）SA-PE（streptavidin-R-phycoerythrin）SPF無特定病原體（specificpathogenfree）Sulfo-NHS硫代琥珀酰亞胺（N-hydroxysulfosuccinimidesodiumsalt）xMAP多分子分析技術(shù)（flexiblemulti-analyteprofilingtechnology）原理xMAP5.6μM100孔內(nèi)可以同時(shí)完成多達(dá)100種的不同反應(yīng)。最后,微球隨液流排成單列傳送至液相芯片檢測儀進(jìn)行自動(dòng)635nm/10mW（）；532nm/13mW（YAC）Alexa532、Cy3等）（）6主要設(shè)備和材料6主要設(shè)備和材料液相芯片檢測儀。（4℃）。（-80℃）。離心管磁力架。96孔板磁力架。96孔板水平振蕩器。超聲波清洗器。96蛋白低吸附離心管（1.5mL）。微量移液器：0.1μL～2μL，1μL～10μL，10μL～100μL，100μL～1000μL。7試劑抗原7.1.1天然抗原A～見AA.2）80二抗二抗應(yīng)選用以下兩種之一：IgGIgGSA-PE鏈霉親和素-藻紅蛋白SA-PE。表面帶有羧基的特定編碼熒光微球MagPlexMicrospheres。硫代琥珀酰亞胺（Sulfo-NHS）；碳酰二亞胺（EDC）；激活緩沖液（Activationbuffer）：0.1MNaH2PO4，pH6.2；偶聯(lián)緩沖液（Couplingbuffer）：50mMMES，pH5.0；儲(chǔ)存緩沖液（PBS–TBNbuffer）：PBS，0.1%BSA，0.02%Tween-20，0.05%Sodiumazid。xMAP磷酸鹽緩沖液（PBS）：138mMNaCl，2.7mMKCl，pH7.4；反應(yīng)液/洗液（Assay/Washbuffer）：PBS，1%BSA，pH7.4。對(duì)照血清7.7.1陽性血清用特異抗原免疫SPF小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠或普通級(jí)兔、犬、猴所獲得的抗血清；或自然感染恢復(fù)后的犬、猴血清。7.7.2陰性血清SPF小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠血清；或確認(rèn)無相應(yīng)病原感染的兔、犬、猴血清。GB/T6682的要求。8方法0.1mL～0.54000g5min，20s5.0×1061.5mLmin12000g3min100μL40khz20smin12000gmin80μL20s10μL50mg/mL（Sulfo-NHS）10μL50mg/mL（EDC）20minmin12000g3min250μL20smin12000g3min8.2.10、8.2.11100μL20s500μL20shmin12000g3min500μLPBS-TBN20s30minmin12000g3min1000μLPBS-TBN，20s8.3.78.3.8250μL～1000μL20sPBS10104（mL）2℃～8xMAP5040khz20s，使磁珠2500/xMAPPBS-1%BSA503040khz3050μL50μL400r/m60min9696min100μLPBS-1BSA96min8.4.9100μLPEμg/μL～4μg/μL400r/m60min8.3.9SA-PE：PBS-1%BSASA-PE10μg/mL～12μg/mL100μL（PE）400r/min30min。8.3.9100μLPBS-1BSA，400r/min2minSA-PE30min75μL5060s9結(jié)果35MFI500MFI閾值(Cutoff選取至少100份陰性動(dòng)物血清（每個(gè)樣品平行重復(fù)2次），分別讀取MFI值并計(jì)算其平均值和標(biāo)準(zhǔn)差（standarddeviation，SD）。根據(jù)Cutoff值公式：陰性樣本平均MFI值±3SD，確定為該項(xiàng)目檢測判定閾值（cutoff值）。MFI值-正常抗MFICutoffMFI值-正?？筂FICutoff附錄A（資料性）抗原的制備A.1，A.2表A.1天然抗原的制備病毒細(xì)胞、雞胚收獲時(shí)間（day）細(xì)胞病變漢坦病毒（HV）E610～14—淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒（LCMV）Vero7～10+++～++++鼠痘病毒（ECT）BHK21，Vero2～3++～+++小鼠肝炎病毒（MHV）DBT，L9292～4+++～++++仙臺(tái)病毒（SV）雞胚3+++～++++呼腸孤病毒III型（REO3）BSC-1，BHK214～5++++小鼠肺炎病毒（PVM）BHK2110～14++～+++小鼠腦脊髓炎病毒（TMEV）BHK215～6++++小鼠細(xì)小病毒MVM株（MVM）ME，3T37～10++++小鼠腺病毒（MAD）MK，ME，3T33～5++++多瘤病毒（POLY）ME，3T310～14+++～++++大鼠細(xì)小病毒KRV株（KRV）RE7～12+++～++++大鼠細(xì)小病毒H1株（H1）RE7～12+++～++++大鼠冠狀病毒（RCV）DBT，L9292～3+++～++++兔輪狀病毒（RRV）BHK216～7+++～++++犬細(xì)小病毒（CPV）FK813～5+++～++++犬病毒性肝炎病毒（ICHV）MDCK3～4+++～++++犬瘟熱病毒（CDV）Vero8～10+++～++++猴逆轉(zhuǎn)錄病毒（SRV）Raji10～14細(xì)胞融合猴免疫缺陷病毒（SIV）CM-17410～14細(xì)胞融合注：MK-小鼠腎細(xì)胞；ME-小鼠胚細(xì)胞；RE-大鼠胚細(xì)胞。表A.2重組抗原的制備檢測項(xiàng)目表達(dá)蛋白表達(dá)系統(tǒng)漢坦病毒（HV）NP大腸桿菌/昆蟲桿狀病毒淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒（LCMV）NP大腸桿菌/昆蟲桿狀病毒仙臺(tái)病毒（SV）NP,F大腸桿菌/昆蟲桿狀病毒小鼠肺炎病毒（PVM）NP,G大腸桿菌/昆蟲桿狀病毒小鼠細(xì)小病毒MVM株（MVM）NS,VP2大腸桿菌/昆蟲桿狀病毒小鼠細(xì)小病毒MPV株（MPV）VP2大腸桿菌/昆蟲桿狀病毒大鼠細(xì)小病毒KRV株（KRV）VP2大腸桿菌/昆蟲桿狀病毒大鼠細(xì)小病毒H1株（H1）VP2大腸桿菌/昆蟲桿狀病毒大鼠細(xì)小病毒RPV株（RPV）VP2大腸桿菌/昆蟲桿狀病毒/合成肽段大鼠細(xì)小病毒RMV株（RMV）VP2大腸桿菌/昆蟲桿狀病毒/合成肽段小鼠流行性腹瀉病毒（EDIM）VP6大腸桿菌/昆蟲桿狀病毒鼠痘病毒（ECT）B5R大腸桿菌/昆蟲桿狀病毒小鼠腺病毒（MAD）VP1大腸桿菌/昆蟲桿狀病毒多瘤病毒（POLY）VP1大腸桿菌/昆蟲桿狀病毒呼腸孤病毒III型（REO3）S1大腸桿菌/昆蟲桿狀病毒小鼠肝炎病毒（MHV）N大腸桿菌/昆蟲桿狀病毒小鼠腦脊髓炎病毒（TMEV）VP1大腸桿菌/昆蟲桿狀病毒小鼠諾如病毒（MNV）VP1大腸桿菌/昆蟲桿狀病毒小鼠巨細(xì)胞病毒（MCMV）gH大腸桿菌/昆蟲桿狀病毒猴免疫缺陷病毒（SIV）P27大腸桿菌/昆蟲桿狀病毒猴T淋巴細(xì)胞白血病病毒（STLV）Gag