1、PAGE 3PAGE 263 實驗十二 兔肌肌酸激酶的分離純化及部分性質(zhì)的測定一、實驗原理 肌酸激酶 Creatine Kinase（CK）通常存在于動物的心臟、肌肉以及腦等組織的細(xì)胞漿和線粒體中，是一個與細(xì)胞內(nèi)能量運(yùn)轉(zhuǎn)、肌肉收縮、ATP再生有直接關(guān)系的重要激酶，它可逆地催化肌酸與ATP之間的轉(zhuǎn)磷酰基反應(yīng)： 肌酸激酶有四種同工酶形式：即肌肉型（）、腦型(BB)、雜化型(MB)和線粒體型(MiMi)。MM型主要存在于各種肌肉細(xì)胞中，BB型主要存在于腦細(xì)胞中，MB型主要存在于心肌細(xì)胞中，上述3種肌酸激酶為胞漿肌酸激酶，而MiMi型存在于線粒體內(nèi)膜上。 細(xì)胞在線粒體上發(fā)生氧化磷酸化，產(chǎn)生ATP。但動

2、物體內(nèi)貯存能量的高能物質(zhì)不是ATP而是磷酸肌酸。能量貯存和運(yùn)送是通過磷酸肌酸穿梭機(jī)制(Creatine Phosphaate Shuttle)來完成的，這個機(jī)制包含了肌酸激酶的線粒體型和肌肉型兩種同工酶。氧化磷酸化產(chǎn)生的ATP在ATP-ADP轉(zhuǎn)位酶(Translocase)的幫助下被直接送到位于線粒體內(nèi)膜外側(cè)的線粒體型肌酸激酶所在部位，線粒體型肌酸激酶將ATP內(nèi)的高能磷酸鍵轉(zhuǎn)移到肌酸上，變成ADP和高能物質(zhì)磷酸肌酸。磷酸肌酸在胞內(nèi)擴(kuò)散到達(dá)肌原纖維(Myofibrils)，肌原纖維的M-區(qū)帶上結(jié)合有肌肉型肌酸激酶，當(dāng)肌肉收縮時，需要大量的ATP供給能量，肌肉型肌酸激酶催化磷酸肌酸轉(zhuǎn)化為ATP，而

3、反應(yīng)產(chǎn)生的肌酸再擴(kuò)散回線粒體，重新磷酸化。 肌酸激酶同工酶在臨床診斷中有十分重要的意義，在各種病變包括肌肉萎縮和心肌梗塞時，人的血清中肌酸激酶水平迅速提高，目前認(rèn)為在心肌梗塞的診斷中，測定肌酸激酶的活性比作心電圖更為可靠。鑒于這個酶具有重要的生理功能和臨床應(yīng)用價值，因而引起人們廣泛的重視和深入的研究。 肌肉型肌酸激酶分子是有兩個相同的亞基組成的二聚體。根據(jù)目前已經(jīng)測定的兔、人、雞、鼠肌酸激酶的一級結(jié)構(gòu)，M型亞基由387個氨基酸殘基組成，分子量為43000左右，分子內(nèi)有8個巰基，但無二硫鍵。天然的肌酸激酶分子是一個緊密的球狀結(jié)構(gòu)。根據(jù)旋光色散研究的結(jié)果，這個酶的亞基大約有25-30的-螺旋，15

4、 左右的-折疊。 肌酸激酶是由兩個亞基組成的寡聚酶，該酶在催化過程中，最小功能單位是亞基還是二聚體，一直是有很大爭議的問題。我系生化與分子生物學(xué)教研室的王希成教授等用化學(xué)修飾和分子雜交的方法證明了肌酸激酶的兩個亞基分別在二聚體中獨立地起催化作用，即最小功能單位是亞基。 肌酸激酶的純化方法有許多種，本實驗采用的提純方法為改進(jìn)的Kuby 法。該酶的測活方法也有許多種，本實驗采用的是pH-比色法。 肌酸激酶的測活方法（pH-比色法）如下： 肌酸激酶在催化正向反應(yīng)時，隨著ATP向肌酸上轉(zhuǎn)移磷酰基的同時，生成等摩爾的H+，其最適pH為7.59.0，是一個寬闊的平臺狀，在此范圍內(nèi)測定H+ 的生成速度，可以

5、作為酶活力的指標(biāo)。本實驗采用百里酚藍(lán)作為pH指示劑，在分光光度計上通過pH-比色法測定肌酸激酶的活性，在597nm波長下，監(jiān)測吸光度的變化。在比色皿中酶催化反應(yīng)生成的H+使溶液的pH值降低，底物溶液的顏色逐漸由深紫紅色變?yōu)辄S綠色，吸光度值A(chǔ)597不斷降低。肌酸激酶測活的底物溶液通?？膳渲?0ml，當(dāng)天使用。配制方法為：取10ml 48mmol/L的肌酸溶液，加入1.0ml 0.1mol/L的MgAC2，2.0ml 0.1的百里酚藍(lán)(稱100mg百里酚藍(lán)，加20ml乙醇溶解后再加水60ml)，1.0ml 0.1mol/L pH9.0的Gly-NaOH 緩沖液，稱48mg ATP溶于此溶液，再補(bǔ)加

6、水5.0ml，用0.10.2mol/L NaOH 仔細(xì)調(diào)此溶液的顏色為深紫紅色（吸光度為1.82.0）即可。測活時，取1.0ml的底物溶液置于微量比色皿中，加入10l 酶溶液，迅速蓋蓋，混勻后立即監(jiān)測597nm 處光吸收的變化，每15 秒或30 秒讀一次吸光度值(A597 )，共讀取56個數(shù)據(jù)點，用A597 對時間作圖，從圖中求出每min吸光度值的變化，即A597，按下式計算酶的比活力（U）： mol(minmg) 其中：1.3 為吸光度的變化換算成H+的系數(shù)。VA =1.0ml (底物溶液)，VB =0.01ml (加入的酶溶液)。C為加入酶溶液的濃度。酶溶液濃度C的測定按其在280nm 處

7、的吸光度值來確定，其百分吸光系數(shù)為 E11cm=8.8。 二、實驗步驟 1. 兔肌肌酸激酶的分離純化方法如下： 將兔子頸動脈放血殺死后剝皮，取50g大腿肌或背肌，去除結(jié)締組織和神經(jīng)后剪碎，加150ml 0.01mol/L KCl，用組織打碎機(jī)(或食品加工機(jī))和高速分散器各粉碎3次以上，每次不超過30 s 。冰浴攪拌提取1530min，用8000r/min ， 0， 離心10min，棄去沉淀，測上清體積為V1，取樣0.5ml后，將其余上清加入研細(xì)的NH4Cl至濃度為0.1mol/L，用5mol/L NH4OH調(diào)pH至9.0，冰浴攪拌30min，加入1.5倍V1體積的95冷乙醇，20攪拌2.5h，

8、8， 8000r/min 離心 10min，棄沉淀，測上清體積為V2，取樣0.5ml后加入VA ml的2 mol/L MgSO4(pH=8.5)至終濃度為0.03mol/L，并補(bǔ)加1.5 VA體積的95冷乙醇，攪拌30min ，8，8000r/min 離心 10min，棄去上清，沉淀加1/10 V1體積的MgAC2 (0.07mol/L，pH=9.0)溶解懸浮(可置冰箱過夜)，冰浴攪拌1h后，0，12000r/min 離心 10 min，棄去沉淀，測上清體積為V3，取樣0.5ml后用0.51mol/L NaOH 調(diào)pH=8.0，置冰鹽浴內(nèi)緩慢加入VB 體積的95的冷乙醇至終濃度為36。 VB的

9、計算式為： 攪拌30min后，8，12000r/min 離心 10 min，棄去沉淀，測上清體積為V4，取樣0.5ml，置冰鹽浴內(nèi)緩慢加入VC 體積的95的冷乙醇至終濃度為50。 VC的計算式為： 攪拌30min后，8，12000r/min 離心 10 min，棄上清，沉淀溶于23ml pH 9.0 0.05mol/L 的檸檬酸銨溶液，即為V5，取樣0.2ml，并對此緩沖液透析過夜，再對1.7mmol/L的NH4OH透析，0， 12000r/min 離心 10 min，棄去沉淀，測上清體積為V6，取樣0.5ml，其余的V6溶液用此NH4OH透析液調(diào)蛋白的質(zhì)量濃度為5g/L后上樣至DEAE-32

10、離子交換層析柱，用0.01mol/L pH 8.0的Tris-HCl平衡緩沖液洗至基線平，用凸形梯度洗脫法洗脫兔肌肌酸激酶，收集活性峰，合并得到V7樣品，取樣0.5ml，其余冰凍干燥得到最終的兔肌肌酸激酶樣品。取樣做SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，測亞基分子量，并檢測其是否達(dá)到電泳一條帶的純度，再取樣用凝膠層析測該酶的分子量。 酶分離純化過程實驗記錄表格的各個項目為：實驗步驟、溶液體積( ml)、 蛋白的質(zhì)量濃度(g/L) 、 總蛋白量(mg)、比活力mol(minmg)、總活力(mol/min)、純化倍數(shù)和回收率。 離子交換柱層析的方法是：取約10mL 濕的DE-32陰離子交換纖維素，抽干后在0

11、.5mol/L NaCl-NaOH溶液中浸泡30min ，水洗至中性，在0.5mol/L HCl 中浸泡30min，水洗至中性，在0.5mol/L NaOH 中浸泡30min，水洗至中性抽干，用0.01mol/L pH8.0 Tris-HCl 平衡緩沖液浸泡過夜。凸形梯度洗脫液體系為：C1（混合瓶）：0.01 mol/L pH8.0 Tris-HCl ，50mL，（此瓶塞不可漏氣）；C2（貯液瓶）：0.04mol/L pH8.0 Tris-HCl ，150mL。洗脫速度：0.20.3ml/min，收集體積：23ml/管。要從上樣開始收集，洗脫完畢，逐管測定A280，選擇A280 較大的管測活，

12、繪制洗脫圖。凸形梯度洗脫用在此處的優(yōu)點是在前幾十管分離雜蛋白時，鹽梯度增長很快，而后幾十管洗脫兔肌肌酸激酶時，鹽梯度變化緩饅，有利于該酶與雜蛋白的分離。洗脫后還可以逐管測電導(dǎo)，畫出凸形梯度洗脫曲線，并換算出該酶洗脫下來時相應(yīng)的Tris-HCl緩沖液的鹽濃度。 2. 肌酸激酶動力學(xué)參數(shù)的測定： 表觀Km (ATP) 和Vmax的測定： 固定肌酸(Cr)的濃度，改變ATP的濃度 。 底物溶液：2.5ml 48mmol/L Cr ；0.25ml 0.1mol/L Mg+；0.5ml 0.1 百里酚藍(lán)；0.25ml 0.1mol/L Gly-NaOH pH9.0；12g/L ATP加入量見表1： 表1

13、 12g/L ATP加入量表 試管號 ATP終濃度( mol/L ) ATP加入量(ml) 1 4.0 1.0 2 2.0 0.5 3 1.0 0.25 4 0.5 0.125 5 0.4 0.100 6 0.25 0.063 對以上試液調(diào)pH至9.0，最后用水調(diào)節(jié)體積至5.0ml，分別測活。對上述數(shù)據(jù)進(jìn)行雙倒數(shù)作圖法處理，即用1/V對1/ATP作圖(V=1.3A597)，可求得表觀Km (ATP) 和Vmax。 表觀Km (Cr) 和Vmax的測定： 固定ATP濃度，改變肌酸(Cr)濃度。 底物溶液：1.0ml ATP(12g/L)；0.25ml 0.1mol/L Mg+；0.5ml 0.1

14、百里酚藍(lán)；0.25ml 0.1mol/L Gly-NaOH pH9.0；48mmol/L Cr加入量見表2： 表2 48mmol/L Cr加入量表 試管號 Cr終濃度(mol/L) Cr 加入量(ml) 1 20 2.08 2 10 1.04 3 7.5 0.78 4 5.0 0.52 5 3.3 0.344 6 2.0 0.208 對各試液調(diào)pH至9.0，最后用水調(diào)節(jié)體積至5.0ml，分別測活。對上述數(shù)據(jù)進(jìn)行雙倒數(shù)作圖法處理，即用1/V 對1/Cr作圖(V=1.3A597)，可求得表觀Km (Cr)和Vmax 。 3. DTNB修飾肌酸激酶的反應(yīng)動力學(xué)及酶表面可反應(yīng)巰基數(shù)及總巰基數(shù)的測定：

15、蛋白質(zhì)分子中的巰基與5,5-二硫雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)反應(yīng)如下： 反應(yīng)結(jié)果為每當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子中修飾掉一個-SH，就產(chǎn)生一個芳硫負(fù)離子，芳硫負(fù)離子在412nm處有光吸收，根據(jù)其摩爾吸光系數(shù)：13600 L. mol1. cm1，可以計算被修飾的巰基數(shù)。 修飾反應(yīng)動力學(xué)： 取1.0ml酶溶液(1mg/ml)置于微量比色皿中，加入10l DTNB 溶液（10mmol/L），立即監(jiān)測412nm處光吸收(A412 )隨時間變化的動力學(xué)過程。由于DTNB的濃度DTNBE酶濃度，所以修飾反應(yīng)是偽一級反應(yīng)。用(At)/( A0)對時間進(jìn)行半對數(shù)作圖，求出反應(yīng)的速度常數(shù)。 肌酸激酶表面可反應(yīng)巰基數(shù)和總巰

16、基數(shù)的測定： 用微量比色皿分別測定沒有變性劑和有變性劑存在下，酶溶液與DTNB溶液充分反應(yīng)后的A412，按下式計算反應(yīng)的巰基數(shù)，有變性劑的是總巰基數(shù)，變性劑可用SDS或脲。(文獻(xiàn)值：總巰基數(shù)= 8 ，可反應(yīng)巰基數(shù)= 2 ) 兔肌肌酸激酶(CK)的分子量= 86000 ，C為酶濃度，C= A2800.8886000 (mol/L)。三、試劑 1. KCl 0.01mol/L 200ml (0.15g KCl 溶于200ml H2O) 2. NH4OH 1.7mmol/L 1000ml (取0.12ml 濃氨水，加1000ml H2O) 3. 檸檬酸銨 0.05mol/L pH9.0 1000ml (稱12.15g 溶于1000ml H2O) 4. Tris-HCl 0.1mol/L pH8.0 1000ml (參見蔗糖酶實驗) 5. NH4Cl 研細(xì) 10g 6. NH4OH 5m