細(xì)胞工程主要技術(shù)_第1頁(yè)
細(xì)胞工程主要技術(shù)_第2頁(yè)
細(xì)胞工程主要技術(shù)_第3頁(yè)
細(xì)胞工程主要技術(shù)_第4頁(yè)
細(xì)胞工程主要技術(shù)_第5頁(yè)
已閱讀5頁(yè),還剩94頁(yè)未讀 繼續(xù)免費(fèi)閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡(jiǎn)介

1、關(guān)于細(xì)胞工程主要技術(shù)第一張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月動(dòng)物細(xì)胞工程主要技術(shù)第一章 動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)化(誘變)第二章 細(xì)胞融合技術(shù)第三章 哺乳動(dòng)物克隆技術(shù)第四章 哺乳動(dòng)物胚胎培養(yǎng)與移植利用雜交瘤制備單克隆抗體技術(shù)干細(xì)胞技術(shù)第二張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月2第一章 動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化(誘變)通過細(xì)胞培養(yǎng),世界上已建立了大量細(xì)胞株,我國(guó)業(yè)已建立了上百個(gè)細(xì)胞株,為細(xì)胞生物學(xué)和醫(yī)學(xué)做出了重大貢獻(xiàn)。正常組織的初級(jí)培養(yǎng)物,在傳代培養(yǎng)過程中,細(xì)胞的壽命有一定的限度,只有癌細(xì)胞和發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞才能無(wú)限增殖下去。所謂轉(zhuǎn)化即是指正常細(xì)胞在某種因子的作用下發(fā)生突變而成為具有癌特性的細(xì)胞。第三張,PPT

2、共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月3建立無(wú)限細(xì)胞系的關(guān)鍵就是要千方百計(jì)地使培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化,即用某種因子刺激正常細(xì)胞發(fā)生突變而具有癌特性。目前,使正常培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化的刺激因子主要有三大類:物理因子、化學(xué)因子和生物因子。第四張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月4(一)物理因子能使培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化的物理因子主要是指一些電離輻射:放射性同位素的射線:60Co、14C、131I、32P、3HX 射線紫外線照射物理致癌劑第五張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月5(二)化學(xué)因子對(duì)細(xì)胞具有轉(zhuǎn)化作用的化學(xué)因子達(dá)數(shù)千種之多,其中有無(wú)機(jī)物,也有有機(jī)物。無(wú)機(jī)物:砷、石棉、鉻化合物、鎳化合物、鎘化合物有機(jī)

3、物:苯、聯(lián)苯胺、雜環(huán)烴、煤焦油、黃曲霉素(aflatoxin)、亞硝胺、煙堿(nicotine) 化學(xué)致癌劑第六張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月6(三)生物因子對(duì)細(xì)胞具有轉(zhuǎn)化作用的生物因子為腫瘤病毒(tumor virus),又稱致癌病毒(oncogenic virus)?,F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有許多種病毒可引起動(dòng)物或植物發(fā)生腫瘤。腫瘤病毒中有DNA病毒,也有RNA病毒。 第七張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月7Rous肉瘤病毒(Rous sarcoma virus):一種RNA病毒,其基因組含有一個(gè)癌基因src,編碼產(chǎn)物為具有蛋白質(zhì)激酶活性的pp60src蛋白,可使許多蛋白質(zhì)磷酸化,通過

4、級(jí)聯(lián)反應(yīng),誘發(fā)細(xì)胞癌變。pp60src蛋白是一種膜蛋白,結(jié)合在質(zhì)膜的內(nèi)表面,它可催化磷酸根轉(zhuǎn)移到一些蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基上,使磷酸化酪氨酸在細(xì)胞中的含量提高了10倍。第八張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月8(Src蛋白, Tyr激酶)PTyr蛋白質(zhì)磷酸化細(xì)胞癌變無(wú)活性pp60srcRSV病毒中v-src基因的致癌機(jī)制圖解質(zhì)膜跨膜受體蛋白細(xì)胞外配體活性pp60src質(zhì)膜跨膜受體蛋白磷酸化酪氨酸兩種作用:一是使細(xì)胞的正常調(diào)節(jié)機(jī)制失調(diào),細(xì)胞增殖失去控制;二是使細(xì)胞的粘著性喪失,易發(fā)生擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移。 第九張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月9雖然動(dòng)物細(xì)胞在培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板中均可生長(zhǎng),但

5、在體外利用培養(yǎng)罐進(jìn)行大量培養(yǎng)就不象培養(yǎng)細(xì)菌和酵母那樣容易,是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的技術(shù)難題之一。目前這一問題已經(jīng)解決,人們?cè)谖⑸锱囵B(yǎng)用的發(fā)酵罐的基礎(chǔ)上研制出一種用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的反應(yīng)罐,用以大量培養(yǎng)懸浮細(xì)胞(1個(gè)振動(dòng)攪拌器:可以使細(xì)胞得到充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣)。轉(zhuǎn)化動(dòng)物細(xì)胞的規(guī)?;囵B(yǎng)第十張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月10細(xì)胞融合(Cell fusion)又稱為細(xì)胞雜交(Cell hybridization),現(xiàn)多統(tǒng)稱為細(xì)胞雜交,是指2個(gè)或2個(gè)以上的細(xì)胞融合成1個(gè)細(xì)胞的過程。人工的細(xì)胞融合開始于1950s,此后作為一門新興技術(shù)發(fā)展非???,應(yīng)用范圍也極為廣泛,不僅同種類細(xì)胞間可以融合,種間

6、遠(yuǎn)緣細(xì)胞也能融合。 細(xì)胞工程的發(fā)展是建立在細(xì)胞融合基礎(chǔ)上的。第二章 細(xì)胞融合技術(shù)第十一張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月11細(xì)胞融合不僅可用于生物學(xué)的基礎(chǔ)理論研究,而且在生產(chǎn)實(shí)踐上還有重要的應(yīng)用價(jià)值,如目前在單克隆抗體的制備、核質(zhì)關(guān)系、體細(xì)胞的遺傳和發(fā)育、新品種的培養(yǎng)、免疫作用、疾病的治療和性狀的改良、潛伏病毒的研究等,已取得了顯著的成績(jī)。其中最突出的就是在制備單克隆抗體方面的應(yīng)用!第十二張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月12根據(jù)所用促融劑的不同,細(xì)胞融合技術(shù)主要可分為四大類:病毒介導(dǎo)的細(xì)胞融合技術(shù)化學(xué)介導(dǎo)的細(xì)胞融合技術(shù)電擊介導(dǎo)的細(xì)胞融合技術(shù)激光介導(dǎo)的細(xì)胞融合技術(shù)第十三張,PP

7、T共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月13一、病毒介導(dǎo)的細(xì)胞融合技術(shù)促融劑:麻疹病毒、副流感病毒、新城雞瘟病毒、仙臺(tái)病毒以及其他一些副粘液科的病毒基本原理:病毒被膜中的糖蛋白含有融合蛋白(fusion protein), 既可介導(dǎo)病毒同宿主細(xì)胞融合, 又可誘導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞融合。 操作繁瑣;促融效果較好第十四張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月14融合蛋白是副粘病毒的兩種包膜糖蛋白之一,其主要功能是引起病毒包膜與靶細(xì)胞膜或被感染的靶細(xì)胞膜之間發(fā)生融合。細(xì)胞融合過程需要另一種包膜糖蛋白血凝素-神經(jīng)氨酸酶的協(xié)助。融合蛋白需要和同源性血凝素-神經(jīng)氨酸酶共同表達(dá)才能顯示出融合細(xì)胞的活性。 第十五張,PP

8、T共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月15病毒增殖紫外線滅活稀釋細(xì)胞懸液細(xì)胞融合誘導(dǎo)基本操作流程篩選第十六張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月16二、化學(xué)介導(dǎo)的細(xì)胞融合技術(shù)聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)促融劑:基本原理:一般認(rèn)為,PEG改變各類細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu),使兩細(xì)胞相互接觸部位的膜脂雙層中磷脂分子發(fā)生疏散、進(jìn)而使其結(jié)構(gòu)發(fā)生重排,再加上膜脂雙層的相互親合以及彼此間表面張力的作用,引起相臨的重排質(zhì)膜在修復(fù)時(shí)相互合并在一起, 使兩細(xì)胞的胞質(zhì)溝通, 從而造成相互接觸的細(xì)胞之間發(fā)生融合。操作簡(jiǎn)便;促融效果好第十七張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月17誘導(dǎo)基本操作流程

9、A細(xì)胞融合細(xì)胞B細(xì)胞A/B細(xì)胞混合物按一定數(shù)量比例混合與細(xì)胞混合物充分混勻一定溫度、一定時(shí)間計(jì)數(shù)篩選PEG配制:加熱溶化,按體積比加入預(yù)熱至50oC的無(wú)血清培養(yǎng)基后混勻,降溫至使用溫度待用PEG配制PEG(MW1000-4000, 4060%)第十八張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月18促融效果與PEG的分子量及其濃度成正比;但PEG分子量越大、濃度越高, 對(duì)細(xì)胞的毒性也就越大(在實(shí)驗(yàn)時(shí)常常采用的分子量10004000的PEG,濃度一般為4060%)PEG介導(dǎo)細(xì)胞融合效果的影響因素:1. PEG分子量與濃度:融合效果與溫度成正比(質(zhì)膜流動(dòng)性與溫度成正比),為獲得最佳融合效果, 在細(xì)胞可

10、能承受的溫度范圍內(nèi)可適當(dāng)提高處理的溫度(哺乳動(dòng)物細(xì)胞,一般采用3840)2. PEG的pH值:pH8.08.2:融合效果較好3. PEG作用時(shí)間:處理時(shí)間越長(zhǎng),融合效果越好, 但對(duì)細(xì)胞的毒害也就越大(一般將處理時(shí)間限制在1min之內(nèi))4. 融合溫度:第十九張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月19三、電擊介導(dǎo)的細(xì)胞融合技術(shù)操作簡(jiǎn)便、快速/促融效果好/高回收率/對(duì)細(xì)胞毒性小原理:游離動(dòng)物細(xì)胞或去壁原生質(zhì)體,在電融合室中,在高頻交流電場(chǎng)的作用下,細(xì)胞被極化成偶極子,造成細(xì)胞間相互連接成點(diǎn)接觸狀態(tài);然后施加方波脈沖予以刺激,由于電脈沖的瞬間作用,可擊破兩細(xì)胞接觸點(diǎn)處的質(zhì)膜,此時(shí)質(zhì)膜的脂類分子發(fā)生

11、重組,同時(shí)由于細(xì)胞表面的張力作用,兩個(gè)點(diǎn)接觸細(xì)胞逐步發(fā)生細(xì)胞融合。BioRad電融合儀第二十張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月20動(dòng)物細(xì)胞0.6M甘露醇,0.5mM CaC12 2H2080-300V/ cm,0.5-1兆赫茲,30-90秒0.5-1.5KV/cm, 幅度脈寬25微秒融合細(xì)胞誘導(dǎo)基本操作流程篩選電擊液懸浮于融合小室的電極間加入至細(xì)胞排列成串電泳效應(yīng)正弦交變電場(chǎng)施加2-3個(gè)脈沖電場(chǎng)施加第二十一張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月21原理:貼在一起的兩個(gè)細(xì)胞,用高峰值功率密度激光對(duì)細(xì)胞接觸處的質(zhì)膜進(jìn)行輻照,質(zhì)膜發(fā)生光擊穿,可產(chǎn)生微米量級(jí)的微孔,因質(zhì)膜上的微孔可逆,質(zhì)膜

12、分子在重組過程中借助細(xì)胞連接處小孔的很高的表面曲率而處于高張力狀態(tài),導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生融合。四、激光細(xì)胞融合技術(shù)第二十二張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月22激光細(xì)胞融合法與其它化學(xué)物理方法相比較具有許多優(yōu)點(diǎn):(1)能選擇任意兩個(gè)細(xì)胞之間進(jìn)行融合;(2)因僅在兩個(gè)細(xì)胞的接觸點(diǎn)照射激光,故作用于細(xì)胞的應(yīng)力和障礙小;(3)可進(jìn)行非接觸、安全且遠(yuǎn)距離的無(wú)菌操作;(4)能適時(shí)觀察融合過程。第二十三張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月23第三章 哺乳動(dòng)物克隆技術(shù)(細(xì)胞核移植技術(shù)) 第二十四張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月24隨著1997年2月Nature雜志報(bào)道英國(guó)Roslin研究所I

13、.Wilmut等人創(chuàng)造的克隆羊多莉(Dolly)誕生,生物工程掀開了新的一頁(yè)??寺?clone)一詞原意為無(wú)性繁殖系,在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中早有使用,細(xì)胞克隆是指由一個(gè)細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞分裂而產(chǎn)生出的一群細(xì)胞,而動(dòng)物克隆是指由一個(gè)動(dòng)物經(jīng)無(wú)性繁殖而產(chǎn)生的遺傳性狀完全相同的后代個(gè)體。第二十五張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月25克隆羊“多莉”誕生后,克隆技術(shù)研究立即成為世界各國(guó)生物學(xué)家競(jìng)相開展的生物學(xué)高新技術(shù)研究??寺〖夹g(shù)之所以一經(jīng)產(chǎn)生立即引起高度重視,是因?yàn)榭寺〖夹g(shù)不但具有重要的理論意義而且具有良好的應(yīng)用前景。 第二十六張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月26為什么要進(jìn)行動(dòng)物克隆?例:1997

14、年,美國(guó)威斯康星州的一個(gè)奶牛場(chǎng)有一頭叫盧辛達(dá)的奶牛,年產(chǎn)牛奶30.8 t,創(chuàng)造了世界奶牛產(chǎn)奶量最高的紀(jì)錄;而一頭普通奶牛的產(chǎn)奶量年平均水平僅為3-4 t,如果能用體細(xì)胞核移植技術(shù),克隆高產(chǎn)奶牛,就可以大大提高牛奶產(chǎn)量。第二十七張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月第二十八張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月第一節(jié) 哺乳動(dòng)物克隆的發(fā)展歷史同種胚胎細(xì)胞克隆同種體細(xì)胞克隆異種體細(xì)胞克隆克隆動(dòng)物技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)歷了60余年的漫長(zhǎng)探索,根據(jù)供體細(xì)胞核與去核卵細(xì)胞的來源可歸納為3個(gè)標(biāo)志性的發(fā)展階段。第二十九張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月291938年, 德國(guó)科學(xué)家Spemann最早提出

15、克隆設(shè)想。1952年, 美國(guó)科學(xué)家Briggs和King將發(fā)育后期的青蛙胚胎細(xì)胞核植入青蛙卵中, 沒有發(fā)育。1965年, 中國(guó)科學(xué)家童第周完成了金魚核移植并獲得成功。1981年, Illmensee和Hoppe用小鼠胚胎細(xì)胞第一次獲得了克隆小鼠,但其實(shí)驗(yàn)未能被重復(fù)。1984年, 丹麥科學(xué)家Willadsen用胚胎細(xì)胞克隆羊獲成功。第一階段 同種胚胎細(xì)胞克隆第三十張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月30童第周(1902-1979)童第周等(1965)將金魚囊胚細(xì)胞核移植到鳑鮍的去核卵中, 獲得了少數(shù)核質(zhì)雜種(nucleo-cytoplasmic hybrid, NCH)幼魚第三十一張,PP

16、T共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月1990年,中國(guó)科學(xué)院發(fā)育生物學(xué)研究所杜淼獲得了克隆兔。 隨后,中國(guó)科學(xué)家利用胚胎細(xì)胞相繼克隆成了羊、豬、牛、小鼠等幾種動(dòng)物。1993年,美國(guó)的First用牛內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞成功地獲得了克隆牛。1997年,中國(guó)學(xué)者孟勵(lì)在美國(guó)成功獲得克隆猴。 至此,國(guó)內(nèi)外動(dòng)物克隆采用的均為胚胎細(xì)胞。第三十二張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月321997年,用胚胎細(xì)胞獲得的克隆猴第三十三張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月331964年, Gurdon以爪蟾為材料, 最早進(jìn)行了體細(xì)胞核移植的嘗試, 獲得了1.5的蝌蚪。第二階段 同種體細(xì)胞克隆第三十四張,PPT共九十九頁(yè)

17、,創(chuàng)作于2022年6月34Dolly 的產(chǎn)生1997年,英國(guó)羅斯林研究所I. Wilmut等宣布用成年羊乳腺細(xì)胞首次獲得克隆羊“多莉”。第三十五張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月35實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵:血清饑餓法 使細(xì)胞核與去核卵細(xì)胞處于細(xì)胞周期的同步狀態(tài),以利于恢復(fù)核的全能性(重編程).第三十六張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月第三十七張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月1998年,美國(guó)夏威夷大學(xué)的Yanagimachi等用克隆鼠的卵丘細(xì)胞核作供體,獲得了克隆再克隆小鼠。1998年,新西蘭成功地克隆了奶牛,并克隆了世界上僅存的最后一頭珍稀牛。至此,同種體細(xì)胞克隆進(jìn)入成熟階段

18、。第三十八張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月38克隆??寺~J猴克隆狗第三十九張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月392002年初,我國(guó)首批成年體細(xì)胞克隆牛的群體誕生第四十張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月40第三階段 異種體細(xì)胞克隆 瀕危物種數(shù)量日益減少,很難提供用于克隆的卵母細(xì)胞和代孕受體,促使科學(xué)家提出了異種克隆的設(shè)想:將一種動(dòng)物的體細(xì)胞核移植到另一種動(dòng)物的去核(遺傳物質(zhì))卵母細(xì)胞中,來得以實(shí)現(xiàn)克隆的技術(shù)。但此階段技術(shù)還處在實(shí)驗(yàn)探究階段,尚未完全成熟。第四十一張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月411998年1月,美國(guó)威斯康星大學(xué)的科學(xué)家們以牛的卵細(xì)胞為受體,成

19、功克隆出豬、牛、羊、鼠和獼猴五種哺乳動(dòng)物的胚胎。1998年1999年,美國(guó)人White用珍稀動(dòng)物盤羊的體細(xì)胞核與牛卵結(jié)合,我國(guó)學(xué)者陳大元將大熊貓?bào)w細(xì)胞核與兔卵結(jié)合,均成功克隆出早期胚胎。第四十二張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月422000年,歐洲盤羊-奧姆布雷塔被成功克隆,科學(xué)家是為了營(yíng)救目前世界上數(shù)目稀少的歐洲盤羊,避免它們從地球上滅絕消失。 第四十三張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月432003年5月,世界上第一只克隆騾子-格姆在美國(guó)誕生第四十四張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月442005年8月24日,中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所陳大元教授領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊(duì),國(guó)際首例體細(xì)胞克隆

20、亞洲黃羊在山東順利降生(用山羊做受體)。第四十五張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月45第二節(jié) 哺乳動(dòng)物克隆的技術(shù)方法克隆動(dòng)物主要方法:胚胎分割胚胎細(xì)胞核移植體細(xì)胞核移植連續(xù)細(xì)胞核移植第四十六張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月46優(yōu)質(zhì)動(dòng)物體細(xì)胞的來源動(dòng)物卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)重構(gòu)胚胚胎移植克隆動(dòng)物檢測(cè)體細(xì)胞核移植法克隆動(dòng)物的基本操作流程卵母細(xì)胞核體細(xì)胞核核移植體外培養(yǎng)第四十七張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月471、動(dòng)物體細(xì)胞的體外培養(yǎng)G0期(細(xì)胞周期時(shí)相)常規(guī)體外培養(yǎng)降低血清使用量細(xì)胞分裂停止移核前第四十八張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月48卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體 (

21、COC)用M199洗3次100l成熟培養(yǎng)液成熟培養(yǎng)液: M199 +10% FCS +10 g/mL PMSG +10 g/mL HCG5%CO2,38.5,飽和濕度24 h 或 2830 h觀察卵丘擴(kuò)展情況例: 小牛卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)2、卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)第四十九張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月49盲吸法熒光法擠壓法吸引法蔗糖法3、去核方法第五十張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月50帶下注射直接胞質(zhì)內(nèi)注射法4、核注射方法透明帶應(yīng)用壓電-脈沖設(shè)備直接注射法第五十一張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月51常規(guī)法原核互換兩步法孤雌活化協(xié)同法化學(xué)誘導(dǎo)法5、核移植方法第五十二張

22、,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月52將數(shù)枚重構(gòu)胚放入100L的胚胎培養(yǎng)液(CR1-aa)中培養(yǎng)48h后,選擇4細(xì)胞以上的胚胎移入鋪滿滋養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)液滴中。在120h半換液,148h加入1mg/mL的葡萄糖。以后每隔48h半換液。6、重構(gòu)胚胎的體外培養(yǎng)小鼠胎兒成纖維細(xì)胞第五十三張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月537、胚胎移植方法假孕的同步發(fā)情的寄母輸卵管內(nèi)移植(移植12細(xì)胞的受精卵)子宮角移植(移植桑椹胚)第五十四張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月54體細(xì)胞核卵母細(xì)胞重構(gòu)胚移入同步發(fā)情的動(dòng)物輸卵管或子宮內(nèi)體細(xì)胞克隆動(dòng)物研究路線圖體外培養(yǎng)去核胚胎移植移核第五十五張,PP

23、T共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月558、克隆動(dòng)物的檢測(cè)方法微衛(wèi)星圖譜法同工酶法第五十六張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月56克隆牛“動(dòng)動(dòng)”的微衛(wèi)星檢測(cè)結(jié)果(紅色代表標(biāo)準(zhǔn)分子量,藍(lán)色和綠色代表擴(kuò)增片段)第五十七張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月57受胎率低(26.2%)流產(chǎn)率高 (53.8%)克隆動(dòng)物的存活率低(35.7%)常出現(xiàn)早衰現(xiàn)象存 在 問 題第五十八張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月58第三節(jié) 克隆動(dòng)物的衰老問題克隆羊“多莉”出現(xiàn)了早衰現(xiàn)象,其端粒長(zhǎng)度比正常出生的羊短了20%,這與供核羊Finn Dorset的6歲年齡直接相關(guān)。人類染色體端粒的熒光免疫原位雜交

24、照片第五十九張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月591999年,美籍華人楊向中教授第一個(gè)報(bào)道了克隆動(dòng)物具有正常長(zhǎng)度的端粒和遺傳年齡,得出克隆動(dòng)物不會(huì)未老先衰、克隆動(dòng)物的遺傳年齡與供體動(dòng)物年齡無(wú)關(guān)的結(jié)論。此后,這一結(jié)論被美國(guó)麻省的ATC公司在克隆牛和美國(guó)洛克菲勒大學(xué)在克隆鼠的實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。第六十張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月60總之,由于細(xì)胞衰老的分子機(jī)理至今仍未能研究清楚,因此有關(guān)克隆動(dòng)物的衰老問題,目前仍在爭(zhēng)論中,還需要進(jìn)一步的研究來證實(shí)。端粒酶結(jié)構(gòu)的模式圖解第六十一張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月61第四節(jié) 克隆動(dòng)物的應(yīng)用前景克隆動(dòng)物在畜牧業(yè)和醫(yī)學(xué)方面具有極為

25、重要的意義,這不僅表現(xiàn)在理論研究方面,更重要的是其在應(yīng)用開發(fā)方面的實(shí)用價(jià)值。第六十二張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月621. 克隆技術(shù)能快速培育出大量的優(yōu)良品種家畜,而用傳統(tǒng)的有性生殖方式培育動(dòng)物良種不但需要花費(fèi)很長(zhǎng)的時(shí)間,而且優(yōu)良性狀難以在后代得到控制??寺?dòng)物在畜牧業(yè)和醫(yī)學(xué)方面的意義體現(xiàn)在:2. 克隆動(dòng)物的遺傳背景完全一致,因而可以避免動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的背景干擾,如用在藥物檢測(cè)上,所得結(jié)果將更加穩(wěn)定可靠。第六十三張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月633. 動(dòng)物克隆技術(shù)可以用來保護(hù)瀕危動(dòng)物,用瀕危動(dòng)物的冷凍細(xì)胞隨時(shí)可以克隆出新的成體動(dòng)物,而無(wú)須耗費(fèi)大量的人力物力。第六十四張,PPT

26、共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月644. 克隆動(dòng)物可為需要組織器官移植的病人提供所需要的組織器官。國(guó)外已經(jīng)開始了這方面的研究,例如科羅拉多大學(xué)的研究者用來源于克隆牛胎兒的多巴胺生成細(xì)胞,治療帕金森氏病模型大鼠,已取得一定效果。第六十五張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月65治療性克隆示意圖第六十六張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月665、動(dòng)物克隆技術(shù) 如果與 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù) 結(jié)合起來將具有更大的發(fā)展?jié)摿Α^D(zhuǎn)基因動(dòng)物克隆技術(shù)有性繁殖方式需要幾代才能獲得穩(wěn)定表達(dá)外源基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,而通過轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物的方式,很快便可獲得新的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,從而提高轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)效率。 第六十七張,P

27、PT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月67中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)的科學(xué)家正在利用轉(zhuǎn)基因奶牛生產(chǎn)人類母乳,并希望三年內(nèi)在超市中銷售。 第六十八張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月682011年8月,荷蘭研究人員對(duì)山羊進(jìn)行轉(zhuǎn)基因改造,讓羊奶含有與蜘蛛絲一樣的蛋白質(zhì)。利用這種羊奶織成的織物強(qiáng)度是鋼鐵的10倍,制造防彈皮膚。 第六十九張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月69治療性克隆 動(dòng)物模型器官移植瀕危動(dòng)物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器基礎(chǔ)研究遺傳育種 克隆第七十張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月70討 論克隆人什么時(shí)候出現(xiàn)?克隆人有沒有必要? ?第七十一張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月

28、71 一位美國(guó)專家說過,無(wú)論你相信還是懷疑,無(wú)論你支持還是反對(duì),“克隆人的潘多拉盒子將被打開”,從那個(gè)盒子里跑出來的是驚喜也好,是噩耗也好,人類都只能接受而無(wú)法阻止。 第七十二張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月72第四章哺乳動(dòng)物胚胎培養(yǎng) 與胚胎移植 第七十三張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月73第一節(jié) 胚胎培養(yǎng) 早在1913年Brachet就嘗試對(duì)兔囊胚進(jìn)行體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),可是由于對(duì)各種動(dòng)物胚胎所需的體外培養(yǎng)液配方不清楚,致使這方面工作在20世紀(jì)的上半世紀(jì)發(fā)展緩慢。1957年,美國(guó)學(xué)者Whitten找到了能使小鼠早期胚胎在體外生長(zhǎng)發(fā)育的培養(yǎng)液配方,從而為哺乳動(dòng)物體外胚胎培養(yǎng)打開了

29、一條通路。第七十四張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月74哺乳動(dòng)物胚胎培養(yǎng)和胚胎移植在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和畜牧業(yè)的發(fā)展中占有重要地位。近 20多年來,世界上許多實(shí)驗(yàn)室均做了大量工作,發(fā)展迅速。 第七十五張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月75把受精卵和不同發(fā)育時(shí)期的早期胚胎取到體外進(jìn)行培養(yǎng),不僅是研究胚胎發(fā)育機(jī)理的重要手段,而且在培育試管嬰兒和試管動(dòng)物方面有著很大的應(yīng)用價(jià)值。哺乳動(dòng)物胚胎對(duì)發(fā)育條件要求嚴(yán)格,而且各種動(dòng)物胚胎所需的營(yíng)養(yǎng)條件又有所不同,因此無(wú)法制定胚胎培養(yǎng)液的通用配方。第七十六張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月76體外受精不同時(shí)期胚胎的體外發(fā)育潛能一定的合成培養(yǎng)液一定的氣

30、相條件從已有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看,體外胚胎培養(yǎng)有下列幾個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié):第七十七張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月77成熟的卵子在試管內(nèi)同精子相遇完成受精作用的過程,稱為體外受精。獲得卵子的方法有多種,如自然排卵、激素誘發(fā)超數(shù)排卵(superovulation)、從卵巢手術(shù)取卵。人工受精率同卵子成熟度關(guān)系極大:卵巢中越接近排卵時(shí)間的卵子,受精率越高;未成熟或過熟的卵子受精率低下。一、體外受精第七十八張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月78人工受精所用的精子必須是獲能(capacitation)的,直接排出的精子或從附睪中取出的精子是不能授精的。所謂獲能,即精子在雌性生殖管中停留期間,發(fā)生了一

31、定的生理、生化和形態(tài)變化,從而獲得了同卵子結(jié)合的能力的過程。在體外,利用卵巢濾泡液、血清、輸卵管液、子宮液和人工培養(yǎng)液處理,同樣可使精子獲能。第七十九張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月79表: 丙酮酸鈉、乳酸鈉和BSA對(duì)小鼠精子體外受精力的影響培 養(yǎng) 液 成 分卵 數(shù)精子穿入的卵子數(shù)(%)基礎(chǔ)培養(yǎng)液 + 20毫克分子濃度乳酸鈉 + 1毫克分子濃度丙酮酸鈉 + 4毫克/毫升BSA* + 以上三種成分18224221925833002065143289(0)(9)(30)(65)(88)人工培養(yǎng)液中的丙酮酸鈉、乳酸鈉和小牛血清白蛋白(BSA)對(duì)小鼠精子的獲能影響很大。 第八十張,PPT共九

32、十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月80受精卵和最早期胚胎較難培養(yǎng)。例如,從豬輸卵管中收集到的受精卵,90能發(fā)育到2細(xì)胞期,但很少超過4細(xì)胞期,可是從子宮中收集到的6-8細(xì)胞期的胚胎,卻有90的可發(fā)育到桑棋胚或囊胚。又如牛受精卵:6可培養(yǎng)到8-12細(xì)胞期;2細(xì)胞期胚胎:則有26可發(fā)育到8-12細(xì)胞期;8細(xì)胞期胚胎:則有51可發(fā)育到桑椹胚。二、不同時(shí)期胚胎的體外發(fā)育潛能第八十一張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月81例如,1956年Whitten最早配制的培養(yǎng)液只能使8細(xì)胞期鼠胚發(fā)育成囊胚。1957年Whitten發(fā)現(xiàn),如果把培養(yǎng)液中加入乳酸鈣,則可使2細(xì)胞胚胎發(fā)育到囊胚。1967年 Whitti

33、ngham和Biggers又相繼發(fā)現(xiàn),小鼠合子在含丙酮酸/乳酸的培養(yǎng)液中很容易分裂到2-細(xì)胞期。后來他們證明,丙酮酸和草酰乙酸是第一次卵裂的單一能源,不必要含有乳酸。 第八十二張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月82這些差別說明:并非各時(shí)期的胚胎發(fā)育能力不同,很可能是由于各時(shí)期胚胎所需的發(fā)育條件不一樣。綜上所述,在早期胚胎培養(yǎng)時(shí),要牢記“受精卵和最早期胚胎較難培養(yǎng)”的規(guī)律,務(wù)必要根據(jù)所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的不同選擇特定時(shí)期的胚胎,以便成功地啟動(dòng)動(dòng)物的胚胎培養(yǎng)。第八十三張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月83各種動(dòng)物胚胎對(duì)培養(yǎng)液成分要求不同。目前常用的培養(yǎng)液有BMOC-3液、Whitten液、

34、Whittingham液、Hams F10+20%小牛血清、SOF培養(yǎng)液、PBS+15%小牛血清、TCM-199組織培養(yǎng)液、M12培養(yǎng)液、 M16培養(yǎng)液等。三、一定的合成培養(yǎng)液培養(yǎng)液的成分對(duì)早期胚胎發(fā)育至關(guān)重要,不同動(dòng)物種類及不同發(fā)育時(shí)期的胚胎對(duì)培養(yǎng)液組成成分的要求不同。例如,體外培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物早期胚胎往往存在一個(gè)發(fā)育阻斷(blocks of development)現(xiàn)象,即從受精卵開始的體外培養(yǎng)很難一直發(fā)育到囊胚階段,而是停留在某一時(shí)期,無(wú)法向下發(fā)育。第八十四張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月84每種動(dòng)物都有比較固定的阻斷時(shí)期,如小鼠的2-細(xì)胞阻斷(2-cell block),是指小

35、鼠體外培養(yǎng)的受精卵分裂一次成為2-細(xì)胞后,便不再繼續(xù)分裂,而如果從2-細(xì)胞晚期開始培養(yǎng)則可以發(fā)育到囊胚。其它動(dòng)物如牛的的阻斷時(shí)期為8-16細(xì)胞時(shí)期,豬為4-細(xì)胞時(shí)期。針對(duì)這一現(xiàn)象,人們首先從改變培養(yǎng)液成分入手,分析阻礙發(fā)育的原因,結(jié)果發(fā)現(xiàn)葡萄糖對(duì)小鼠胚胎發(fā)育有抑制作用,是造成2-細(xì)胞阻斷的原因。第八十五張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月85 值得注意的是:葡萄糖雖然抑制小鼠胚胎2-細(xì)胞向4-細(xì)胞的發(fā)育,但葡萄糖對(duì)4-細(xì)胞以后的胚胎發(fā)育又是必需的。 于是,Chatot(1988)對(duì)BMOC-2培養(yǎng)液進(jìn)行了改良,形成了目前受精卵體外培養(yǎng)普遍采用的CZB培養(yǎng)液,它是以谷氨酰氨代替葡萄糖,結(jié)果

36、90%左右的受精卵發(fā)育到4-細(xì)胞時(shí)期,2-細(xì)胞阻斷被克服了。第八十六張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月86克服體外發(fā)育阻斷的另一方法為共同培養(yǎng)(co-culture),是指將胚胎與輸卵管上皮細(xì)胞或子宮上皮細(xì)胞共同培養(yǎng),以促進(jìn)胚胎發(fā)育。利用共培養(yǎng)技術(shù)已使豬、牛、羊等克服了體外發(fā)育阻斷現(xiàn)象。哺乳動(dòng)物早期胚胎與輸卵管上皮或子宮上皮細(xì)胞共同培養(yǎng)系統(tǒng),也是研究胚泡著床機(jī)理的良好手段。第八十七張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月87早期胚胎的培養(yǎng)液需配合一定的氣相條件。一般用含5CO2的空氣或5O2和90N2的混合氣體調(diào)節(jié)pH值。胚胎對(duì)培養(yǎng)液pH變化很敏感,pH值超出7.2-7.4的范圍,會(huì)

37、引起胚胎死亡。磷酸緩沖液系統(tǒng)的酸度較穩(wěn)定,氣相可用空氣。進(jìn)行體外培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物胚胎,一般只是著床前的早期胚胎。胚胎著床后,同母體建立了密切的物質(zhì)交換關(guān)系,對(duì)營(yíng)養(yǎng)條件的要求更加復(fù)雜。因此對(duì)著床后的胚胎體外培養(yǎng)更加困難。四、一定的氣相條件第八十八張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月88Y.O.Hsu和L.T.Chen(1983)將受精后3.5d的鼠胚培養(yǎng)到相當(dāng)于在子宮內(nèi)正常發(fā)育的第10d胚胎,是胚胎體外培養(yǎng)時(shí)間最長(zhǎng)的。胚胎發(fā)育經(jīng)過了原腸胚、神經(jīng)胚、體節(jié)期等階段,培養(yǎng)到第10d時(shí)發(fā)育出了肢芽、眼泡以及肺、肝、胰等器官。這在哺乳動(dòng)物胚胎完全體外培養(yǎng)的道路上前進(jìn)了一大步。近年來,國(guó)內(nèi)外均有人實(shí)驗(yàn)將

38、小鼠或兔等的胚泡與子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞共培養(yǎng),建立胚泡著床模型,試圖探明哺乳動(dòng)物胚泡著床的機(jī)理。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)孕酮、雌二醇等激素能促進(jìn)胚泡與子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞之間的粘附率。 第八十九張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月89第二節(jié) 胚胎移植 從一頭受孕母畜(供體)的生殖管道中取出受精卵或發(fā)育到一定時(shí)期的早期胚胎,移植到與供體母畜同步發(fā)情的母畜(受體)生殖管道的一定部位,繼續(xù)發(fā)長(zhǎng)、發(fā)育,長(zhǎng)成子畜的技術(shù)稱為胚胎移植。在人類中,供體婦女和受體婦女在排卵周期同步的情況下,轉(zhuǎn)移受精卵或早期胚胎,在受體婦女的體內(nèi)繼續(xù)孕育的技術(shù),亦稱為胚胎移植。第九十張,PPT共九十九頁(yè),創(chuàng)作于2022年6月901890年,英國(guó)的Walter Heape成功地進(jìn)行了家兔的胚胎移植實(shí)驗(yàn),他把4-細(xì)胞期的安哥拉家兔胚胎移植到一只交配過的比利時(shí)野兔體內(nèi),生下了2只安哥拉小兔。該實(shí)驗(yàn)的成功,證實(shí)了早期胚胎在生理?xiàng)l件

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無(wú)特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁(yè)內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 人人文庫(kù)網(wǎng)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

評(píng)論

0/150

提交評(píng)論