1、系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)課程論文題目：結(jié)核分枝桿菌及其耐藥基因的特征 專業(yè)：生物工程 姓名：魏文憑學(xué)號：2016304120036中國武漢二0一六年十二月結(jié)核分枝桿菌及其耐藥基因的特征摘要：分枝桿菌屬主要包括結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（包括結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿 菌、非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌）、麻風(fēng)分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌。造成人 畜共患病的結(jié)核分枝桿菌和引起麻風(fēng)病的麻風(fēng)分枝桿菌是威脅人類健康的兩類 病原菌，而非結(jié)核分枝桿菌病疫情也逐年增加。因此關(guān)注分枝桿菌具有重要的科 學(xué)意義及應(yīng)用價值，對農(nóng)業(yè)、衛(wèi)生和環(huán)境都用深遠(yuǎn)影響。本文主要介紹分枝桿菌 的特征和一些耐藥基因的研究。關(guān)鍵詞：耐藥機(jī)制 結(jié)核病 生物學(xué)特征1、結(jié)核

2、病的認(rèn)識及治療發(fā)展結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis， M.tuberculosis）是全球第二大 致死性傳 染病一結(jié)核病的病原體。結(jié)核分枝桿菌最大的特 點(diǎn)就是持留性 （persistence）1，有時感染可達(dá)幾十年，因此全球約有三分之一的人口感染結(jié) 核分枝桿菌，其中每年死于結(jié)核病的人數(shù)高達(dá)180萬（World Health Organization. 2016）。中國是結(jié)核病高發(fā)的國家，已被世界衛(wèi)生組織列為全球22個結(jié)核病高負(fù) 擔(dān)和特別警示的高耐藥國家之一。結(jié)核病很早就存在，在考古學(xué)界，從新石器時代人遺骨中發(fā)現(xiàn)有骨結(jié)核，古 埃及木乃伊中也發(fā)現(xiàn)有結(jié)核病，說明結(jié)核

3、病的歷史可追溯到公元前2400-3400 年。在中國歷史上，結(jié)核病也是廣泛流行的，當(dāng)時稱為癆病，是一種慢性呼吸道 疾病，在認(rèn)識到它的致病菌之前，人們沒有治療的手段，只能通過環(huán)境的影響， 在空氣清新、氣候濕潤的地域抑制結(jié)核病的發(fā)作。在1882年，德國微生物學(xué)家 羅伯特科赫（Robert Koch）通過特殊的染色技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了細(xì)棒狀的結(jié)核桿菌， 又通過血清培養(yǎng)基獲得了結(jié)核桿菌，證實了結(jié)核桿菌是結(jié)核病的病原菌。自此對 結(jié)核病有了清晰的認(rèn)識，對于結(jié)核病的檢測技術(shù)也不斷發(fā)展。法國科學(xué)家卡爾梅 特（Calmette）和格林（Guerin）在1908年和1919年間，經(jīng)過230次的傳代， 獲得了一株牛分枝桿菌

4、減毒株，卡介苗。自1921年首次使用以來，成為有效 治療兒童結(jié)核病的疫苗，但對于成人型結(jié)核病的的治療很有限。到了上世紀(jì)中期 以來，臨床上又應(yīng)用了一些抗結(jié)核的藥物，如異煙肼（INH）、利福平（RIF）、 鏈霉素（SM）、毗嗪酰胺（PZA）等，使得結(jié)核病的防治得到了有效控制。但到 了 90年代，耐多藥菌和廣泛耐藥菌的發(fā)現(xiàn)，以及世人對結(jié)核病防治的放松導(dǎo)致 該病大有席卷重來之勢。因此對結(jié)核分枝桿菌療效確切、治療周期短、安全性高 的疫苗的研發(fā)迫在眉睫。2、結(jié)核分枝桿菌的特點(diǎn)2.1細(xì)胞結(jié)構(gòu)特點(diǎn)結(jié)核分枝桿菌是一種胞內(nèi)菌，屬于放線菌，傳統(tǒng)革蘭氏染色效果不明顯，因 為其細(xì)胞壁含有分枝菌酸，抗酸性染色為陽性。分枝

5、桿菌為細(xì)長略帶彎曲的桿菌， 大小為1-4X0.4Mm，無鞭毛，無芽孢，不能產(chǎn)生內(nèi)外毒素，需要特殊的培養(yǎng)基 進(jìn)行培養(yǎng)，生長極度緩慢，菌體成分為糖類、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等。科學(xué)工作者研究 一般選擇恥垢分枝桿菌，它是分枝桿菌的模式生物，具有快速生長無致病性的優(yōu) 點(diǎn)3。分枝桿菌具有大量的脂質(zhì)，占菌體重量的20%40%，胞壁中含量最多。幾 乎沒有其他生物能像結(jié)核桿菌這樣產(chǎn)生如此多的脂溶性分子，多項研究表明細(xì)菌 的毒力與其所含的脂質(zhì)分子有關(guān)，尤其是糖類3。脂質(zhì)可防止菌體水分丟失， 因此結(jié)核桿菌對干燥的抵抗力特別強(qiáng)。對酸（3% HCl或6% H2SO4）或堿（4% NaOH）有抵抗力，15min內(nèi)不受影響。對多種

6、抗生素敏感，但長期使用易引起 耐藥性，而且耐藥基因能夠遺傳。結(jié)核分枝桿菌能侵染機(jī)體的任何組織、器官，其生長極度好氧，肺部感染是 最主要的致病方式，目前研究發(fā)現(xiàn)其毒力因子很多，包括索狀因子、脂阿拉伯甘 露聚糖、分泌蛋白、代謝相關(guān)因子、轉(zhuǎn)錄因子、雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)、分泌系統(tǒng)和應(yīng) 激蛋白等4。從分子生物學(xué)角度來看，對毒力基因的了解知之甚少。研究較多 的是:編碼毒素-抗毒素系統(tǒng)的基因，控制細(xì)胞的程序性死亡以應(yīng)對環(huán)境壓力5。 編碼sigma因子的基因，通過與whiB3相互作用而活化相關(guān)基因的表達(dá)6。編 碼過氧化氫酶的基因應(yīng)對低氧脅迫及對抗宿主巨噬細(xì)胞的活性氧7。Lam，KatG 對細(xì)菌在巨噬細(xì)胞中的生存起作

7、用8。2.2基因組和比較基因組特點(diǎn)M.tuberculosH37Rv全基因序列圖于1998年由英國和法國科學(xué)家聯(lián)合完成，2001年臨床分離株CDC1551的全基因組測序完成，標(biāo)志著分枝桿菌的研究進(jìn)入 到后基因組時代。對基因組的注釋及分析成為當(dāng)務(wù)之急，近些年來，全球組學(xué)的 研究取得了巨大進(jìn)展，為分枝桿菌的診斷、進(jìn)化、靶標(biāo)提供了良好的基礎(chǔ)。H37Rv 全基因組由4411529bp組成，包括4000多個基因，已發(fā)現(xiàn)4005個ORFs9。其 基因組有幾個重要的特征，G+C含量相對穩(wěn)定，高達(dá)65.6%；起始密碼子中有 35%是GTG，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于枯草桿菌的9%和大腸桿菌的14%，這造成結(jié)核菌高G+C 偏向；

8、有明確功能的基因大概有2441個，不含插入序列的假基因有6個，仍有 600多個基因不知其功能10。值得注意的是其有相當(dāng)多的基因編碼參與到脂肪 代謝的酶類中，有10%的基因編碼PE和PPE蛋白家族，這是分枝桿菌特有的重 復(fù)序列基因，而其功能仍未知，不過根據(jù)已有的研究表明，它們在免疫學(xué)方面有 重要作用9。近年來，有人通過芯片技術(shù)來比較不同分枝桿菌菌株的基因組差異。在無毒 性的恥垢分枝桿菌中，mutY和mutM在維持恥垢非致病性起作用，另外恥垢通 過半胱氨酸天冬酰胺酶依賴途徑來誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡，相比結(jié)核桿菌，非致病菌 能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更強(qiáng)的天然免疫應(yīng)答11。在結(jié)核分枝桿菌特有的129個開放閱 讀框中（

9、ORF），指出有39個ORF在卡介苗BCG中缺失（主要存在3個RD區(qū) 域），29個在部分BCG菌株中缺失3。這些H37Rv特有的ORF在無毒株中缺 失，表明這些基因可能是代表了毒性因子編碼基因，也可能是結(jié)核分枝桿菌保護(hù) 性抗原編碼基因12。3、結(jié)核分枝桿菌的致病機(jī)理結(jié)核分枝桿菌在長期的宿主-細(xì)菌相互作用過程中，形成了自身獨(dú)特的生活 習(xí)性，使其能夠適應(yīng)宿主的免疫系統(tǒng)13。在感染宿主后機(jī)體會調(diào)動自身免疫防 御系統(tǒng)來抵御外來入侵者，巨噬細(xì)胞在其中起重要作用。巨噬細(xì)胞是人體抵御外 界壓力的第一道天然免疫屏障，在巨噬細(xì)胞感染后會利用吞噬溶酶體來降解細(xì)菌， 并和樹突狀細(xì)胞一起引起宿主的一系列信號傳導(dǎo)導(dǎo)致感

10、染的細(xì)胞死亡14。結(jié)核 分枝桿菌通過調(diào)控相關(guān)蛋白的表達(dá)使其能夠在宿主中存活幾十年，和宿主達(dá)到一 種平衡15。在成熟的吞噬溶酶體內(nèi)，會由細(xì)胞氧化酶和誘導(dǎo)性氮氧化物合酶生成大量的 活性氧，從而殺死病原菌。而分枝桿菌則通過分泌GroEL2蛋白與巨噬細(xì)胞發(fā)生 相互作用，影響巨噬細(xì)胞的識別與吸附16。通過也會阻止吞噬溶酶體的形成和 酸化，抑制自噬的形成，從而維持分枝桿菌的蛋白活性17。分枝桿菌在低氧的 環(huán)境中會進(jìn)行休眠，并合成大量的交叉連結(jié)肽聚糖維持自身的生存，PhoP等雙 組份調(diào)控系統(tǒng)對于應(yīng)對低氧脅迫有重要作用18。DosR蛋白與分枝桿菌的潛伏 感染息息相關(guān)，DosR能調(diào)控約50個快速響應(yīng)的基因，起到

11、應(yīng)對低氧環(huán)境緊急措 施的目的；在低氧處理一段時間后，受到調(diào)節(jié)的基因達(dá)到幾百個。顯然這些持久 性低氧脅迫基因與結(jié)核分枝桿菌的潛伏持留感染有關(guān)19。4、結(jié)核分枝桿菌中的耐藥基因結(jié)核分枝桿菌在抗結(jié)核藥物研發(fā)出來時，有很好的治療效果，但由于結(jié)核桿 菌耐藥機(jī)制的形成，造成藥物的長期使用療效急速下降。而目前結(jié)核桿菌的耐藥 機(jī)制仍未完全了解清楚。近幾十年的研究表明藥物作用的靶標(biāo)的改變是大部分結(jié) 核桿菌產(chǎn)生耐藥的主要原因，但也包括細(xì)菌的藥物外排泵機(jī)制、細(xì)胞膜通透性的 改變等20, 21。結(jié)核桿菌耐INH的原因很多，涉及到katG、NADH脫氫酶基因ndh、烯酰 基載體蛋白還原酶基因ihhA、酮?；；D(zhuǎn)移蛋白

12、酶基因kasA以及烷基過氧化 氫酶基因ahpC等。其中主要的是katG的突變，katG編碼過氧化氫-過氧化物酶， 該酶能將INH氧化成異煙酸，成為煙酸的類似物，從而抑制細(xì)胞壁枝菌酸的合 成22, 23。利福平的作用是通過與結(jié)核桿菌RNA聚合酶的。亞單位結(jié)合，干擾轉(zhuǎn)錄的 開始和RNA的延伸。若。亞單位突變，則阻止利福平的結(jié)合，造成耐藥；而細(xì) 胞壁結(jié)構(gòu)的改變則會導(dǎo)致藥物的攝入減少，這種情況在鳥分枝桿菌復(fù)合群中有發(fā) 現(xiàn)；因此兩種可能都不能排除24。鏈霉素是第一種有效的抗結(jié)合藥物，目前在沒有新藥出現(xiàn)的情況下仍是結(jié)核 病治療的一線藥物。它是一種氨基環(huán)醇糖苷類抗生素，通過干擾蛋白質(zhì)的合成而 發(fā)揮作用。編碼

13、核糖體蛋白S12基因和16S rRNA基因的突變是目前認(rèn)為耐SM 的的原因，但具體機(jī)制不完全清楚21。毗嗪酰胺是一種煙酰胺類似物，PZA滲透入吞噬細(xì)胞后并進(jìn)入結(jié)核桿菌菌 體內(nèi)，菌體內(nèi)的酰胺酶使其脫去酰胺基，轉(zhuǎn)化為毗嗪酸而發(fā)揮抗菌作用。pncA 基因突變導(dǎo)致毗嗪酰胺酶活性下降或喪失，嚴(yán)重影響酶的功能。在耐PZA的一 部分分離株中，發(fā)現(xiàn)pncA基因并未突變，說明還有其他的耐藥機(jī)制25。5、小結(jié)耐多藥菌和廣泛耐藥菌的出現(xiàn)以及未有新的抗結(jié)核藥上市的情況下，人類正 面臨著結(jié)核分枝桿菌的嚴(yán)重威脅，對抗結(jié)核藥物的新靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)、全新抗結(jié)核藥 物機(jī)制的篩選，以及結(jié)核治療靶向給藥系統(tǒng)等的研究將為人類有效控制結(jié)核病

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