1、柑橘采后致病青霉的鑒定摘 要：青霉菌是柑橘類水果采后優(yōu)勢(shì)致病菌， 也可使多 種果蔬腐爛。目前，國(guó)內(nèi)外大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，引起柑橘采后腐爛 的青霉菌為意大利青霉(Pe ni cilliumitdicum Wehmer與指狀青霉 (P.digitatumSacc) ，但也有人提出不同的看法。病原真菌的鑒定通常采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)的方法， 存在一定的局限性。 應(yīng) 用 rDNA-ITS 分子標(biāo)記分析和傳統(tǒng)真菌形態(tài)學(xué)鑒定相結(jié)合的方 法，對(duì)從不同產(chǎn)地分離獲得的能引起柑橘貯藏期間腐爛的 8 株青 霉菌(L、Q PL、PQ CL CO PTY 1、PTY-2)進(jìn)行了鑒定。結(jié) 果表明：引起柑橘采后腐爛的青霉菌除指狀青霉

2、(P.digitatum Sacc) ，外，還有擴(kuò)展青霉 Pexpansum(Link)Thom ，波蘭青霉 (P.polonicum Thom),黃青霉(P.chrysogenum Thom)等多種青霉。 為柑橘采后致病青霉的快速鑒定及其病害的及早防治提供了有 益的參考。文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A在柑橘采后貯藏病害中， 以青霉菌引起的病害最為嚴(yán)重。 據(jù) 統(tǒng)計(jì)。該病害在貯運(yùn)期間造成的損失一般為10左右，高的超過(guò) 30，每年給生產(chǎn)和經(jīng)營(yíng)者帶來(lái)很大的損失。目前，國(guó)內(nèi)外 大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，引起柑橘采后腐爛的青霉菌為意大利青霉 (Penicillium italicum) 與指狀青霉 (P.digitatum)2

3、 種，但也 有人提出， 引起柑橘采后腐爛的青霉菌除上述 2 種病原菌外， 還有擴(kuò)展青霉P.expansum(Link)Thonl 、橘青霉(P.citriumThom)等致病菌。 病原真菌目前主要采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定的方法， 而該 方法存在一定的局限性。如需要經(jīng)驗(yàn)、用時(shí)較長(zhǎng)等問(wèn)題，給生產(chǎn) 和實(shí)踐帶來(lái)一定的困難。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子 手段在微生物分類學(xué)中被不斷引入，特別是rDNA基因簇區(qū)域已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于真菌分類鑒定系統(tǒng)，保守的 18 s、 28 s 區(qū)域 有利于屬的分類鑒定， 而 ITS 區(qū)域則廣泛應(yīng)用于種類單元分類鑒 定。這些方法的引入為果蔬病原真菌的快速準(zhǔn)確檢測(cè)提供了必要 的

4、基礎(chǔ)。為此，作者所在的實(shí)驗(yàn)室在20052006年對(duì)不同產(chǎn)地不同品種柑橘貯藏過(guò)程中引起采后腐爛的青霉菌進(jìn)行了分離與 純化，篩選出引起柑橘采后腐爛的幾株致病青霉， 并采用傳統(tǒng)真 菌形態(tài)學(xué)分類鑒定與 rDNA-ITS 分子標(biāo)記相結(jié)合的方法對(duì)所分離 到的菌株進(jìn)行了鑒定，為該病害的防治奠定一定的理論基礎(chǔ)。材料和方法1.1 供試菌株試驗(yàn)供試的 8 株青霉菌均由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)采后生物學(xué)與技 術(shù)實(shí)驗(yàn)室分離，菌株編號(hào)及其寄主、地理來(lái)源見表 l 。將分離保 存的病原菌株， 回接到健康柑橘果實(shí)表面。 根據(jù)柯赫氏法則初步 測(cè)定其致病性，然后再進(jìn)行分離純化。12 病原菌的致病性檢測(cè) 在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)柑橘育種中心基地， 采集

5、大小均勻、 品質(zhì)優(yōu) 良的溫州蜜柑果實(shí)，用質(zhì)量分?jǐn)?shù) 2次氯酸鈉溶液和清水洗凈表皮，自然晾干備用。將純化培養(yǎng) 7 d 的青霉孢子用無(wú)菌水刮下稀 釋，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，配成 1x106 spores/mL 的孢子懸浮液，然 后用消毒針在果實(shí)腰部針刺打孔，每果接種 10 針，接種深度基 本一致，以刺破果實(shí)表皮為宜。每個(gè)傷口接種20卩L病原菌抱子懸浮液。25C保濕培養(yǎng)。逐日觀察并記錄發(fā)病癥狀的動(dòng)態(tài)變化。13 病原菌傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類鑒定將病原菌在PDA培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)7 d，觀察菌落形態(tài)。采 用周德慶的載片培養(yǎng)法， 將分離保存的 8 株致病青霉分別點(diǎn)接于 滴有Czapack或PDA培養(yǎng)基的玻片上，然后置于滅菌

6、的培養(yǎng)皿中， 倒20%甘油（滅菌）保濕，25C恒溫培養(yǎng)710 d,最后在顯微鏡 下觀察不同菌株的形態(tài)特征， 參照真菌形態(tài)學(xué)鑒定手冊(cè)， 鑒定分 離所得病原菌的種類。14病原菌的 rDNA-ITS 分子標(biāo)記法鑒定1. 4. 1病原菌DNA的提取DNA提取的方法參照文獻(xiàn)的方法 并稍加改進(jìn)。將純化的8株病原菌各接種1環(huán)于PDB液體培養(yǎng)基 中，25C下200r/min搖床培養(yǎng)4 d。將所得新鮮幼嫩菌絲用無(wú) 菌水沖洗 5 次，確保除凈菌絲表面黏附的培養(yǎng)基及其它雜質(zhì)。 用 濾紙吸干多余水分，將菌絲樣品在經(jīng) -20C預(yù)冷的研缽中用液氮 研磨至粉碎。分裝于 1. 5 mL的Ep pen doff管中，置于-20

7、C 的冰箱中保存?zhèn)溆?。每個(gè)樣品各取1管，加入65C預(yù)熱的CATB抽提緩沖液 （2%CATB， 2%PVP， 100 mmol/L Tris-HCl pH 8.0。25mmol/L EDTA 2.0 moYL NaCI)1 mL , 65 cIc 水浴 45min，中 間顛倒23次?；靹虿⑵骄盅b于 2個(gè)離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇(24 : 1)用力振蕩數(shù)次；12 000 r /min離心15 min。取上清液移至新管中，加入等體積的氯仿/異戊醇(24 : 1), 上下顛倒數(shù)次(勿劇烈振蕩)；12000 r/min離心15 min。再取上 清液移至新管中。加入 2倍體積的 100冰乙醇，

8、 16000 r/min 離心lOmin，棄上清液。70%冰乙醇洗2次，室溫晾干。室溫干 燥后加入35卩LTE溶解，4C過(guò)夜保存。1. 4. 2通用引物擴(kuò)增rDNA基因簇ITS全序列按以下反應(yīng)條件進(jìn)行PCF擴(kuò)增：50卩L反應(yīng)體系，包括lOxPCRbuffer 5.0卩L, 25 mmol/L MgCI25.0 卩 L, 10 mmol/L dNTP2.0 卩 L, 5 u/ 卩 p,L Toa DNA聚合酶0.4 L, 上游引物ITSl(5 -TCCGTAGGTGAACCT-GCGG與下游引物 ITS4(5 -TCCTCC GCT-TAqTGATATGC-)均為 20 mmol/L，各取1.0

9、 a L, BSA2.0 卩 L, DNA模版 2. 0卩 L。PCF反應(yīng)程序?yàn)椋?4C 預(yù)變性 4 min, 94C變性 1 min, 54C退火 I min, 72C延伸 1 min, 36個(gè)循環(huán)，72C終延伸lOmin , 4C保溫60 min。將擴(kuò)增后的樣 品產(chǎn)物置于4C冰箱，保存?zhèn)溆谩?. 4. 3 PCR產(chǎn)物的回收純化及序列分析取7 a LPCR產(chǎn)物+1 a L 6xLoading buffer 混勻后點(diǎn)樣，于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 1, 0%瓊 脂糖凝膠電泳檢測(cè)。初樣檢測(cè)產(chǎn)物片段大小在 500 bp 左右。 PCR 產(chǎn)物純化后送北京華大中生科技 XX公司純化測(cè)序。1. 4. 4 blast

10、序列比對(duì)測(cè)序結(jié)果在 httw/www ncbi nlmnih gov 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，從而獲 知病菌種類。結(jié)果與分析21 病原菌的分離及致病性檢測(cè)從不同產(chǎn)地和不同品種柑橘發(fā)病果實(shí)上共分離 獲得 8 株 致病青霉（L、Q PL、PQ CL CQ PTY-1、PTY-2）,發(fā)現(xiàn)這 8 株 病原菌均能引起柑橘腐爛， 它們?cè)诠麑?shí)表面或內(nèi)部發(fā)病， 先形成 褐色水漬斑，之后生出白色菌絲，然后長(zhǎng)出青色或綠色霉層，最 后導(dǎo)致全果腐爛。 從發(fā)病果實(shí)上可重新分離得到與所接菌株的培 養(yǎng)性狀相同的病原菌， 依照柯赫氏法則說(shuō)明分離得到的病原菌是 引起柑橘采后腐爛的致病菌。強(qiáng)致病菌的研究結(jié)果表明：菌株P(guān)L與CL這2個(gè)菌

11、株對(duì)柑橘 果實(shí)致病能力最強(qiáng)， 條件適宜的情況下， 從果實(shí)發(fā)病到全果腐爛 只要710 d:其次為菌株 L;而PQ CQ PTY-1、PTY-2這4個(gè) 菌株的致病力相當(dāng)；菌株Q的致病力最弱，接種后部分傷口表面 愈合，但在果肉內(nèi)部出現(xiàn)腐敗現(xiàn)象。22 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定病原菌株P(guān)L與EL相似，它們?cè)赑DA上菌落絨狀，生長(zhǎng)快，菌絲體初為白色，略帶黏性，較寬，約810 mm后轉(zhuǎn)為綠色霉層，基質(zhì)顏色不變。有特殊的香味（圖版A, B）;而在Czapack 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢（圖版-I , J）;鏡檢觀察其分生抱子梗無(wú)色， 較短，帚狀枝大而不規(guī)則； 小梗中部稍寬； 分生孢子串生， 單孢， 無(wú)色，卵圓形或圓形，較大

12、，大小4.59. 0 mK5. 0-7 .5卩m； 該菌株只在果實(shí)表面形成，起始為水漬狀，淺褐色，發(fā)病后快速 形成白色菌絲，之后菌絲在果皮表面迅速擴(kuò)展，邊緣不明顯，不 整齊。最后形成綠色霉層，有香味 （ 圖版 O）。PQ、CQ、PTYm、l PTY-2 這 4 個(gè)菌株形態(tài)基本一致在 PDA 上菌落為青色， 呈粉粒狀， 生長(zhǎng)較快， 有白色邊緣， 最后變褐色： 基質(zhì)由白色轉(zhuǎn)為黃褐色。并隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)加深（ 圖版 C， D，E, F）；在Cza pack培養(yǎng)基上先長(zhǎng)出白色菌絲，表面分泌黃色 水滴，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，菌落表面逐漸轉(zhuǎn)為青色（ 圖版 K， L，M N）;鏡檢觀察分生抱子梗無(wú)色， 先端具1

13、3個(gè)分枝，掃帚狀； 小梗頂端漸趨尖細(xì)； 分生孢子呈念珠狀串生， 單孢無(wú)色， 近球形， 大小3.14.0 u mx 3.254.5卩m該菌株在果皮及內(nèi)部形成， 開始為 - 漬狀，邊緣不明顯，之后長(zhǎng)出菌絲，慢慢形成青色霉層， 深褐色水漬斑擴(kuò)展，有較重霉味 （ 圖版 R）。菌株L,在PDA培養(yǎng)基上菌落呈絨狀，有部分氣生菌絲，生 長(zhǎng)快，邊緣白色，最后變褐色，菌絲體初為白色，后形成藍(lán)綠色 霉層，后期有時(shí)形成抱梗束，基質(zhì)背面為淡黃色至黃褐色 （ 圖版 -G）：而在Cza pack培養(yǎng)基上菌落呈灰白色，有輻射狀的凹 溝.由束狀的或單生的分生抱子梗相間形成同心環(huán)（圖版0）。鏡檢觀察其分生抱子梗無(wú)色， 先端具有

14、 2 個(gè)左右分枝， 分生抱子 鏈長(zhǎng)而糾結(jié)，分生抱子單抱無(wú)色， 橢圓形或近球形， 大小為 3.15 4.00卩mx 3.254.5 u m該菌株在果皮及內(nèi)部形成，發(fā)生較 慢，深褐色水漬狀斑，其后上生大量的分生孢子而呈藍(lán)綠色，邊 緣有狹窄的白邊環(huán)，明顯而整齊 （圖版 S）。菌株Q在PDA培養(yǎng)基上菌落呈絨狀或粉粒狀，有部分氣生 菌絲，菌絲體初為白色。后形成青灰色霉層，邊緣菌絲帶白色， 較窄（圖版H）:而在Cza pack培養(yǎng)基上菌落絨狀，常呈輻射狀 的凹溝，泌出多量的水滴，淡黃色至黃色；背面淡黃色 （圖版 p）。顯微鏡檢觀察其分生抱子梗無(wú)色，分枝較多，分生抱子呈鏈 珠狀串生，單抱無(wú)色，橢圓形，大小為

15、3.153.75卩mx3.254.0卩m該菌株在果皮及內(nèi)部形，成發(fā)生較慢（圖版T）。根據(jù)致病性檢測(cè)，結(jié)合形態(tài)特征及鏡檢結(jié)果，參照周德慶、 魏景超的真菌分類鑒定方法， 可初步判斷這 8 個(gè)病原菌株均為半 知菌亞門青霉屬，具體種系待定。23 致病菌 rDNA-ITS 序列分析為了進(jìn)一步確認(rèn)青霉病菌的種名，采用 rDNA-ITS 分子鑒定 法對(duì)這些菌株進(jìn)行分析。以病原真菌的DNA乍為模板，用通用引 物擴(kuò)增出約 500 bp 左右的 rDNA-ITS 序列。將所測(cè)得的 rDNA-ITS 序列在GenBank中進(jìn)行比對(duì)分析。將所測(cè)得的不同青霉菌株的 rDNA-ITS序列在GenBank中與 已有的一些真

16、菌序列進(jìn)行比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)， 所測(cè)致病菌均屬于半知 菌亞門青霉屬。同源性比對(duì)結(jié)果表明：PL與CL這2個(gè)菌株分別測(cè)得的 520 bp 的 rDNA-ITS 序列與 P digitatum（AF455394 ， AF455420, AY6849261等多個(gè)菌株的ITS序列同源性高達(dá)99. 62%; PQ CQ PTY-1、PTY-2這 4 個(gè)菌株，分別測(cè)得 543、 532、522、532 bp 的 rDNA-ITS 序列，均與 P polonicum fAF033475 , AJ005493,AJ005492)等菌株的ITS序列同源性最高。達(dá)99.62%; 菌株L所測(cè)得的528 bp的rDNA-IT

17、S序列與P expansumfAY373912 AJ608953, AF2187861 等菌株的 ITS 序 列同源性高達(dá) 99.62%。與 P itNicum fAY373920 ，AY9242581 等菌株的ITS序列亦有99.25 %的同源性；菌株 Q測(cè)得的53l bp 的 rDNA-ITS 序列與 P.chrysogenu 菌(AY373902, AY21367Q AY213669)等菌株的ITS序列同源性最高亦達(dá) 99. 62%。綜合病原菌形態(tài)學(xué)特征及 rDNA-ITS 序列測(cè)定比對(duì)結(jié)果，可 以得出：菌株 CL與PL為指狀青霉 P.digitatum Sacc ; PO、CO PTY

18、-1、PTY-2這4個(gè)菌株均為波蘭青霉 P. polonicum Thorn ; 菌株L為擴(kuò)展青霉P. expansum(Link)Thorn ;菌株Q為青霉屬 黃青霉組的產(chǎn)黃青霉菌 P. chrysogenus Thom 。討論青霉屬病原菌的菌落大多呈灰綠色或藍(lán)綠色， 通常難以描述 和區(qū)分。根據(jù)分生孢子形態(tài)、大小、分生孢子梗以及菌落形態(tài)來(lái) 進(jìn)行種的分類，然而由于培養(yǎng)性狀的可變性及形態(tài)特征的交叉， 這些分類標(biāo)準(zhǔn)不可靠。 應(yīng)用傳統(tǒng)病原形態(tài)學(xué)的方法鑒定植物病原 真菌存在需要經(jīng)驗(yàn)以及用時(shí)較長(zhǎng)等一系列的問(wèn)題。 因此， 一些分 子生物學(xué)方法已發(fā)展用于檢測(cè)許多采后真菌性病害或鑒定系統(tǒng) 發(fā)育關(guān)系與某一種的分類地位。 rDNA-ITS 是介于 18S rDNA、 5.8S rDNA和288 rDNA之間的區(qū)域，已有的研究表明 ITS在真菌的種 間存在著豐富的變異， 而在種內(nèi)不同菌株間卻高度保守， 可以為 真菌的系統(tǒng)發(fā)育和分類鑒定提供豐富的遺傳信息。試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，引起柑橘采后致病的青霉菌株有P.digitatum 、P. expartsum、P. polonicum、P