1、分子生物學實驗教學大綱一、課程基本信息課程編碼：091118B課程名稱：分子生物學實驗英文名稱：experiment of molecular biology課程類別：專業(yè)必修課總 學 時：24 總 學 分：1適用專業(yè)：生物科學二、實驗課程的性質、目標與任務1. 分子生物學已成為生命科學的基礎學科之一，其基本理論和實驗技術已滲透到生物學的各個領域并促進了一批新學科的興起和發(fā)展。目前，以分子生物學為基礎的基因克隆重組技術已成為現(xiàn)代生物技術的核心。因此，在掌握基本分子生物學理論的基礎上，為培養(yǎng)學生在分子生物學技術方面的實際動手能力，開設本實驗課程。2. 目標：通過實驗原理的講解和實驗操作，使學生初

2、步了解和熟悉現(xiàn)代分子生物學實驗的基本原理、操作技能和實際應用，提高學生的創(chuàng)新思維和獨立分析問題、解決問題的能力。3. 通過本課程的實驗教學和實驗操作，要求學生熟練掌握下列分子生物學實驗技術：大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備和轉化，質粒DNA的分離及純化，瓊脂糖凝膠電泳，PCR擴增，DNA重組、轉化與檢測實驗等。三、實驗課程教學基本要求（1）注重分子生物學基礎實驗技能的掌握與提高，提升學生的動手操作能力；（2）實驗課前要預習，明確每次實驗的目的、原理與基本步驟；（3）實驗過程中要具有嚴謹科學的態(tài)度，尊重事實與實驗結果，要善于發(fā)現(xiàn)問題、分析問題、解決問題；（4）樹立學生之間的交流與合作意識。四、實驗教學內

3、容及要求實驗一 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備【實驗類型】基礎性實驗【目的與要求】掌握大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備技術。注意嚴格無菌操作，在冰上進行。正確選取對數(shù)生長期的大腸桿菌細胞?！緝热萏嵋扛惺軕B(tài)是細菌處在容易吸收外源DNA的狀態(tài)。選用經過基因改造的生物工程菌株大腸桿菌DH5a菌株為材料，在0、CaCl2低滲溶液處理，細胞壁破壞，細胞成為球型原生質體。因而具備了吸收外源DNA的能力。實驗操作步驟：1. 挑取單菌落，接種培養(yǎng)過夜2. 轉接培養(yǎng)3. 將菌液置冰浴處理4. 收集菌體5. CaCl2處理，-70保存?！舅柚饕獌x器設備】1.超凈工作臺 2.低溫離心機 3.恒溫搖床 4.紫外分光光度儀實驗二

4、 質粒DNA的轉化【實驗類型】基礎性實驗【目的與要求】掌握質粒DNA的轉化技術。注意嚴格無菌操作，在冰上進行。準確控制轉化熱激的溫度和時間?！緝热萏嵋緿NA能夠黏附于感受態(tài)細胞的表面，經過42短時間的熱激處理可以促進DNA的吸收。轉化菌在非選擇培養(yǎng)基中保溫一段時間后，質粒DNA所攜帶的抗性基因（Ampr）得到表達，然后再在選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，使轉化的菌株得以正常生長。實驗操作步驟：1. 取新鮮制備的感受態(tài)細胞，加入質粒；同時做一對照試驗2. 42水浴熱激3.冰浴4.復蘇5.涂平板6.菌落培養(yǎng)【所需主要儀器設備】1.超凈工作臺 2.恒溫水浴 3.恒溫搖床實驗三 質粒DNA的提取【實驗類型】基礎性

5、實驗【目的與要求】堿裂解法提取質粒的技術和方法。注意加入三種溶液的先后順序，在提取過程中，動作要輕柔?！緝热萏嵋繅A裂解法提取質粒利用的是環(huán)狀質粒DNA與線狀的染色體DNA片段在拓撲學上的差異來分離它們。在pH值介于12.0-12.5這個狹窄的范圍內，線狀的DNA雙螺旋結構解開變性，在這樣的條件下，共價閉環(huán)質粒DNA的氫鍵雖然斷裂，但兩條互補鏈彼此依然相互盤繞而緊密地結合在一起。當加入pH4.8的醋酸鉀高鹽緩沖液使pH降低至中性后，共價閉合環(huán)狀的質粒DNA的兩條互補鏈迅速而準確地復性，而線狀的染色體DNA的兩條互補鏈彼此已完全分開，不能迅速而準確地復性，它們纏繞形成網狀結構。通過離心，染色體D

6、NA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質-SDS復合物等一起沉淀下來，而質粒DNA卻留在上清液中。實驗操作步驟：1. 收集菌體2. 加入三種溶液3. 離心4. 質粒的純化5. 質粒的保存【所需主要儀器設備】1恒溫培養(yǎng)箱  2恒溫搖床  3小型高速離心機  4漩渦混合器實驗四 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA【實驗類型】基礎性實驗【目的與要求】掌握瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的技術與方法。注意觀察DNA的分子量大小，估計DNA的含量，推測出樣品DNA的濃度，觀察質粒的3種構型，分析質粒DNA的質量，判斷可否作為下一步基因重組的材料？【內容提要】DNA 分

7、子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應和分子篩效應。DNA分子在高于等電點的pH溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動。由于糖-磷酸骨架在結構上的重復性質，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正極方向移動。在一定的電場強度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應，即DNA分子本身的大小和構型。具有不同的相對分子質量的DNA片段的泳動速度不一樣，可進行分離。DNA分子的遷移速度與相對分子質量的對數(shù)值成反比關系。凝膠電泳也可以分離相對分子質量相同，但構型不同的DNA分子（以質粒為例，一般情況下遷移速率超螺旋環(huán)狀>線狀DNA>單鏈開環(huán)）。實驗操作步驟：1. 制備瓊脂糖凝

8、膠板2. 加樣電泳3. 拍照【所需主要儀器設備】1.瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng) 2. 凝膠成像系統(tǒng)實驗五 PCR基因擴增【實驗類型】基礎性實驗【目的與要求】掌握PCR反應的基本原理和實驗技術。注意確定好退火溫度和延伸時間?！緝热萏嵋縋CR即聚合酶鏈式反應，是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復制出與母鏈模板互補的子鏈DNA的過程。是一項DNA體外合成放大技術，能快速特異地在體外擴增任何目的DNA。可用于基因分離克隆，序列分析，基因表達調控等許多方面。實驗基本操作步驟：1. 變性2. 退火3. 延伸【所需主要儀器設備】PCR儀；凝膠電泳及

9、凝膠成像系統(tǒng)；Taq酶及其Buffer；PCR管實驗六 DNA重組【實驗類型】基礎性實驗【目的與要求】掌握DNA重組的實驗技術。注意外源DNA分子與載體分子的比例。【內容提要】DNA重組是將外源DNA與載體分子連接，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。DNA重組的方法主要有粘端連接法和平端連接法。重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將分別經酶切的載體分子與外源DNA分子進行連接。連接反應的溫度在37時有利于連接酶的活性，但是在這樣的溫度下，粘性末端的氫鍵結合是不穩(wěn)定的。一般的連接條件是在12-16，反應12-16小時(過夜)。實驗基本操作步驟：

10、1. 純化目的DNA2. 連接重組【所需主要儀器設備】恒溫水浴鍋；小型高速離心機實驗七 藍白斑篩選實驗【實驗類型】基礎性實驗【目的與要求】掌握重組子（陽性克?。┑暮Y選技術。未轉化的菌將不能在培養(yǎng)基（含Amp）上生長；空載體的轉化子為藍色菌斑；重組子的轉化子為白色菌斑。可挑取白色菌斑，LB液體培養(yǎng)基（含Amp）37振蕩培養(yǎng)過夜，提取質粒，酶切鑒定插入的片段是否正確?！緝热萏嵋克{白斑篩選是重組子篩選的一種方法，是根據載體的遺傳特征篩選重組子，如-互補、抗生素基因等。由-互補而產生的LacZ+細菌在誘導劑IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在時產生藍色菌落，因而易于識別。然而，當外源DNA插入

11、到質粒的多克隆位點后，幾乎不可避免地導致無-互補能力的氨基端片段，使得帶有重組質粒的細菌形成白色菌落。這種重組子的篩選，又稱為藍白斑篩選。經連接產物轉化的大腸桿菌工程菌平板37溫箱倒置培養(yǎng)12-16 h后，有重組質粒的細菌形成白色菌落。實驗基本操作步驟：1. 同轉化實驗2. 轉化平板的制備【所需主要儀器設備】1.超凈工作臺 2.恒溫水浴 3.恒溫搖床實驗八 DNA酶切技術【實驗類型】基礎性實驗【目的與要求】掌握DNA的酶切技術，了解它在DNA重組中的應用?！緝热萏嵋肯拗菩詢惹忻改芴禺惖亟Y合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內或其附近的特異位點上，并切割雙鏈DNA。它可分為三類:類和類

12、酶在同一蛋白質分子中兼有切割和修飾(甲基化)作用且依賴于ATP的存在。類由兩種酶組成: 一種為限制性內切核酸酶(限制酶),它切割某一特異的核苷酸序列; 另一種為獨立的甲基化酶,它修飾同一識別序列。類中的限制性內切酶在分子克隆中得到了廣泛應用，它們是重組DNA的基礎。絕大多數(shù)類限制酶識別長度為4至6個核苷酸的回文對稱特異核苷酸序列。DNA限制性內切酶的酶切圖譜又稱DNA的物理圖譜，它由一系列位置確定的多種限制性內切酶酶切位點組成，以直線或環(huán)狀圖式表示。在DNA序列分析、基因組的功能圖譜繪制、DNA的無性繁殖、基因文庫的構建等工作中，建立限制性內切酶圖譜都是不可缺少的環(huán)節(jié)，近年來發(fā)展起來的RFLP

13、(限制性片段長度多態(tài)性)技術就是建立在它的基礎上。實驗基本操作步驟：1. 提取質粒2. 酶切3. 電泳【所需主要儀器設備】1.超凈工作臺 2.恒溫水浴 3.恒溫搖床 4.恒溫培養(yǎng)箱   5.小型高速離心機   6.漩渦混合器五、實驗學時分配實驗項目名稱、實驗學時、實驗類型、項目類別、開放性等。序號實驗項目名稱實驗學時實驗類型必做/選做是否為開放實驗備注1大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備3基礎性必做是2質粒DNA的轉化3基礎性必做是3質粒DNA的提取3基礎性必做是4瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA3基礎性必做是5PCR基因擴增3基礎性必做是6DNA重組3基礎性必做是7藍白斑篩選實驗3基礎性必做是8DNA酶切技術3基礎性必做是合計24六、所在實驗室及主要儀器設備（一）實驗室名稱：分子生物學實驗室（二）主要儀器設備：超凈工作臺、低溫離心機、恒溫搖床、紫外分光光度儀、恒溫培養(yǎng)箱、小型高速離心機、漩渦混合器、瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)、PCR儀七、使用教材及主要教學參考書教材：現(xiàn)代分子生物學實驗技術（第2版） 魏春紅等主編，2012，高等教育出版社參考書：分子生物學實驗指導魏群主編，1999，高等教育出版社分子克隆實驗指南J.薩姆布魯克，1999，科學出版社八、課程考