1、    氧自由基在肝缺血再灌注損傷中 的作用及川芎嗪的影響        摘要目的：探討氧自由基在肝缺血再灌注損傷(HIRI)中的作用及川芎嗪的防護(hù)作用。方法：應(yīng)用HIRI家兔及肝癌手術(shù)患者，觀察超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)，黃嘌呤氧化酶(XO)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性、丙二醛(MDA)含量、肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及川芎嗪對(duì)上述指標(biāo)的影響。結(jié)果：HIRI時(shí)SOD、GSH-PX活性顯著下降(P0.05和P0.01)，XO、ALT活性及MDA

2、含量明顯升高(P0.05和P0.01)，肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生異常變化；使用川芎嗪后，上述指標(biāo)的異常變化均明顯減輕，其差異有顯著和非常顯著(P0.05和P0.01)。結(jié)論：氧自由基是HIRI的重要發(fā)病學(xué)因素，而川芎嗪通過(guò)清除氧自由基可減輕HIRI。主題詞氧自由基； 肝臟； 再灌注損傷； 川芎嗪 Role of oxygen free radicals in reperfusion injury following hepatic ischemia and effect of ligustrazinWANG Wan-Tie, LIN Li-Na, XU Zheng-Jie, LI Dong, WANG

3、 Zhong-MinDepartment of Pathophysiology, Wenzhou Medical College, Wenzhou(325003)AbstractAIM：To explore the role of oxygen free radicals (OFR) in hepatic ischemia-reperfusion injury (HIRI) of rabbits and humans and the protective effect of ligustrazin (LGT). METHODS: Changes of several parameters an

4、d effects of LGT on it were observed during HIRI in 20 rabbits and 18 patients who suffered from cancer of the liver and were scheduled for elective hepatic surgery, parameters of which included superoxide dismutase (SOD),glutathione peroxidase (GSH-PX), xanthine oxidase (XO), alanine aminotransfera

5、se (ALT) and malondialdehyde (MDA) as well as morphological changes of hepatocytes.RESULTS: SOD and GSH-PX activities decreased significantly (P0.05) and very significantly (P0.01), XO and ALT activities as well as MDA concentration increased remarkably (P0.05 and P0.01), and abnormal morphological

6、changes of hepatocytes were obvious during HIRI; with treatment of LGT, the abnormal changes of all above parameters were diminished remarkably (P0.05 and P0.01). CONCLUSION: It is indicated that OFR may be one of the primary causes for HIRI, LGT can attenuate HIRI by eliminating OFR.MeSHOxygen free

7、 raddicals; Liver; Reperfusion injury; Ligustrazin氧自由基損傷可能是肝缺血再灌注損傷(hepatic ischemia-heperfusion injury, HIRI)的重要機(jī)制之一13。本研究旨在通過(guò)測(cè)定HIRI家兔及人體血漿、肝組織超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-PX)、黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase, XO)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase, ALT)活性、丙二醛(malondi

8、aldehyde, MDA)含量的變化及觀察肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化，了解川芎嗪(ligustrazin, LGT)對(duì)上述指標(biāo)的影響，探討川芎嗪抗HIRI的機(jī)理，為加強(qiáng)圍手術(shù)期肝臟的保護(hù)提供理論依據(jù)。材料和方法一、對(duì)象選擇和分組：(一)健康家兔(日本大耳白兔)20只，雌雄兼有，體重2.02.5 kg，制備HIRI模型4。隨機(jī)分為兩組：對(duì)照組(I-R+NS組)，10只，生理鹽水1.5 mL/kg,BW分別在肝缺血前20 min和再灌注即刻靜脈注入；川芎嗪組(I-R+LGT組)，10只，將生理鹽水改為鹽酸川芎嗪注射液30 mg/kg,BW(廣東省湛江制藥廠，批號(hào)880201,每支40 mg*2 mL-1

9、)，余同對(duì)照組。(二)18例肝癌患者，男13例，女5例，年齡3165歲，平均45歲，體重4061 kg，平均51 kg，均行擇期肝葉切除術(shù)。隨機(jī)分成兩組：對(duì)照組(I-R+NS組)，9例，生理鹽水0.15 mL/kg,BW分別在肝門(mén)阻斷前20 min及再開(kāi)放即刻恒速靜脈滴入(2 min內(nèi))；川芎嗪組(I-R+LGT組)，9例，將生理鹽水改為鹽酸川芎嗪注射液3 mg/kg，BW,余同對(duì)照組。兩組患者性別、年齡、體重及肝門(mén)阻斷時(shí)間均無(wú)顯著差異，具有可比性。二、樣品采集：(一)兩組家兔分別在肝缺血前，缺血45 min及再灌注45 min自頸外靜脈取血，以測(cè)定血漿SOD、GSH-PX、XO及MDA水平，

10、并在再灌注45 min迅速處死，取肝左中葉組織約100 mg，制成勻漿測(cè)定SOD、GSH-PX、XO活性及MDA含量。同時(shí)取少許肝左中葉組織行光鏡、電鏡觀察。(二)兩組肝手術(shù)患者分別在肝門(mén)阻斷前(缺血前)、阻斷25 min(缺血25 min)及再開(kāi)放25 min(再灌注25 min)自頸內(nèi)靜脈取血，以測(cè)定血漿SOD、GSH-PX、XO、ALT及MDA水平。三、檢測(cè)方法：采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定血漿SOD活性，化學(xué)比色法測(cè)定GSH-PX及XO的活性，硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA含量，賴氏法測(cè)定ALT值，前4種試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。HE染色光鏡觀察，LKB-V型超薄切片機(jī)切片，H-500

11、型透射電鏡觀察。四、統(tǒng)計(jì)處理：數(shù)據(jù)均以±s表示，采用組間、組內(nèi)t檢驗(yàn)判斷差異顯著性。結(jié)果一、兩組家兔HIRI時(shí)血漿和肝組織SOD、GSH-PX、XO活性及MDA含量的變化，見(jiàn)表1。表1兩組家兔HIRI時(shí)血漿和肝組織蛋白的SOD、GSH-PX、XO活性及MDA含量的變化Tab 1 Changs of SOD， GSH-PX， XO activities and MDA content in plasma andhepatic tissue protein during HIRI between I-R+NS and I-R+LGT(±s,n=10)GroupSOD(×

12、;16.67×10-6mol·s-1)GSH-PX(×16.67×10-6mol·s-1)XO(×16.67×10-9mol·s-1)MDA(mol/L)PlasmaControlPre-Is350±27l80.0±16.72.10±1.055.70±0.50(I-R+NS)Is 45 min ?251±31*720±14.3*3.50±1.74*6.00±0.55*Rp 45 min171±22*620±19.8*

13、4.60±1.84*7.70±0.66*I-R+LGTPre-Is350±27720±15.61.90±0.765.70±0.47Is 45 min341±24710±15.02.30±0.685.90±0.65Rp 45 min331±4268.0±15.0*2.60±0.52*6.10±0.64*Hepatic tissue(×16.67×10-9mol·s-1)(×16.67×10-9mol·

14、;s-1)（×16.67×10-9mol·s-1)(nmol/mg)Control477±8924.0±3.77.90±3.961.90±0.25（I-R+NS）I-R+LGT704±4533.0±4.84.30±2.481.40±0.23*P0.05，*P0.01,vs Pre-Is;P0.01 vs Is 45 min; P0.05,P0.01,vs control group; I-R-ischemia-reperfusion; Is=ischemia; Rp=reperfusi

15、on; NS=normal saline; LGT=ligustrazin 表2兩組患者血漿SOD、GSH-PX、XO活性及MDA含量的變化和比較Tab 2 The change and comparison of SOD, GSH-PX, XO activities and MDA content in plasma among 18 patients (±s, n=9)GroupSOD(×16.67×10-6mol·s-1)GSH-PX(×16.67×10-6mol·s-1)XO(×16.67×10-

16、9mol·s-1)MDA(mol/L)ALT(×16.67×10-9mol·s-1)ControlPre-Is102±12205±240.70±0.593.30±0.3928±8（I-R+NS）Is 25 min80±10*173±18*1.00±0.70*5.20±0.78*95±12*Rp 25 min69±15*154±18*1.50±1.1*6.80±0.41*126±15*I-R+LGTPre-I

17、s103±13205±220.80±0.513.30±0.3929±8Is 25 min98±13197±191.00±0.443.70±0.8434±9Rp 25 min89±20183±191.10±0.40*3.70±0.5841±16*P0.05，*P0.01, vs Pre-Is;P0.05， P0.01,vs Is 25 min;P0.05,P0.01, vs control group二、兩組肝手術(shù)患者HIRI期間血漿SOD、GSH

18、-PX、XO、ALT活性及MDA含量的變化，見(jiàn)表2。三、肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變：(一)光鏡下見(jiàn)，對(duì)照組肝細(xì)胞腫脹，脂肪變性、空泡變性及點(diǎn)狀壞死；川芎嗪組表現(xiàn)為散在的肝細(xì)胞腫脹、變性及點(diǎn)狀壞死，其程度、范圍均明顯輕于對(duì)照組。(二)電鏡下見(jiàn)，對(duì)照組線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，毛細(xì)膽管腔內(nèi)微絨毛稀少，川芎嗪組毛細(xì)膽管的微絨毛形態(tài)基本正常，數(shù)量不少，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹的程度和范圍均顯著輕于對(duì)照組。 討論肝缺血再灌注時(shí)，機(jī)體可通過(guò)多種途徑產(chǎn)生大量氧自由基，氧化膜磷脂中的多雙鍵不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷。而氧自由基清除劑SOD，脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)代謝產(chǎn)物MDA等是目前公認(rèn)的能較好反映體內(nèi)氧自由基水平及

19、脂質(zhì)過(guò)氧化損傷程度的間接指標(biāo)。表1和表2顯示：HIRI期間，血漿XO活性明顯升高，SOD及GSH-PX活性顯著下降，MDA水平明顯增高，尤以再灌注期為著；同時(shí)伴隨ALT值進(jìn)行性增高及肝組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)的異常變化；而且MDA水平與ALT值的變化呈顯著的正相關(guān)(r=0.444,P0.05)。表明體內(nèi)氧化系統(tǒng)被激活，抗氧化系統(tǒng)受抑制，氧自由基大量生成而清除減少，體內(nèi)氧自由基水平急劇升高，從而引發(fā)一定程度的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，以致共同造成HIRI。由此可見(jiàn)，氧自由基及其引發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)是HIRI的主要因素之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，川芎嗪組家兔肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)異常改變明顯較對(duì)照組輕；患者血漿ALT值也顯著低于對(duì)

20、照組(P0.01)。提示川芎嗪有明顯的抗HIRI作用。以往實(shí)驗(yàn)證實(shí)57，川芎嗪能增加休克及心肌缺血再灌注損傷時(shí)機(jī)體內(nèi)源性SOD、GSH-PX活性，抑制XO活性，清除氧自由基，進(jìn)而降低組織脂質(zhì)過(guò)氧化程度，有效地防治缺血再灌注損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，川芎嗪組家兔血漿及肝組織SOD、GSH-PX活性均明顯高于對(duì)照組，XO活性及MDA含量均顯著低于對(duì)照組；況且川芎嗪組患者血漿SOD、GSH-PX活性亦明顯較對(duì)照組高，XO活性及MDA含量亦顯著較對(duì)照組低。進(jìn)一步證實(shí)了川芎嗪能有效地防治肝缺血再灌注時(shí)氧自由基的損傷。當(dāng)然，川芎嗪不僅是一種氧自由基清除劑，而且也是一種鈣通道阻滯劑8。此外，川芎嗪尚能有效地抑制

21、組織缺血時(shí)血小板聚集與激活9，調(diào)節(jié)循環(huán)血中血栓素A2/前列環(huán)素的平衡，遏制“無(wú)復(fù)流現(xiàn)象”，疏通微循環(huán)，有效恢復(fù)組織灌流10，從而起到抗HIRI的作用。*浙江省教委科研基金資助作者單位：王萬(wàn)鐵徐正?溫州醫(yī)學(xué)院病理生理教研室(溫州 325003)林麗娜附屬一院麻醉科李東檢驗(yàn)系分析中心王宗敏附屬二院病理科參考文獻(xiàn)1Kunz R, Brune HA, Ziegler U, et al. Ischemia-reperfusion damage of the liver caused by free radicals-direct detection using electron spin resonance (ESR). Langenbecks Arch Chir, 1991, 376:139.2Kobayashi H, Nonami T, Kurokawa T, et al. Mechanism and prevention of