1、纖粘連蛋白介導的平滑肌細胞粘附遷移與粘著斑激酶的磷酸化【摘要】目的探討纖粘連蛋白介導的血管平滑肌細胞粘附和遷移與粘著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)的磷酸化的關系。方法不同濃度的纖粘連蛋白(fibronectin,FN)刺激培養(yǎng)的血管平滑肌細胞(smooth muscle cells,SMCs)，觀察細胞粘附反應，統(tǒng)計鋪展比率。免疫沉淀和Wstern blot分別檢測FAK及FAK磷酸化的表達量。利用改良的Boyden Chamber測SMCs遷移。結果FN有效地促進了SMC粘附，其鋪展比率、遷移細胞數均顯著高于對照(P0.05),且隨FN濃度遞增而增加。其中20、

2、40、60 g/ml組分別為(75.66.5)%、(80.95.4)%和(82.47.9)%，無組間差異，但均高于5 g/ml的(20.83.2)%和10 g/ml組的(32.84.7)%,各組遷移細胞數也從16.83.6/HFP 200增加到48.96.1/HFP 200。不同濃度FN作用后均有FAK的表達，FN10 g/ml即可致FAK磷酸化。表明FN介導SMCs粘附和遷移時伴有顯著的FAK活化。結論FN誘導平滑肌細胞粘附和遷移可能是通過FAK介導的，對其活性進行調控將有助于抑制血管損傷后內膜平滑肌細胞的遷移?！娟P鍵詞】血管平滑肌細胞； 細胞外基質； 粘著斑激酶； 粘附； 遷移Role o

3、f focal adhesion kinase phosphorylation in smooth muscle cells adhesion and migration mediated by fibronectinYin Hang, Peng Xu, Wang Lihui, et al.(Department of Cardiology, The First Hospital of Beijing University, Beijing 100034)【Abstract】ObjectiveTo investigate the role of focal adhesion kinase (F

4、AK) phosphorylation in smooth muscle cells (SMCs) adhesion and migration mediated by fibronectin (FN). MethodsCultured rat aortic SMCs were stimulated by FN. Cell adhesion and spreading were enumerated by light microscope. Content of FAK and tyrosine kinase were investigated by immunoprecipitation a

5、nd immunoblot. Cell counting for migration were enumerated in modified Boyden Chamber. ResultsWe observed SMCs adhesion and spreading stimulated by FN significantly than the control. Cell migration were also enhanced significantly. In the mean time, expression of FAK were detected and tyrosine phosp

6、horylation of FAK stimulated by at least 10 g/ml FN were also observed. It showed that tyrosine kinase activity was associated with SMCs adhesion and migration mediated by FN. ConclusionSMCs adhesion and migration induced by FN maybe mediated by FAK. To modulate tyrosine kinase activity of FAK may c

7、ontribute to inhibit SMCs migration in injured arteries.【Key words】Vascular smooth muscle cells; Extracellular matrix; Focal adhesion kinase; Adhesion; MigrationFN是構成血管壁細胞外基質(extracellular matrix,ECM)的主要成分之一，在血管損傷后內膜增殖過程中起重要作用。已有的研究發(fā)現FN在體內可以刺激SMCs的遷移和增殖，但其確切機制以及所涉及的信號轉導尚不清楚。FAK是一種非受體型酪氨酸激酶，在細胞信號轉導中占

8、重要地位，與細胞遷移和增殖密切相關1，2。本實驗擬在體外培養(yǎng)的SMCs上，探討FN介導細胞粘附和遷移對FAK磷酸化的影響。材料和方法1.細胞培養(yǎng)：取SD大鼠主動脈中膜，采用組織塊貼片法，以含15%胎牛血清的M199培養(yǎng)液(GIBCO)培養(yǎng)，傳至第5代用于實驗，用兔抗SMC-myosin抗體(SIGMA)進行SMCs免疫細胞化學鑒定。2.細胞粘附鋪展：將FN(購于北京醫(yī)科大學細胞生物學教研室)5、10、20、40、60 g/ml覆蓋于96孔培養(yǎng)板孔底，4靜置過夜，將SMCs(2103)接種于培養(yǎng)孔，孵箱內(5%CO2,37)靜置60 min后觀察粘附反應，凡圓形透亮的細胞為非貼壁細胞。鏡下計數，

9、統(tǒng)計細胞粘附鋪展比率(%)，另設無FN處理的對照。3.免疫沉淀和Western blot將SMCs(5105)接種于直接35 mm已覆蓋有FN的細胞培養(yǎng)皿，孵箱內(5%CO2,37)靜置4 h,棄去培養(yǎng)液，用D-Hanks液清洗細胞3遍，甩干，加入預冷的0.25 ml RIPA細胞裂解緩沖液，冰置20 min后用刮起細胞，連同裂解液移至EP管中，12?000 g離心20 min(4),保留上清進行蛋白定量。取10 g蛋白，加入上樣緩沖液，100變性3 min后進行SDS-PAGE,轉膜，用11?000的抗FAK多抗(Santa Cruz)進行雜交，二抗為12?000辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔

10、IgG(中山公司)，最后用增強的化學發(fā)光試劑(Santa Cruz)顯色。免疫沉淀用于檢測磷酸化FAK的表達量。另取100 g總蛋白，加入10 g FAK抗體(Santa Cruz),4反應1 h,隨后加入50 l A蛋白-Sepharose珠進行沉淀，用裂解緩沖液洗3次，加入上樣緩沖液，100變性3 min,進行SDS-PAGE,轉膜，11?000的PY99抗體雜交，二抗為12?000,用增強的化學發(fā)光試劑顯色。4.細胞遷移：先將Boyden Chamber(國產)兩室間隔的硝膜(直徑6.5 mm,8 m孔徑，Costar)兩側均覆蓋FN，濃度同上，37下放置60 min。上室加入細胞懸液(

11、6104),下室為完全培養(yǎng)液，孵箱內(5%CO2,37)靜置6 hr,取出濾膜，將上室面細胞刮除，經固定染色后，在200光鏡下細胞計數(個/HFP200)。每組3張膜，隨機6個視野/膜。5.統(tǒng)計學處理：統(tǒng)計變量以均數標準差表示，多重對比采用方差分析，值取雙側0.05,P0.05為差異具有顯著性。結果1.SMCs粘附鋪展：在經FN預處理的培養(yǎng)板中，20 min即可見部分細胞貼壁粘附，在未經FN處理的對照組中，SMC始終處于圓形的懸浮狀態(tài)。統(tǒng)計60 min的鋪展比率，FN作用后各組均顯著高于對照(P0.05),20、40、60 g/ml組分別為(75.66.5)%、(80.95.4)%和(82.4

12、7.9)%，無組間差異，但均高于5 g/ml的(20.83.2)%和10 g/ml組的(32.84.7)%,P0.05。2.細胞遷移：隨FN濃度的遞增各組遷移細胞數也逐漸增加，從16.83.6/HFP200到48.96.1/HFP200,(P0.05)。3.FAK及其磷酸化表達量：Western blot結果表明，經FN作用后各濃度組SMC中FAK均有表達，免疫沉淀后測其磷酸化表達量可見在10 g/ml FN作用后就處于高表達量，見3。討論細胞粘附遷移和增殖在多種血管損傷性疾病的病理生理過程中起重要作用。本實驗結果表明，FN作為ECM非膠原糖蛋白的主要成分有效地誘導了VSMCs的粘附鋪展和遷移

13、，體現出ECM在VSMCs轉型和內膜增殖過程中的重要作用。從細胞生物學相關研究結果來看，這一病理生理過程是受復雜且尚未完全闡明的細胞內信號轉導通路所調控。而FN與細胞膜表面相關受體相結合正是整合素介導信號轉導的起始環(huán)節(jié)。本實驗可見，FAK作為整合素與FN結合的下游信號分子，在SMCs粘附鋪展的同時也被磷酸化而活化。FAK是細胞內多條信號轉導通路的交匯點，與多種信號轉導有關，占有重要地位。它主要參與由整合素介導的信號系統(tǒng)3。在腫瘤細胞侵襲轉移中起主導作用，但它與VSMCs增殖和遷移的關系尚不清楚。結合本研究提示，FAK活化是VSMCs一系列反應的重要環(huán)節(jié)，可能是受損動脈內膜增殖過程中的重要信號分

14、子。我們通過反義FAK寡核苷酸有效抑制其活性，發(fā)現可以顯著減少SMCs的遷移和粘附。從FAK的分子結構分析，當其活化以后，第397位的酪氨酸發(fā)生自身磷酸化，成為Src家族激酶具有高親和力的結合位點，二者相結合，形成FAK/Src復合體，進一步促進其自身磷酸化，接著通過復雜的信號傳遞，激活Ras蛋白，后者活化絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)4，MAPK是一類廣泛存在于真核細胞中具有絲氨酸和酪氨酸雙重磷酸化能力的蛋白激酶，經被活化后可顯著增強c-fos和c-jun基因的表達，可見FAK作為MAPK上游的關鍵信號分子對細胞粘附增殖和遷移起著重要作用。磷脂酰肌醇-3(PI-3)激酶作為FAK磷酸化的條件

15、其作用尚有爭議5，Cospedal等6通過血小板衍生生長因子-BB(PDGF-BB)激活FAK并在促進SMC遷移時，發(fā)現其效應不依賴于PI-3激酶。本研究結果提示，ECM誘導SMCs的粘附和遷移可能是通過FAK介導的。FAK介導的信號轉導通路在這一過程中發(fā)現了重要的作用，對其活性進行調節(jié)，將有助于抑制動脈損傷后增生內膜中SMCs的遷移。(本文編輯:黃琴)尹航（北京大學第一醫(yī)院心臟科100034）汪麗蕙（北京大學第一醫(yī)院心臟科100034）彭旭（北京大學第一醫(yī)院心臟科100034）霍勇（北京大學第一醫(yī)院心臟科100034）唐朝樞（北京大學第一醫(yī)院心臟科100034）周柔麗（北京大學醫(yī)學部細胞生物

16、學教研室）參考文獻1，Akiyama SK. Integrins in cell adhesion and signalling. Hum Cell, 1996,9:181-186.2，Xu LH, Owens LV, Sturge GC. Attenuation of the expression of the focal adhesion kinase induces apoptosis in tomor cells. Cell Growth Differ, 1996,7:413-418.3，Clark EA, Brugge JS. Integrins and signal transduction pathways: the road taken. Science, 1995,268:233-239.4，Bogoyevich MA. Signalling via stress-activated MAPK in the cardiovascular system. Cardiovasc Res,2000,45:826-842.5，Reiske HR, Kao SC, Cary LA, et al. Requirement of PI-3 kinase in focal adhesion kinase-promoted cel