1、人臍帶間充質干細胞靜脈輸注小鼠的安全性何君1，2,李洋1，2,陳威1，2,郝好杰3,李名爍1，2,韓瑞紅1，2,武鑫1，2,盧星辰1，2,金翠英1，2,郭瑁12,易輝12,李曉岑12,趙穎12,武巖12,徐玉環(huán)1,21 .中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，北京，1000212 .中國醫(yī)學科學院糖尿病研究中心，北京，1000053 .解放軍總醫(yī)院生命科學院基礎醫(yī)學所，北京，100853【摘要】目的探討C57/BL6J小鼠重復多次尾靜脈輸注人臍帶間充質干細胞后的免疫反應和毒性。方法 將SPF級別的32只C57/BL6J小鼠隨機分為陰性對照組、細胞移植組，每組16只

2、，雌雄各半，細胞移植組小鼠尾靜脈注射分離培養(yǎng)的第5代人臍帶間充質干細胞，一次5X106/只，每周注射一次，連續(xù)注射4周；陰性對照組每次注射相同容積的PBS。注射后后觀察小鼠的一般癥狀，末次注射后1周、4周進行血細胞計數、血生化、免疫反應指標、臟器質量測定和組織病理學檢查。結果細胞移植組小鼠血細胞計數、血生化、臟器重量和臟器系數與對照組無顯著性差異（無形態(tài)學差別，以及免疫結果測定（P > 0.05）,臟器組織病理學在光鏡下檢查結果與對照組T 細胞亞群 CD3+、CD4 +、CD8+及 CD4+/CD8+）與對照組無顯著性差異（P> 0.05）,較對照組有顯著性差異（P 0.01）。結

3、論人臍帶間充質干細胞重復多次尾靜脈輸注 C57/BL6J小鼠是安全可行的，對受者無明顯免疫反應和毒副作用?！娟P鍵詞】 人臍帶間充質干細胞；靜脈輸注；重復多次【中圖分類號】R332A safety study of intravenous injection of human umbilical cord mesenchymal stem cells in miceHE Jun* LI Yang* CHEN Wei1.2, HAO Hao-jie3, LI Ming-shuo 1,2, HAN Rui-hong1/ WU Xin 1,2, LU Xing-chen 1.2, JIN Cui-yi

4、ng 1.2, GUO Xun 1.2, YI Hui 1.2, LI Xiao-cen 1.2, ZHAO Ying 1.2, WU Yan1,2, XU Yu-huan 1.2,1.Institute of Laboratory Animal Science , Chinese Academy of Medical Science , Beijing 100021 , China2.Diabetes research center, Chinese Academy of Medical Science , Beijing 100005 , China3.Institute of Basic

5、 Medicine Science, College of Life Science, Chinese PLA General Hospital , Beijing 100853 , ChinaAbstract Objective: To study the toxicity of intravenous injection of human umbilical cord mesenchymal stem cellsin C57/BL6J mice with repeated administrations. Methods: 32 SPF C57/BL6J mice were randoml

6、y divided into negative control group and HUMSC transplantation group, of equal gender. HUMSCs were isolated and subsequently cultured through 5 passages in vitro . 2 106 HUMSCs were injected each mice of transplantation group via tail vein once 1 week for 4 weeks, and the equal quantity PBS were in

7、jected to control group mice. Mice were euthanatized on the day of 1 week (8 mice per group) and 4 weeks(all survived mice) after the last treatment following the schedule. Toxicity was evaluated by clinical observations, pathology (blood cell counts, clinical biochemistry), immunologic consequences

8、, visceral organs weight and anatomic pathology. Results: No significant difference in hematological and biochemical parameters between HUMSC transplantation group and control group (P > 0.05). There was also no significant change in organ weight or organ coefficient between the two groups( P >

9、; 0.05). There was no significant change in the subpopulation of T-cells (the percentage of CD3, CD4, CD8 T cells, and the ratio of CD4 and CD8 T cells). HUMSC transplantation group did not show any histopathological change in the viscera organs compared to control group. Conclusion: Results have su

10、ggested that intravenous injection of HUMSCs in C57/BL6J mice with repeated administrations is safe and feasible. No side effects and immune response were found in recipients.Key words Human umbilical cord mesenchymal stem cell, Intravenous injection, Repeated administrations【作者簡介】何君(1969-),女，副研究員，博

11、士，研究方向：藥理學和毒理學【基金項目】科技部863課題 干細胞治療糖尿病的臨床前方案優(yōu)化及臨床應用研究”(2011AA020113 和 2013AA020105 ) , H一五重大新藥創(chuàng)制專項(2009ZX09303-008)863 project of stem cells to treat diabetes clinical scheme optimization and clinical application research of the ministry of science and technology ( 2011AA020113 and 2013AA020105 ) , T

12、he 11th five-year fund of drug discovery projects(2009ZX09303-008)臍帶間充質干細胞(umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs )具有多種作為種 子細胞的優(yōu)良特性，如在不同的誘導條件下可以向胰島樣細胞、肝樣細胞、神經元樣細胞、 內皮細胞等進行分化1-5,連續(xù)傳代培養(yǎng)和低溫凍存后仍具有多向分化潛能，能造血支持和 促進干細胞植入、免疫調控和自我復制，并且干細胞來源豐富、容易獲得、增殖能力強，因此人臍帶間充質干細胞被認為最具臨床應用前途6-11。有文獻報道將人臍帶間充質干細胞移植大鼠和食

13、蟹猴未見明顯毒性反應，認為人臍帶間充質干細胞異種移植是安全可行的12-14,但未見有移植到小鼠體內的安全性詳細研究，因此本實驗對C57/BL6J小鼠采用尾靜脈多次重復輸注人臍帶間充質干細胞，通過檢測輸注后不同時間點小鼠的各項生化和免疫指標，探討靜脈輸注臍帶間充質干細胞的安全性，為開展人臍帶間充質干細胞的臨床應用提供參考， 也為今后進行臍帶間充質干細胞安全性評價和在體研究選擇花費低、常規(guī)易得的實驗動物提供初步的實驗依據。1材料和方法1.1 主要試劑及儀器PE/FITC標記的大鼠抗小鼠 CD4、CD8單抗，以及Percp標記的倉鼠抗小鼠 CD3單抗 均購自BD公司；抗小鼠 CD19單抗購自eBio

14、science公司；抗小鼠IgG試劑盒（超敏二步 法免疫組化檢測試劑）購自美國GBI公司。FACSCalibur流式細胞儀（美國BD）、7100全自動生化分析儀（日本日立）、 Pentra DX120全自動血液分析儀（法國 ABX ）、OPTIPHOT-2 顯微鏡（日本尼康）。 1.2動物來源及飼養(yǎng)57周齡SPFC57/BL6J小鼠購自北京華阜康生物科技股份有限公司【 SXK （京） 2009-0004】，飼養(yǎng)于中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所新藥安全評價研究中心嚙齒類動 物屏障設施【SYXK （京）2008-0012】，飼料經60Co照射，飲用水及墊料均經高壓消毒無 菌處理，對小鼠的實驗操作

15、均于無菌超凈臺中進行。1.3 實驗材料來源人臍帶間充質干細胞由解放軍總醫(yī)院生命科學院基礎醫(yī)學所培養(yǎng)和制備成細胞懸液，使用前均經流式細胞儀檢測，細胞表面抗原符合間充質干細胞的表型特征：CD34-、CD45-、CD73-、HLA-DR -、CD90+、CD105+。具體制備及表型檢測方法見該單位發(fā)表的文章15。1.4 動物分組及干細胞輸注C57/BL6J小鼠隨機分為細胞移植組、陰性對照組，每組 16只，雌雄各半。收集培養(yǎng)的 第5代人臍帶間充質干細胞，采用PBS調整細胞濃度為2.5 X010 /L,細胞移植組每只小鼠尾靜脈注射0.2 ml/次（即5X106細胞/只/次），每周注射一次，連續(xù)注射4周；

16、陰性對照組小鼠每只尾靜脈注射0.2 mL PBS。 1.5檢測指標和方法實驗期間每天觀察一般癥狀；每周測定1次體重、攝食量。在末次輸注后1周、4周分別將兩組的一半小鼠禁食16h,從眼內眥靜脈叢采集 EDTA抗凝血進行血細胞計數和外周血T淋巴細胞亞群檢測；采集血清進行肝腎功能指標測定；對動物實施安樂死后，采集心臟、 肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦、胸腺、胰腺等進行臟器稱重（成對臟器一起稱量），并計算臟器系數（=（臟器重量 解剖當日小鼠體重）100）;采集動物肝臟左葉、左腎橫截面中部各約0.3g保存在液氮中，用免疫組化法檢查免疫復合物，其余臟器于中性10%福爾馬林固定液進行固定，取材修塊后石蠟包埋切片

17、，經蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察組織結構是否有病理變化。 1.6數據處理與統計方法本實驗所產生的體重、攝食量、臟器重量及其系數、血細胞計數、血生化指標、T細胞亞群指標等計量數據，每組以“平均值標準差”方式表示。應用 SPSS13.0統計處理軟件中獨立樣本t檢驗方法進行組間差異比較。 P 0.05認為差異有顯著性。2結果2.1 一般行為、體重、攝食量、臟器系數結果輸注干細胞過程中及末次輸注后4周內，小鼠未見明顯的異常癥狀和行為，所有小鼠均存活至實驗期結束，兩組小鼠的體重比較差異無顯著性意義（P > 0.05）,結果見表1。末次輸注后恢復1周、4周時，兩組小鼠的臟器重量及臟器系數比較差異無顯

18、著性意義（P > 0.05）,結果見表2。兩組小鼠的攝食量差異無顯著性意義（P > 0.05）（表略）。表1 注射后小鼠體重變化（mean±std）Tab 1 Changes in body weight in each group afte門njection （mean std）±實驗時間對照組（n=8）注射組（n=8）TimeControlTest0周（A次注射當天）0 week (the day of 1st injection )1周(第二次注射當天)15.9上015.70.91 week (the day of 2nd injection )2周(第三

19、次注射當天)17.70;817.40.82 weeks (the day of 3rd injection )3周(第四次注射當天)19.1上018.91.23 weeks (the day of 4th injection )4周(末次注射后1周)20.3上020.51.04 weeks (1 week after last injection )5周(末次注射后2周)20.8上121.31.05 weeks (2 weeks after last injection )6周(末次注射后3周)22.00;821.80.86 weeks (3 weeks after last injectio

20、n )7周(末次注射后4周)22.90;822.60.87 weeks (4 weeks after last injection )23.40;623.40.7注：實驗4周及以前各組的n=16,4周以后各組n=8。Note: n=16 of each group in the first 4 weeks, n=8 of each group after 4 weeks.2.2 血細胞計數結果末次輸注后恢復1周時，注射組的HGB （血紅蛋白）、CHC （平均紅細胞血紅蛋白濃度）PLT （血小板計數）、BAS （嗜堿性粒細胞）與對照組有統計學差異（ P 0.05或P 0.01）;恢復4周時，注射

21、組的 WBC （白細胞計數）、MCV （平均紅細胞容積）、RDW （紅細胞體積分布寬度）與對照組有統計學差異（ P 0.05或P 0.01）;其它血細胞計數指標無顯著性差 異性（P > 0.05）,結果見表3。表2 小鼠末次注射后1周、4周的臟器重量和臟器系數Tab 2 Organ weight and organ coefficient in each group in 1 week and 4 weeks after last injection單位Unit:14或臟器系數(1 week after last(4 weeks after lastOrgan weight orinje

22、ction )injection )對照組注射組對照組注射組Organ coefficient(n=8)(n=8)(n=8)(n=8)ControlTestControlTest腦 Braing0.37 M.040.36 =0.030.41 ：0.020.41 d0.02心臟Heartg0.08 M.010.09 =0.020.11 ：0.030.1 W.02肝臟Liverg0.8 =0.160.83 =0.130.92 ：0.050.94 d0.09脾臟Spleeng0.06 M.010.05 =0.010.06 ：0.010.06 M.01肺臟Lungg0.12 d0.030.13 =0.

23、020.16 ：0.020.14 d0.03胸腺Thymusg0.04 M.020.03 =0.010.04 ：0.020.04 d0.01腎臟Kidneyg0.21 M.050.23 =0.030.29 ：0.030.26 M.03月百系數 Brain coefficient%1.79 M.251.77 =0.181.77 ：0.091.74 d0.08心臟系數 Heart coefficient%0.34 M.150.44 =0.070.47 z0.110.44 d0.07肝臟系數 Liver coefficient%3.88 M.934.05 =0.633.98 ：0.234.03 d0

24、.41脾臟系數 Spleen coefficient%0.28 M.030.23 =0.060.26 ：0.040.25 d0.03肺臟系數 Lung coefficient%0.59 M.170.62 =0.120.67 =0.10.61 =0.11胸腺系數 Thymus oefficient%0.19 M.120.14 =0.050.17 ：0.060.17 d0.05腎臟系數 Kidney coefficient%1.02 M.251.1 ：0.151.25 ：0.141.11 ：0.13表3小鼠末次注射后1周、4周的血細胞計數指標結果 (mean±std)Tab 3 Chan

25、ges in hematological parameters in each group in 1 week and 4 weeks after last injection (mean std)±末次注射后1周)末次注射后4周)(1 week after last(4 weeks after lastinjection )injection )指標index單位unit對照組 (n=8) Control注射組(n=8) Test對照組 (n=8) Control注射組(n=8) Test白細胞計數WBCX109/L5.7 0.84.7 14.5 1.15.9 0.7*紅細胞計數R

26、BCX1012/l10.3 0.310.1 0.39.5 1.19.2 1.2血紅蛋白HGBg/L174+6167+5*176±14163 ±13紅細胞比容HCTL/L0.52 d0.020.52 W.020.48 =0.050.46 =0.06平均紅細胞體積MCVfL51 ±151 ±151 ±150 ±1*平均紅細胞血紅蛋白含量 MCHPg16.9 W.316.7 =0.318.5 :0.717.9 ±1.1平均血紅蛋白濃度 MCHCg/L333出325 ±6*366 ±11359 ±20紅

27、細胞寬度RDW%11.8 =0.312i0.711.1 =0.511.7 86*血小板計數PLTX109/L593 %2683 立0*846 :94875 ±113平均血小板體積 MPVfL5.3 =0.25.2 W.25.4 =0.25.7 =0.6淋巴細胞百分比LYM%74.6 B573.2 6078.3 -3.681.5 M.4單核細胞百分比MON%0.1 =0.10.0 W.10.0 :0.00.1 =0.1中性粒細胞百分比 NEU%22.1 B122.8 =2.518.0 -3.115.8 B5嗜酸性粒細胞百分比 EOS%2.2 ±1.41.9 ±1.5

28、1.6 401.5 ±1.1嗜堿性粒細胞百分比 BAS%1.1 =0.21.9 =0.9*1.9 411.3 =0.7注：與同時間點的對照組比較，*, P 0.05;* , P 0.01。Note : Compared with a control group at the same point time , * , P 0.05; * , P 0.01.2.3 血清生化結果末次輸注后恢復1周時，注射組的AST （天門冬氨酸氨基轉移酶）、BUN （尿素氮）、A/G （白/球比）與對照組有統計學差異（P 0.05或P 0.01）;恢復4周時，注射組的ALB （白 蛋白）、TBIL （總

29、膽紅素）、A/G （白/球比）與對照組有統計學差異（ P 0.05或P 0.01）; 其它肝、腎功能指標無顯著性差異性（P > 0.05）,結果見表4。但以上有顯著性差異的指標均在文獻報道的正常值范圍內，與對照組比較，差異無生物學意義。表4 小鼠末次注射后1周、4周的血生化指標變化（meanistd）Tab 4 Changes in serum biochemical parameters in each group in 1 week and 4 weeks after last injection （mean std：指標index單位 unit1(1 week after last

30、 injection )4(4 weeks after last injection )對照組 n=8Control注射組 n=8)Test對照組 n=8)Control注射組 n=8Test丙氨酸氨基轉移酶ALTU/L39 ±737±927±527+5天門冬氨酸氨基轉移酶ASTU/L118±22146+26*110±31110±40總蛋白TPg/L54.25 ±1.4053.48 =2.6953.62 ±1.7051.54 J3.00白蛋白ALBg/L34.28 ±1.5634.76 ±1.9

31、133.92 ±1.2332.29 ±1.63*球蛋白GLOg/L19.98 ±1.8418.73 =2.0819.70 =0.9619.25 ±1.81總膽紅素TBILmol/L0.91 力.361.10 力.321.00 =0.031.23 =0.13*堿性磷酸酶ALPU/L149您148 ±17120 ±19119±I3尿素氮BUNmmol/L11.80 ±1.579.92 ±1.36*10.54 =0.9110.78 ±1.09肌酊CREmol/L14.96 ±1.9114.2

32、2 ±1.5815.41 J3.3714.04 =2.17白球比A/G1.73 力.222.00 =0.09*1.72 =0.091.97 =0.15*注：與同時間點的對照組比較， *, P 0.05; * , P 0.01。Note: Compared with a control group at the same point time , * , P 0.05; * , P 0.01.2.3 外周血T淋巴細胞亞群檢測結果末次輸注后恢復1周、4周，輸注組小鼠的CD3 +、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+均值與對照 組比較接近，無顯著性差異（P > 0.05）,結果見表

33、5。表5小鼠末次注射后1周、4周的外周血T淋巴細胞亞群變化（mean std）Tab 5 Changes of T cell subsets of peripheral blood in each group in 1 week and 4 weeks after last injection （mean std）指標index1(1 week after last injection )4(4 weeks after last injection )對照組(n=8Control注射組（n=8）Test對照組(n=8)Control注射組（n=8TestCD3+ (%)49.69 =6.154

34、7.14 i8.1843.45 67947.54 £.40CD4+ (%)32.91 J5.7930.84 67428.61 63230.89 £.21CD8+ (%)16.65 ±.9416.08 *8916.72 =2.3917.03 *78CD4+/CD8 +2.00 0.441.92 0.351.75 0.371.84 0.422.4 組織病理學及免疫復合物檢查結果末次輸注后恢復1周、4周，輸注組小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦、胸腺、胰腺、 性腺等受檢臟器， 與對照組小鼠組織在光鏡下病理學觀察結果無明顯差異。 對小鼠肝臟及腎臟中免疫復合物的檢查采用

35、超敏二步法免疫組化法，按照試劑盒（貨號pv-9002 ）的操作說明進行，將組織切片后，用 3% H2O2去離子水孵育10分鐘，以阻斷內源性過氧化物酶，然后滴加一抗、孵育、洗滌、顯色等。末次輸注后恢復1周、4周，兩組小鼠的肝臟及腎臟均未見IgG沉積。3. 討論隨著對間充質干細胞生物學特性及功能的深入研究， 已經可以從多種組織中分離出間充質干細胞， 但自體間充質干細胞輸注由于受到來源有限、 數量較少， 以及隨著年齡增長間充質干細胞增殖及多向分化能力均下降等局限， 難以滿足臨床治療的需要， 因而來源及數量不受限制、 免疫原性低的干細胞成為理想的治療細胞。 由于臍帶間充質干細胞具有來源廣泛、 易于獲得

36、、 取材方便、 排除了倫理道德方面限制等優(yōu)點， 成為了臨床進行同種異體移植的研究熱點。 近年的國內外許多研究證實，人臍帶間充質干細胞不表達HLA-DR 5,10 ，低表達移植相關的細胞表面標記CD80 、 CD86 、 CD40 7-8 ，免疫原性低，同種異體移植無免疫排斥反應或反應較弱，已有異種移植治療肝損傷、腎臟疾病、糖尿病足及自身免疫性疾病方面的研究報道 3,10,14-15 。對于不同來源、 不同制取和培養(yǎng)方式、 不同體外誘導方式得到的 人 臍帶間充質干細胞， 重復多次輸注受體是否安全， 是否對機體產生免疫原性， 對于不同疾病采用怎樣的細胞數量、 體積及移植時間是安全有效的， 這些問題

37、都必須在臨床治療前進行動物體內試驗探討， 但由于動物與人的種屬差異性， 沒有明確合適的實驗動物種屬， 因此對這些方面的詳細研究目前較少。 張學峰等 12-14 將人臍帶間充質干細胞異種輸注到大鼠或食蟹猴體內， 發(fā)現無明顯的臟器毒性作用和明顯的免疫原性， 因此這兩種動物可考慮用于人臍帶間充質干細胞的安全性和治療效應評價的實驗動物， 但食蟹猴購買價格高， 食蟹猴和大鼠實驗時需要提供的人臍帶間充質干細胞數量大， 無疑增加了實驗成本。 目前國內外雖有利用小鼠進行間充質干細胞體內研究， 但 主要應用免疫缺陷小鼠如SCID或NOD-SCID進彳T 11，但這些小鼠購買費用高，而且對飼養(yǎng)環(huán)境要求較高， 如果

38、有常規(guī)易得、 供試品消耗量較小的動物能進行以上相關實驗， 更符合動 物倫理的3R原則，因此本實驗采用C57/BL6J小鼠進行了探討。目前較多研究認為充質干細胞輸注患者所需細胞數為（1.02.0） 106/kg11,18,按照人與小鼠等效體表面積折算方法，25g左右的小鼠應輸注細胞5X105/只，本實驗以相當于人臨床擬用劑量的10倍劑量5X106/只靜脈重復注射小鼠四次，結果發(fā)現注射組小鼠輸注干細胞后的AST、 BUN 、 A/G 、 ALB 、 TBIL 等血清生化指標均值，以及部分血細胞計數指標，如 HGB 、CHC 、 PLT、 BAS、 WBC 、 MCV 、 RDW ，雖然與對照組有統

39、計學差異，但注射組小鼠以上指標均在文獻報道的正常值范圍內， 差異無生物學意義； 小鼠輸注人臍帶間充質干細胞后對攝食量、體重、 T 細胞亞群、臟器系數等也不產生明顯影響，小鼠的肝臟、腎臟組織未見免疫復合物，組織臟器也未出現病理學改變，表明靜脈多次輸注人臍帶間充質干細胞，對C57/BL6J 小鼠的肝、腎功能，以及其它內臟無明顯毒性作用，也免疫原性，重復多次異種靜脈移植人臍帶間充質干細胞是安全可行的， 同時提示 C57/BL6J 小鼠可作為人臍帶間充質干細胞進行安全性和效應學研究的實驗動物之一。參考文獻1 Baksh D, Yao R, Tuan RS. Comparison of prolifer

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