1、細菌耐藥機理及其耐藥細菌的細菌耐藥機理及其耐藥細菌的檢測與臨床檢測與臨床 長江大學(xué)臨床學(xué)院 檢驗科艾彪全球面臨主要細菌耐藥問題全球面臨主要細菌耐藥問題 MRS(Methicilln-Resistant Stapylococci) 耐甲氧西林葡萄球菌包括MRSA，MRSE等。 VIA(Vancomycin-Intermediate Staphyococcus Aurus) 萬古霉素中介的金葡菌 VRE(Vancomycin-Resitant Enterococci) 萬古霉素耐藥的腸球菌 ESBL(Extended-Spectrum B-lactamse) 超廣譜酶(大腸/肺克) Inducib

2、le Ampc (Ampc基因突變，高產(chǎn)量，50%左右三代頭孢耐藥) 陰溝、產(chǎn)氣、聚團等腸桿菌屬。 Non-Fementatives(非發(fā)酵菌) 銅綠、不動、嗜麥芽 PRP(Penicillin-Resistant S、P) 青霉素耐藥的肺炎球菌。 耐藥的主要機理耐藥的主要機理l產(chǎn)生滅活酶l靶位改變l低通性屏障作用(膜通透性下降及生物被膜)l主動外運l細胞缺乏自溶酶，對抗菌藥物產(chǎn)生耐受性 對各類抗生素的主要耐藥機制對各類抗生素的主要耐藥機制 抗菌藥物 耐藥機制 -內(nèi)酰胺類 細胞壁通性降低，與PBPs親和力與結(jié) 合力降低，產(chǎn)-內(nèi)酰胺酶，自溶 氨基甙類 攝入減少，產(chǎn)鈍化酶，核糖體30S亞基改變，E

3、H下降和PH下降，降低氨基甙活性 大環(huán)內(nèi)脂類 核糖體50S亞基改變，局部PH下降可降低活性 四環(huán)素類 藥物外流加快，細菌體內(nèi)積蓄減少，核糖體30S亞基 改變，產(chǎn)生滅活酶 氯霉素 攝入減少，產(chǎn)生氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶 林可類 核糖體50S亞基改變 萬古霉素 不易產(chǎn)生耐藥性 喹諾酮類 細胞外膜OMPF降低，攝入減少，膜傳導(dǎo)通道改變胞內(nèi)積蓄減少等 最多見的耐藥機制最多見的耐藥機制l產(chǎn)生滅活酶是最多見的耐藥機制，可通過細菌的基因突變引起，最主要是從其他細菌通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)，結(jié)合，異位而獲得。l主要的滅活酶有二類： -內(nèi)酰胺酶， 氨基甙類鈍化酶。 （一）（一）.-內(nèi)酰胺酶：內(nèi)酰胺酶： 主要分類方法有二種 ： A

4、.分子生物學(xué)分類：根據(jù)末端氨基酸序列及編碼基因位點 ; B.功能分類：根據(jù)酶等電點、水解底物、是否被酶抑劑所抑制及分子結(jié)構(gòu)類別（見表1） 表表1 1998年年Bush分類分類 -內(nèi)酰胺酶種類 克拉維酸、舒巴坦作用 Group1：頭孢菌素酶 （誘導(dǎo)酶） 不能抑制 Group2a：青霉素酶 能抑制 Group2b：廣譜酶 能抑制 Group2b：超廣譜酶 能抑制 金屬酶： 不能抑制 超廣譜超廣譜 -內(nèi)酰胺酶內(nèi)酰胺酶(Estended-spectrum -latamases,ESBLs) ESBLs是質(zhì)粒介導(dǎo)的，為TEM-1，TEM-2和SHV-1的突變酶，包括TEM-3到TEM-26，SHV-2S

5、HV-6共近30種，與TEM-1，TEM-2和SHV-1相比，僅有1到4個氨基酸的不同，由在分子質(zhì)粒編碼的，質(zhì)粒分子量大約在23Kbs到100Kbs之間，能夠被棒酸所抑制，屬于A類酶(分子生物學(xué)分類)，可以通過結(jié)合試驗轉(zhuǎn)給敏感菌。 1983年，歐洲KnotheH在肺炎克雷轉(zhuǎn)給敏感菌，1983年，歐洲KnotheH在肺炎克雷伯桿菌中發(fā)現(xiàn)了這種能滅活三代頭孢菌素的SHV-1衍生物，現(xiàn)已在英國引起多次的醫(yī)院感染爆發(fā)流行。 產(chǎn)產(chǎn)ESBLs菌株的耐藥特點菌株的耐藥特點 廣譜酶（TEM-1，TEM-2，SHV-1）主要滅活青霉素和窄譜頭孢菌素（一、二代頭孢），三代頭孢菌素對其穩(wěn)定，而ESBLs能分解三代頭

6、孢（頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢哌酮、頭孢曲松）以及單環(huán)酰胺類的氨曲能，但大多數(shù)產(chǎn)ESBLs菌株對復(fù)合三代頭孢（如舒普深）敏感，幾乎所有ESBLs菌株對泰能敏感 表表2 產(chǎn)產(chǎn)ESBL菌株的治療抗菌藥物選擇菌株的治療抗菌藥物選擇 碳青霉烯類 首選藥物 -內(nèi)酰胺類 有效（必須給予相當(dāng)高的劑量） 抗生素+-內(nèi)酰胺酶抑劑復(fù)方 有效喹諾酮類 如果藥敏結(jié)果顯示敏感則可 氨基糖甙類 能有效產(chǎn)產(chǎn)ESBL菌株的治療建議菌株的治療建議l經(jīng)驗治療可能產(chǎn)ESBLs株導(dǎo)致的感染，必須包括一個碳青霉烯類抗生素聯(lián)合應(yīng)用一個氨基糖甙類抗生素，直到細菌敏感結(jié)果知道時。l根據(jù)臨床藥敏報告進行推測，對多種三代頭孢菌素耐藥的需考慮產(chǎn)ES

7、BL有可能(有共識即若確定為產(chǎn)ESBL菌株，即使普通三代頭孢及氨曲南藥敏是敏感的也要報耐藥)。l碳青霉烯類復(fù)合三代頭孢菌素(但需劑量大一點，注意Ampc基因)。l 阿米卡星(不同地區(qū)可不一致)。幾種新的幾種新的-內(nèi)酰胺酶內(nèi)酰胺酶l耐酶抑制劑廣譜酶（IRT，IRBLs，18種）l水解氨芐西林、羧芐西林，對哌拉西林和頭孢類仍敏感 ，l克拉維酸、舒巴坦的抑制效果不好，舒巴坦對IRT差 ，l他唑巴坦仍有抑制作用 ，哌拉西林/他唑巴坦復(fù)方仍有活性作用 酶抑制劑酶抑制劑:l.克拉維酸、舒巴坦、他唑巴坦.l.對TEM型 三種均有抑制作用，作用相仿 l.對SHV型 他唑巴坦、克拉維酸強于舒巴坦 產(chǎn)酶細菌對酶抑

8、制劑不敏感的原因產(chǎn)酶細菌對酶抑制劑不敏感的原因 l 1.TEM-1產(chǎn)量過多l(xiāng) 2.外膜蛋白改變l 3.1型酶（AmpC）l 4.1 2 型酶并存l 5.2br（IRT）l 6.2d（OXA-11）TYPE -lacl產(chǎn)生機制 ：染色體上的Amp（通常處于被抑制狀態(tài)）突變，去阻遏，活化編碼產(chǎn)生AmpC酶。l誘導(dǎo)機制： BPBs4，7a，7b（Sanders CC，1977）l近來還發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶 TYPE -lac來源來源l染色體上的AmpC轉(zhuǎn)移到質(zhì)粒，使ECO和KPN的臨床分離株獲得質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶。l此外可見于：Salmonella spp ，P.Mirabilis.C.fre

9、undii。l 染色體上的基因來自腸桿菌屬、枸櫞酸桿菌屬和假單胞菌屬。l已報告17種，其中出現(xiàn)最多、分布最廣的是CMY-2。 TYPE -lac特點特點l往往在抗生素治療過程中誘導(dǎo)產(chǎn)生，并有可能選擇出持續(xù)、大量產(chǎn)酶的耐藥菌株（去阻遏突變株）l AMP是許多潛在的酶誘導(dǎo)劑之一，但沒有選擇去阻遏突變株的作用。l 許多3-ceph是弱誘導(dǎo)劑，但有選擇去阻遏突變株的作用。臨床意義臨床意義l隨著新型頭孢菌素的使用特點增加，能產(chǎn)生TYPE 1 -Lac，導(dǎo)致對-內(nèi)酰胺類多重耐藥的菌株迅速出現(xiàn)并成為醫(yī)院感染的重要病原菌。lICU和灼傷等重癥患者對腸桿菌、沙雷菌和銅綠假單胞菌等能產(chǎn)生TYPE 1-Lac的細菌

10、高度易感，成為上述病區(qū)的嚴(yán)重問題。l只有嚴(yán)格控制三代頭孢菌素的使用，才能控制這一嚴(yán)重問題。治療治療 碳青霉烯類 四代頭孢菌素：頭孢吡肟、頭孢匹羅 小結(jié)小結(jié):l.AmpC酶（Bush1型酶）可引起GNB對三代頭孢菌素和單酰胺類抗生素的耐藥，對抑制劑不敏感，對IMP敏感。l2.AmpC酶具有一定的誘導(dǎo)性。l3.AmpC酶不僅可由染色體且可由質(zhì)粒介導(dǎo)。l4.AmpC表達的調(diào)控機制未明，據(jù)認(rèn)為與ampR、ampD、ampE、ampG有關(guān)。 （二）（二）. 氨基糖甙類鈍化酶氨基糖甙類鈍化酶 l1.氨基糖甙類抗生素對鈍化酶穩(wěn)定性不同，耐藥率不同 ;l2.慶大穩(wěn)定性較差，耐藥率高 ;3.阿米卡星、奈替米星穩(wěn)

11、定性高，耐藥率低 ;l4.尤其是奈替米星，對50%以上的慶大藥株有效;l5. 氨基甙類鈍化酶：磷酸轉(zhuǎn)移酶、乙酰轉(zhuǎn)移酶、核苷轉(zhuǎn)移酶 ;氯霉素乙?；?紅霉素-O-磷酸化酶;克林霉素-O-核苷化酶。（三）（三）.靶位改變靶位改變1.原有靶位的親和力改變 PRP：PBP1a,2a,2b,2x的親和力下降，造成對青霉素及頭孢菌素耐藥 2.出現(xiàn)新的替代途徑 8TKDa-PBP1- 80 -PBP2-PBP2a(PBP,278Kda) 75 -PBP，3- 70 -PBP3- 41 -PBP4- 3.任何抗菌藥物均可由靶位改變產(chǎn)生耐藥。 （四）（四）.低通透性屏障作用低通透性屏障作用 1.外膜通透性降低

12、A.孔蛋白(Porin)組成及數(shù)量改變有關(guān)大腸埃希菌OmpF和OmpC (耐藥OmpF下降) B.D2微孔蛋白(47KDa) 2.生物被膜(Biofilm，BF)的形成 BF組成：多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂蛋白等 BF與細菌耐藥 休眠狀態(tài)，膜通透性下降； BF屏障作用 BF吸附滅活菌 BF吸附抗菌藥物 BF使細菌獲得足夠時間，開啟耐藥基因 （五）（五）.主動外運主動外運 l操縱于MexA-MexB-OprM編號的三種蛋白組成的復(fù)合體。lMexA-40KD質(zhì)膜蛋白(膜融合蛋白) MexB-108KD主動外運蛋白 OprM-50KD外膜蛋白。四、細菌耐藥性的變遷四、細菌耐藥性的變遷 細菌耐藥性隨著時代

13、的變遷，其中最重要的一個原因是抗藥藥物的濫用，篩選出耐藥株，并增加細菌突變的壓力。因此必須了解細菌耐藥狀況，選擇合理抗菌藥物進行治療。 五、常見細菌耐藥及治療五、常見細菌耐藥及治療1.肺炎球菌肺炎球菌(鏈球菌屬的問題鏈球菌屬的問題) 注意青霉素耐藥問題(國內(nèi)約5%) l（1）青霉素MIC測定 敏感 中介(低耐)用 耐藥 . MIC0.06mg/L 0.121mg/L 2mg/Ll(2)耐藥機理: 未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)-內(nèi)酰胺酶菌株， 耐藥是由于靶位改變即PBP2b,2x親和力下降; l(3)治療：大劑量青霉素 高劑量阿莫西林 頭孢噻肟 頭孢曲松 萬古(去甲萬古) 利福平 2.耐甲氧西林葡萄球菌（耐甲氧西林

14、葡萄球菌（MRS） 定 義：耐甲氧西林、耐苯唑西林且多重耐藥的葡萄球菌。 耐藥機理：MecA編碼PBP2a及PBPs改變。 意義：對目前所有的-內(nèi)酰胺類耐藥，通常對氨基甙類、大環(huán)內(nèi)酯類、克林霉素和四環(huán)素多重耐藥。 治療：1.MRS輕度感染：利福平 ,SMZ- TMP,環(huán)丙沙星; 2.MRS嚴(yán)重全身感染：首選萬古霉素 3.腸球菌腸球菌 注意是否對慶大霉素高耐藥？是否耐萬古霉素？l(1)慶大高耐：慶大MIC1000mg/L 萬古耐藥：萬古MIC4mg/L 萬古耐藥方式：VanA(萬古、替考拉寧R)， VanB (萬古R，替考拉寧S) l(2)耐藥機理： 慶大高耐：產(chǎn)APH (2，)AAC (6，)

15、氨基甙鈍化酶耐萬古：粘肽結(jié)構(gòu)靶位改變(D丙氨酰D丙氨酸被D丙氨酰D乳酸取代) l(3)治療： 基本治療方式是青霉素或氨芐西林慶大霉素。 慶大高耐：需用萬古或去甲萬古，有時加用利福平。 萬古耐藥：目前尚無有效治療方法。 VanA：非R，非氨基甙高R 青或氨芐慶大:青R，非氨基甙高R 頭孢曲松慶大，環(huán)丙沙星慶大 VanB:非氨基甙高R 替考拉寧慶大霉素, 氨基甙高R 替考拉寧氟喹諾酮 多重耐藥腸球菌 鏈陽菌素(Streptogramin) 注意事項：注意事項： 腸球菌對頭孢菌素、氨基甙類、克林霉素和TMP/SMZ可在體外顯示活性但臨床無效。因此上述藥物在此禁止使用。4.銅綠假單胞菌銅綠假單胞菌 l

16、 膜通透性低，生物被膜形成，產(chǎn)生各種滅活酶及主動外排系統(tǒng)，對許多抗菌藥物自然耐藥，僅下列藥物可供選擇： 哌拉西林、特美汀、他唑西林、頭孢哌銅、舒普深、頭孢他啶、氨曲能、泰能、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、奈替米星、阿米卡、妥布霉素。 可單用或聯(lián)合應(yīng)用上述藥物。l從國內(nèi)外耐藥調(diào)查資料看，對綠膿桿菌作用最強的是泰能與頭孢他啶，且泰能與其它抗銅綠假單胞菌藥物間一般不會出現(xiàn)交叉耐藥。銅綠假單胞菌對泰能的耐藥主要是碳青霉烯類的特異通道(47KD的D2微孔蛋白)的關(guān)閉和金屬酶的產(chǎn)生。5.大腸桿菌和肺克大腸桿菌和肺克 產(chǎn)各種內(nèi)酰胺酶比例幾乎為100，對內(nèi)酰胺抗生素不同程度耐藥。l1)產(chǎn)青霉素酶：分解阿莫西林或青霉素等

17、，用復(fù)合青霉素等。l2)產(chǎn)頭孢菌素酶：主要分解的是一、二代頭孢，一、二代頭孢大多耐藥，加酶抑制劑能逆轉(zhuǎn)，三代頭孢、頭霉素敏感。 l3)廣譜酶(TEM1，2，SHV1)：分解青霉素類、二代頭孢，能被酶抑制逆轉(zhuǎn) 4)ESBL(超廣譜酶)：能分解青霉素類、頭孢菌素類及氨曲南，一旦確定為產(chǎn)ESBL，青霉素類、頭孢類及氨曲南均報耐藥，主要出現(xiàn)在院內(nèi)感染菌株。 國外對三代頭孢耐藥的大腸與肺克的相關(guān)資料國外對三代頭孢耐藥的大腸與肺克的相關(guān)資料lCAZ-R的克雷伯菌菌血癥的危險因素 特點 血中分離菌 CAZ-R（31）CAZ-S（31） P7 養(yǎng)老院住戶 15 3 0009 封閉導(dǎo)尿管 25 5 0.0000

18、1 G+J管 14 1 0.0004 中心靜脈插管 27 11 0.0001 事先用過抗生素 20 8 0.001 頭孢他啶或氨曲南 11 0 0.009 lCAZ-R克雷伯菌的交叉耐藥 1990 1993 慶大/妥布 62% 73% 喹諾酮 39.8% 51.8% 在CAZ-S克雷伯菌 5% 5% 高發(fā)的交叉耐藥性是這種細菌難易治療的原因之一。 在1993年，耐頭孢他啶的克雷伯菌中，73%的菌株耐慶大霉素或妥布霉素，而超過半數(shù)的菌株耐喹諾酮類。相反，在對頭孢他啶敏感的克雷伯菌中，同時兩個藥的耐藥率都很低。 l在72小時菌血癥期間，在適當(dāng)治療和無適當(dāng)治療的對頭孢他啶耐藥的病人的結(jié)果.很多情況下

19、我們很難證實細菌的MIC值與所選用抗生素療效之間具有明確的關(guān)系。l這項研究，此關(guān)系得到證實，因為在這些耐頭孢他啶的菌癥病人中，適當(dāng)治療的效果要比后來證實為不適治療的效果好。在適當(dāng)治療病人中，18/19存活；相反，事后證實為不適當(dāng)治療即使用了三代頭孢菌的病人中，5/12人死亡，2組間具有顯著差異。適當(dāng)治療組使用的亞胺培南聯(lián)合或不聯(lián)合氨基糖甙類。l整篇文章證明，碳青霉烯類抗生素是治療ESBL的最好藥物。 l四代頭孢：頭孢吡肟/頭孢匹羅對I型酶高活性是由于：快速穿過外膜蛋白，對I型酶穩(wěn)定，對PBP高親和力。但許多產(chǎn)ESBL的菌株耐四代頭孢菌素，所以用它們治療產(chǎn)ESBL株的感染是不安全的。 6.志賀菌屬、沙門菌屬志賀菌屬、沙門菌屬 注意：不應(yīng)報告選用一、二代頭孢及氨基糖甙類，因為體外實驗可表現(xiàn)有活性，但臨床無效。 7.嗜麥芽窄食單孢菌嗜麥芽窄食單孢菌 對泰能天然耐藥，可供選擇的有：SMZco,阿米卡星，特美丁，喹諾酮類。 8.不動桿菌不動桿菌 l 對一、二代頭孢，半合成廣譜青霉素，慶大霉素耐藥率達70-80%，對三代頭孢菌素耐藥率可達50%。但這是條件致病菌，一般出現(xiàn)于院內(nèi)感染，主要是三代頭孢選擇壓力產(chǎn)生。l 治療上至少選用復(fù)合三代頭孢，但以亞胺培南、阿米卡星、環(huán)丙沙星敏感率較高