,糖尿病動物模型綜述,.,引言,糖尿病(diabetesmellitus,DM)屬中醫(yī)學(xué)消渴范疇,是以多飲、多食、多尿、身體消瘦,或尿濁、尿有甜味為特征的疾病?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為,糖尿病是一種由多種病因引起的慢性代謝性疾病,是由于體內(nèi)胰島素缺乏,或拮抗胰島素的激素增高,或胰島素在靶細(xì)胞內(nèi)不能發(fā)揮正常生理作用而引起葡萄糖、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)代謝紊亂的綜合征。,臨床上分為胰島素依賴型糖尿病(IDDM)即1型和非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)即2型兩種類型。為探清糖尿病病因,建立理想的DM動物模型是十分必要的,動物模型也可以篩選降糖藥物,可以為中醫(yī)藥治療糖尿病提供實驗依據(jù)。人類疾病的動物模型(animalmodelofhumandisease)是指各種醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中建立的具有人類疾病模擬表現(xiàn)的動物。原則：相似性，重復(fù)性，可靠性，適用性和可控性，易行性和經(jīng)濟(jì)性。,注意事項：（1）注意模型要盡可能再現(xiàn)所要求的人類疾??；（2）注意所選用動物的實用價值；（3）注意環(huán)境因素對模型動物的影響；(4)不能盲目地使用近交系動物,不然會導(dǎo)致不能控制的因素進(jìn)入實驗；（5）動物進(jìn)化的高級程度并不意味著所有器官和功能接近于人的程度；（6）正確地評估動物疾病模型。目前,DM動物模型主要分為3類:藥物誘發(fā)性DM動物模型、自發(fā)遺傳性DM動物模型和轉(zhuǎn)基因DM動物模型。,1藥物誘發(fā)的DM動物模型,化學(xué)藥物誘導(dǎo)法是指運用化學(xué)藥物損傷胰島B細(xì)胞導(dǎo)致胰島素缺乏而引起實驗性糖尿病,是應(yīng)用于藥理學(xué)研究的經(jīng)典方法。化學(xué)藥物誘導(dǎo)的糖尿病具有發(fā)病率高、造模時間短、發(fā)病時間整齊和病情的嚴(yán)重程度較統(tǒng)一等優(yōu)點,常用的藥物有四氧嘧啶和鏈脲佐菌素。,1.1四氧嘧啶誘發(fā)dm,四氧嘧啶(Alloxan)是一種特異的胰島細(xì)胞毒劑,可選擇性地?fù)p傷多種動物的胰島B細(xì)胞,引起實驗性糖尿病。它常用于制備1型糖尿病動物模型。造模方法：給動物一次性靜脈或腹腔注射1%5%的Alloxan水溶液100200mg/kg。機(jī)制：Alloxan是自由基活性劑,其所產(chǎn)生的H2O2等負(fù)離子自由基能選擇性地直接損傷胰腺細(xì)胞的DNA,引起胰腺細(xì)胞的死亡,胰島素合成受阻,引起高血糖。優(yōu)點：用藥量少,操作方法簡便且價廉。由血漿半衰期僅12min,故能快速成模,且注射速度越快成模率越高。缺點：大劑量的Alloxan可致動物酮癥酸中毒而死亡,可致肝、腎組織中毒性損害。因此,使用Alloxan制備糖尿病模型時要嚴(yán)格控制劑量。注意事項：Alloxan水溶后不穩(wěn)定,應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配。,1.2鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)誘發(fā)dm,STZ是一種藥效強(qiáng)大的烷化劑,能干擾葡萄糖的轉(zhuǎn)運,影響葡萄糖激酶的功能,誘導(dǎo)DNA雙鏈的斷裂。造模方法：(1)遲發(fā)型:大鼠第1天腹腔注射福氏佐劑015mL,次日按25mg/kg腹腔注射STZ溶液,每周1次,連續(xù)3周。此模型接近人類1型糖尿病。(2)速發(fā)型:動物喂以高糖高脂飼料12個月，誘導(dǎo)出胰島素抵抗后,按2530mg/kg腹腔注射STZ,一周后斷尾取血測空腹血糖或口服葡萄糖耐量試驗。給糖調(diào)節(jié)受損動物,繼續(xù)飼高糖高脂飼料可出現(xiàn)高血糖癥、尿酮尿酸癥和/三多一少癥狀,進(jìn)而發(fā)生白內(nèi)障、糖尿病性心臟病、糖尿病性腎病等并發(fā)癥。此模型適用于人類2型糖尿病的研究。,1.2鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)誘發(fā)dm,機(jī)制：STZ引起糖尿病的機(jī)制可能通過以下途徑。（1)STZ直接破壞胰島細(xì)胞:首先將其DNA堿基上的特殊位點烷基化后,進(jìn)一步作用于ADP核糖體合成酶。從而損傷胰島細(xì)胞,使細(xì)胞數(shù)量明顯減少,殘存的細(xì)胞幾乎完全脫顆粒,胰島素合成和分泌減少,引起糖代謝紊亂致血糖升高。(2)通過NO和自由基途徑損傷胰島細(xì)胞:STZ是一種含亞硝基的化合物,可以誘導(dǎo)NO的合成,增加對胰島細(xì)胞的氧化侵襲而特異性破壞胰島細(xì)胞。優(yōu)點：STZ對組織毒性小,誘發(fā)動物糖尿病模型成功率高,且一般不表現(xiàn)自發(fā)性緩解。缺點：STZ劑量過大易導(dǎo)致動物死亡。因多尿,高糖,體重明顯減輕,故體重較輕的動物易死亡。注意：利用STZ造模時應(yīng)控制劑量。STZ必須4保存及新鮮配制。,1.3Alloxan-STZ聯(lián)合給藥誘發(fā)dm,造模方法:Alloxan和STZ用50mmol/L無菌枸櫞酸鈉緩沖液(pH=415)分別配成200mg/mL和120mg/ml的溶液。實驗動物禁食24h后,氯胺酮麻醉下行股靜脈穿刺,留置導(dǎo)管,經(jīng)導(dǎo)管分別注入上述濃度的Alloxan50mg/kg和STZ30mg/kg。給藥后24h血糖升高,48h后血糖11.1mmol/L且持續(xù)兩周維持在此高血糖水平。機(jī)制:Alloxan和STZ都能通過其毒性作用選擇性破壞胰島細(xì)胞,使胰島素分泌減少,從而誘導(dǎo)實驗動物的糖尿病狀態(tài)。優(yōu)點:兩藥合用,減少二者劑量,既降低了由于單用Alloxan對肝、腎的損害,又彌補(bǔ)了單用STZ劑量過大而致動物死亡或劑量過小而致成模率低的不足。注意事項:兩藥誘導(dǎo)后10h左右可出現(xiàn)急性低血糖反應(yīng),故給藥后應(yīng)在第8,10,13h經(jīng)皮下注射補(bǔ)充一定量的葡萄糖,以預(yù)防發(fā)生致命的低血糖。,1.4腎上腺素(AD)誘發(fā)dm,造模方法:小鼠皮下注射AD240ug/kg,給藥后135min從小鼠眼底靜脈叢取血測血糖。如未完全出現(xiàn)高血糖,應(yīng)追加注射1次AD,直到出現(xiàn)糖尿病癥狀。機(jī)制:AD進(jìn)入體內(nèi)促進(jìn)肝臟及肌肉糖原分解,肌肉中糖酵解生成的乳酸增多,經(jīng)三羧酸循環(huán)糖異生增快。同時激活丙酮酸羧化酶,使丙酮酸向磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)化促進(jìn)糖異生,導(dǎo)致血糖升高。優(yōu)點:使用腎上腺素建立模型簡單、易行,靈敏度高。缺點:AD造模所測定的血糖不完全是葡萄糖,專一性不強(qiáng)。除AD外，地塞米松2mg/kg連續(xù)肌肉注射可以造成小鼠葡萄糖耐量下降模型。,2自發(fā)性糖尿病動物模型,自發(fā)性糖尿病動物模型是在自然條件下動物自然產(chǎn)生,或由于基因突變而出現(xiàn)類似人類糖尿病表現(xiàn)的動物模型。實驗動物未經(jīng)任何有意識的人工處理，在自然狀態(tài)下發(fā)生的以高血糖、胰島素抵抗為主要特征的動物模型。該模型更接近人類糖尿病的自然起病及發(fā)展,尤其適于研究糖尿病的病因?qū)W。但自發(fā)性糖尿病動物因其來源相對較少,飼養(yǎng)、繁殖條件要求高,動物昂貴等缺點限制了其在科學(xué)研究中的應(yīng)用和普及。,2.1嚙齒類自發(fā)dm動物模型,目前,人們篩選成功并能夠作為種系保存下來的自發(fā)性的糖尿病動物模型主要是嚙齒類動物糖尿病模型。大多數(shù)自發(fā)性的糖尿病模型為基因缺陷型或易感型自發(fā)糖尿病鼠,但最終發(fā)展為1型糖尿病。主要包括有,Diabetes(DB)小鼠、Obese(OB)小鼠、Toronto-KK(T-KK)小鼠、NagoyaShibataYasuda(NSY)小鼠;Biobreeding(BB)大鼠、ZuckerDiabetesFatty(ZDF)大鼠、Goto-Kakizaki(GK)大鼠、OtsukaLong-EvansTokushimaFatty(OLETF)糖尿病大鼠等。,2.1.1KK-Ay小鼠,KK小鼠是日本學(xué)者培育的一種輕度肥胖型2型糖尿病動物。后與C57BL/6J小鼠雜交,并進(jìn)行近親繁殖,得Toronto-(T-kk)小鼠。將黃色肥胖基因(即Ay)轉(zhuǎn)至KK小鼠,得KK-Ay鼠,與KK小鼠相比,有明顯的肥胖和糖尿病癥狀。從5周齡起,血糖、血循環(huán)中的胰島素水平以及HbA1c水平逐步升高。細(xì)胞有脫顆粒和糖原浸潤,隨后出現(xiàn)胰島肥大和中心氣泡。肝脂肪化和脂肪組織增多。脂肪組織的胰島素敏感性降低比KK小鼠明顯,且到16周齡時完全喪失。腎臟病變發(fā)生早,發(fā)展迅速,腎小球基底膜增厚。用KK-Ay鼠可評價抗糖尿病藥物的胰腺外作用。,2.1.2NOD小鼠,NOD小鼠(nonobesediabetesmouse)是JCLICR品系小鼠衍生的CTS(白內(nèi)障易感亞系)糖尿病小鼠近親雜交而來,其發(fā)病多突然,表現(xiàn)明顯多飲、多尿、消瘦,血糖顯著升高,不用島素治療,動物存活不了一個月,通常死于酮血癥。NOD小鼠是自發(fā)性自身免疫I型糖尿病的一個很好的模型,是由T-細(xì)胞(包括CD4和CD8細(xì)胞)介導(dǎo)的,其發(fā)展受控于一系列T細(xì)胞的調(diào)節(jié)。細(xì)胞損傷繼發(fā)于自身免疫過程,引起低胰島素血癥。免疫調(diào)節(jié)劑,可溶性白介素-1受體,可溶性TNF受體p55,高果糖飲食等可預(yù)防NOD小鼠糖尿病發(fā)作。NOD小鼠的糖尿病發(fā)病率與性別有關(guān),雌性鼠發(fā)病率顯著高于雄性鼠,且發(fā)病早。,2.1.3NSY小鼠,NSY(Nagoya-Shibata-Yasuda)小鼠是一近交系自發(fā)性糖尿病模型,是從遠(yuǎn)交JCL-ICR小鼠中選擇糖耐量異常株培育而成的。其糖尿病發(fā)生具有年齡依賴性。24周齡時胰島素分泌功能嚴(yán)重受損,48周的累積發(fā)病率雄性為98%,雌性為31%。此鼠在任何年齡階段都不表現(xiàn)嚴(yán)重肥胖和顯著的高胰島素血癥,胰島也無腫大或炎性變化。胰島細(xì)胞分泌胰島素功能受損和胰島素抵抗可能是NSY小鼠發(fā)生NIDDM的機(jī)制,與人的NIDDM發(fā)病機(jī)理相似。,2.1.4BB糖尿病大鼠,是從Wistar大鼠中篩選出來的一種自發(fā)性,遺傳性1型糖尿病動物模型。其發(fā)病和自身免疫性毀壞胰腺細(xì)胞引發(fā)胰腺炎及胰島素缺乏有關(guān)。大鼠糖尿病發(fā)作是突然的,大約在60120日齡時發(fā)病,數(shù)天后,糖尿病動物出現(xiàn)嚴(yán)重的高血糖,低胰島素和酮血癥。免疫抑制劑,將新生鼠胸腺切除等可預(yù)防糖尿病的發(fā)生,說明自身免疫參與發(fā)病。,2.1.5中國地鼠,中國地鼠(Chinesehamster)亦稱黑線倉鼠。其自發(fā)性遺傳性糖尿病史最早由美國的Meier和Yer-ganign將健康中國地鼠通過近親繁殖而成的近交系品種，為非肥胖型，輕、中度高血糖，初發(fā)病時，酮尿癥發(fā)生率、血糖、血漿胰島素，胰高血糖素和葡萄糖水解酶水平恒定降低而胰高血糖素恒定升高，類似于人類型糖尿病。自發(fā)性NIDDM近交系中國地鼠(KDS)是日本東京醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心培育糖尿病模型動物，其NIDDM主要發(fā)生于雄性地鼠，發(fā)病突然，2月齡發(fā)病率為50%，6月齡發(fā)病率達(dá)80%以上。臨床表現(xiàn)為多食、多飲、多尿、血糖和糖尿濃度急劇上升，但在無外源性胰島素治療條件下仍能存活。并且其心、腎慢性血管病變的病理學(xué)特征也與人類糖尿病慢性血管病變相似，因此中國地鼠自發(fā)性糖尿病可作為研究型糖尿病及其并發(fā)癥的良好的動物模型。,2.2其他動物自發(fā)模型,NIDDM貓科動物與人類NIDDM的臨床癥狀有80%的相似,顯著的特征是也好發(fā)于中老年階段,其胰島素抵抗和肥胖作為糖尿病發(fā)生的早期癥狀。自發(fā)的豬NIDDM模型,主要有2個品種,尤卡坦小型豬和哥廷根小型豬。其中尤卡坦小型豬的一種品系表現(xiàn)為糖耐量增高,另一品系則表現(xiàn)為糖耐量受損。哥廷根小型豬給予高脂高能食物后,成為代謝綜合征的理想模型。所有種類的動物模型中,在非人靈長類動物模型中所觀察到的血糖規(guī)律、病理特征與在人類糖尿病患者中所觀察到的臨床特征最為相似。自發(fā)性的糖尿病在食蟹猴、恒河猴、冠毛猴、臺灣猴、豚尾猴、西伯里斯島猴、非洲綠猴以及狒狒等非人靈長類動物中均有發(fā)現(xiàn)和報道。,3轉(zhuǎn)基因糖尿病模型,轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)是20世紀(jì)80年代初發(fā)展起來的生物高新技術(shù),對生命科學(xué)的發(fā)展起到了重大的推動作用。總的來說,有兩種方法：(1)傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因方法,即新基因信息的轉(zhuǎn)入和在動物體內(nèi)的表達(dá)。(2)基因打靶方法,即將特定的內(nèi)源性基因斷裂或以其他基因代替。,3.1轉(zhuǎn)基因動物模型和基因敲除動物模型,轉(zhuǎn)基因技術(shù)是指研究者按照自己的意愿,借助于實驗手段來控制實驗動物的特定基因組及其表達(dá)等,使動物表現(xiàn)特有的遺傳性狀;轉(zhuǎn)基因動物模型采用的哺乳動物和人的基因組有很大的同源性,但來源于人的外源蛋白在動物體內(nèi)由于作用環(huán)境的差異,可能會造成功能的差異而導(dǎo)致沒有出現(xiàn)相應(yīng)的模型性。,基因敲除是利用基因同源重組原理,采用突變的外源DNA片段整合入受體細(xì)胞的DNA同源序列中取代某一特定基因,從而獲得基因型發(fā)生改變的轉(zhuǎn)基因動物,以研究靶基因的體內(nèi)功能或相關(guān)疾病的致病機(jī)制,為研究單個蛋白在胰島素信號傳導(dǎo)中的作用提供了重要手段,同時顯示了胰島素分泌作用的輕微缺陷也能導(dǎo)致糖尿病;但很難揭示胰島素抵抗和糖尿病發(fā)生的根本機(jī)制。,常見的轉(zhuǎn)基因或基因敲除動物包括與胰島素和胰島素受體以及胰島素下游信號元件相關(guān)基因，如:IRS1、IRS2、GLUT4、PTP1B等基因敲除小鼠;PPAR組織特定基因敲除小鼠;葡萄糖激酶(GK)或GLTU2基因敲除小鼠;肝臟特異性胰島素受體基因敲除小鼠(iL-IRKO);細(xì)胞特定基因敲除小鼠;sqstm1基因敲除(OK)小鼠;骨骼肌特異性LPL(SMLPL(/)基因敲除小鼠;IRS1/IRS2雙基因敲除小鼠;IRS1+/GK+/雙基因敲除小鼠;人胰島淀粉樣蛋白多肽過度表達(dá)大鼠;GIPR(dn)轉(zhuǎn)基因小鼠;下丘腦腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)轉(zhuǎn)基因小鼠模型等。,3.2舉例:GK/IRS-1雙基因剔除小鼠,2型糖尿病有兩個主要特征:周圍胰島素抵抗和細(xì)胞分泌胰島素功能受損。輕度胰島素抵抗和胰島素分泌功能輕度缺陷的小鼠,雜交后后代可產(chǎn)生2型糖尿病癥狀。GK/IRS-1雙基因剔除小鼠:IRS-1-/-小鼠表現(xiàn)為胰島素抵抗,但由于B細(xì)胞代償性增生,胰島素分泌增多,糖耐量正常。細(xì)胞特異GK表達(dá)降低的小鼠,顯示輕度糖耐量異常。兩者雜交產(chǎn)生的GK/IRS-1雙基因剔除小鼠,表現(xiàn)2型糖尿病癥狀,既有胰島素抵抗又有糖耐量異常。醫(yī)學(xué)定義：胰島素抵抗(InsulinResistance，IR)指的是正常量的胰島素起不到正常的降低血糖的作用，體內(nèi)組織對于胰島素的作用不敏感。糖耐量：通俗地說就是人體對葡萄糖的耐受能力。,GDM(妊娠糖尿病)模型,妊娠期胰島素抵抗可引起妊娠糖尿病,患者胎兒典型特征是巨大,而成年后患肥胖和2型糖尿病的概率上升。雜合體Leptin受體缺乏(Leprdb+)小鼠發(fā)生GDM癥狀,其子代特征與GDM母親所生胎兒癥狀相似。雜合體C57BLKsJ-db+小鼠也發(fā)生GDM,妊娠引起PI3K與IRS-1解離,與IR結(jié)合活性增加,胰島素介導(dǎo)的精氨酸磷酸化增多而IRS-1表達(dá)及其酪氨酸磷酸化減少從而使IRS-1結(jié)合及激活PI3K能力下降,胰島素功能不能發(fā)揮,出現(xiàn)胰島素抵抗。,4其他dm動物模型,4.1胰腺切除法造糖尿病動物模型此法是最早的糖尿病動物模型復(fù)制方法,1890年Mehring和Minkowski報道,在切除狗的胰腺后,狗會出現(xiàn)多尿、多飲、多食和嚴(yán)重的糖尿現(xiàn)象。實驗一般選用較大的動物,如狗和家兔等,其次用大鼠。切除實驗動物的全部胰腺,可制成無胰性糖尿病動物模型,需補(bǔ)充外源性胰酶。如果希望動物保持良好的健康狀況,需保留部分胰腺組織。艾昭東等在無菌操作下切除實驗動物胰腺組織90%左右喂養(yǎng)一段時間后,可成為1型糖尿病模型,胰腺切除90%92.3%的動物比文獻(xiàn)報道切除70%90%的動物成模時間更短、更穩(wěn)定,具有手術(shù)并發(fā)癥較少、動物成活率高