細胞凋亡 apoptosis,皖南醫(yī)學院病理生理教研室,apoptosis,概述,凋亡過程與調(diào)控,發(fā)生機制,凋亡與疾病,凋亡在疾病防治中的意義,apoptosis,研究歷史 定義 與死亡的區(qū)別 功能,概 述,概 述,早在1972年Kerr等已發(fā)現(xiàn)從細胞形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)和生化變化等方面來分析，細胞有二種死亡形式,一種是早被熟知的細胞壞死（Necrosis），另一種是創(chuàng)新提出的程序性細胞死亡（Programmed cell death, PCD）學說。但該學說到九十年代初才進入研究高潮，進展極快，現(xiàn)在普遍稱之為細胞凋亡（Apoptosis）。,apoptosis,概 述,apoptosis,定義,概 述,Apoptosis(apo- ptosis),PCD（programmed cell death）,由體內(nèi)外因素觸發(fā)細胞內(nèi)預存的死亡程序而導致的細胞死亡過程,apoptosis,細胞壞死,概 述,特征：線粒體膨脹，細胞骨架降解，溶酶體釋放酶，細胞核內(nèi)染色質(zhì)沉淀靠近核膜邊，蛋白質(zhì)合成下降，由于膜破裂，出現(xiàn)炎癥反應,一般過程：因補體反應或烈性病毒感染破壞了質(zhì)膜，或者能量依賴性離子泵被破壞產(chǎn)生的鈉鉀等離子沿著各自的濃度梯度進入細胞，從而導致細胞吸水膨脹，最終破膜而死。,細胞凋亡與壞死的區(qū)別,壞死 凋亡,apoptosis,概 述,1.性質(zhì),2.誘導因素,強烈刺激，隨機發(fā)生,較弱刺激，非隨機發(fā)生,3.生化特點,4.形態(tài)變化,5.DNA電泳,6.炎癥反應,7.凋亡小體,8.基因調(diào)控,被動過程，無新蛋白合成，不耗能,主動過程，有新蛋白合成，耗能,細胞結(jié)構(gòu)全面溶解、破壞、細胞腫脹,胞膜及細胞器相對完整細胞皺縮，核固縮,彌散性降解，電泳呈均一DNA片狀,DNA片段化（180-200bp），電泳呈“梯”狀條帶,溶酶體破裂，局部炎癥反應,溶酶體相對完整，局部無炎癥反應,有,病理性，非特異性,生理性或病理性，特異性,無,有,無,細胞凋亡的生理意義, 確保正常發(fā)育、生長 維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定 發(fā)揮積極的防御功能 所以細胞凋亡是正常的生理過程，但是凋亡過多或過少都可引起疾病發(fā)生。因此，近年來對于細胞凋亡的研究，已成為醫(yī)學界的關注熱點。,apoptosis,概 述,apoptosis,概述 凋亡過程與調(diào)控 發(fā)生機制 凋亡與疾病,apoptosis,凋亡過程與調(diào)控,凋亡過程,凋亡時細胞的主要變化,凋亡的調(diào)控,apoptosis,凋亡過程與調(diào)控,凋亡過程可大致分成4個階段：,凋亡信號轉(zhuǎn)導,凋亡基因激活,凋亡的執(zhí)行,凋亡細胞的清除,apoptosis,凋亡過程與調(diào)控,凋亡過程,+受體,cAMP Ca2+ 神經(jīng)酰胺,凋亡誘導因素,死亡信號,凋亡相關基因激活,DNase激活 Caspases激活,巨噬細胞吞噬分解凋亡細胞,基因激活,apoptosis,凋亡過程與調(diào)控,凋亡過程,受體,cAMP Ca2+ 神經(jīng)酰胺,凋亡相關基因激活,信號轉(zhuǎn)導,細胞膜,細胞核,Dnase激活 Caspases激活,apoptosis,凋亡過程與調(diào)控,凋亡過程,DNase激活,Caspases激活,凋亡細胞的清除,凋亡執(zhí)行,apoptosis,生化改變,凋亡過程與調(diào)控,凋亡時細胞的主要變化,形態(tài)學改變,apoptosis,凋亡時細胞的形態(tài)學改變,凋亡過程與調(diào)控,空泡化,固縮,出芽,邊集,凋亡小體,形態(tài)學特征：,生化特征：,胞漿內(nèi)Ca2+濃度升高。 細胞內(nèi)活性氧增多。 質(zhì)膜通透性變大。 DNA內(nèi)切酶活性被激活升高，雙鏈DNA在核小體之間切斷形成185bp為基數(shù)的有序片段。 型谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶和需鈣蛋白酶（Calpain）活性升高。,apoptosis,凋亡過程與調(diào)控,細胞凋亡的生化改變,apoptosis,凋亡過程與調(diào)控,DNA的片段化斷裂 蛋白質(zhì)的降解,典型凋亡細胞DNA瓊脂糖凝膠電泳（呈現(xiàn)梯狀條帶）,細胞凋亡的生化改變,特點：cysteine-containing aspartate-specific protease（含半胱氨酸的天門冬氨酸特異水解酶）,apoptosis,凋亡過程與調(diào)控,和凋亡有關的兩個酶,作用：切割染色質(zhì)DNA,DNase,特點：Ca2+/Mg2+增強活性，Zn2+抑制其活性,Caspases,作用：滅活凋亡抑制物,水解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，形成凋亡小體,水解凋亡相關活性蛋白,使抑制凋亡因子失活，如CAD/ICAD 破壞細胞結(jié)構(gòu)，如Lamina 將調(diào)節(jié)區(qū)與催化區(qū)分離，使蛋白失活，如Gelsolin,Caspase 如何殺死細胞？,Caspases家族簡介,1993年Yuan從哺乳類細胞中發(fā)現(xiàn)第1個Ced-3同源分子，叫白細胞介素-1轉(zhuǎn)換酶（Interleukin-1 Converting Enzyme，ICE），Pro-ICE含404個氨基酸，分子量45KD。在一定形式下可自身催化產(chǎn)生20KD和10KD二個片段，聚合形成（p20）2(p10)2雜四聚體，為活化的ICE。到1998年底為止共發(fā)現(xiàn)有14個Ced-3同源分子，分別定名為Caspase1-14。,Caspases的分子的結(jié)構(gòu)特征,Caspases的分子均具有下列的結(jié)構(gòu)特征： 以無活性的Pro-Caspases形式存在。 在Pro-Caspases的N端均含有一段P2-P27的前 區(qū)域（Prodomain）。 活性形式均是由2個大亞基（1720KD）和2個小亞基（1012KD）組成的雜四聚體。一分子Pro-Caspase只能分裂產(chǎn)生1個大亞基和1個小亞基 。 在大亞基的C端均含有QACXG（X=R.Q或G）的活性中心，其中半胱氨酸（C）是必需氨基酸，故 Caspase是屬于半胱氨酸蛋白酶類。,Caspase的分組,Caspase的分組有的是按其催化特異性而分為三組有的是按其前區(qū)域中共含某一具有嗜同性結(jié)合功能的區(qū)段分為： 1.CARD-Caspase:包括Caspase1,2,4,5,9,11,12,13等。 2.DED-Caspases 包括Caspase-8,10等。 3.下游Caspase 包括Caspase-3,6,7等。,apoptosis,細胞凋亡的調(diào)控,凋亡的調(diào)控,凋亡相關因素 凋亡信號的轉(zhuǎn)導 凋亡相關基因,apoptosis,細胞因子：IL-2，神經(jīng)生長因子 某些激素 某些二價金屬陽離子、藥物,凋亡的調(diào)控,凋亡相關因素,誘導性因素：,激素和生長因子失衡,理化因素：高溫、強酸、強堿、抗癌藥物,免疫性因素,微生物學因素：細菌、病毒,抑制性因素：,凋亡程序的執(zhí)行者,apoptosis,凋亡信號的轉(zhuǎn)導,凋亡的調(diào)控,特點： 多樣性：不同種類細胞有不同的信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng) 偶聯(lián)性：死亡信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)與細胞增殖、分化過程 中的信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)在一些環(huán)節(jié)上交叉、偶聯(lián) 同一性：不同凋亡誘導因素可通過同一信號轉(zhuǎn)導系 統(tǒng)引起細胞凋亡 多途性：同一凋亡誘導因素可經(jīng)過多條信號途徑觸 發(fā)細胞凋亡,凋亡信號的轉(zhuǎn)導,與凋亡有關的信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)： 1.胞內(nèi)Ca2+信號系統(tǒng) Ca2+在細胞凋亡中充當了傳遞凋亡信號的角色；胞內(nèi)Ca2+濃度上升可激活Ca2+依賴的谷氨酰胺酶，活化核轉(zhuǎn)錄因子等觸發(fā)細胞凋亡。 2.cAMP/PKA信號系統(tǒng) 3.Fas蛋白/Fas配體信號系統(tǒng),Fas配體或抗Fas抗體與Fas蛋白結(jié)合,神經(jīng)鞘磷脂 酶活性,神經(jīng)酰胺途徑 誘導細胞凋亡,激活ICE樣 的caspase,降解H1組蛋白 暴露DNase 的酶切位點,通過Ca2+信號系統(tǒng) 傳遞死亡信號,3.Fas蛋白/Fas配體信號系統(tǒng),4.神經(jīng)酰胺信號系統(tǒng) 電離輻射、TNF-、Fas抗原、糖皮質(zhì)激素 5.二酰甘油/PKC信號系統(tǒng) 6.酪氨酸蛋白激酶信號系統(tǒng) 負調(diào)控作用,apoptosis,凋亡的調(diào)控 凋亡相關因素 凋亡信號的轉(zhuǎn)導 凋亡相關基因,凋亡的調(diào)控,凋亡的調(diào)控,apoptosis,凋亡的調(diào)控,凋亡的調(diào)控,凋亡相關基因,抑制凋亡基因：Bcl-2，EIB， IAP,促進凋亡基因：wtP53，Bax，ICE,雙向調(diào)控基因：c-myc，Bcl-x,一、BcL-2族分子,BcL-2:bcL-2基因是細胞凋亡研究中最受重視的癌基因之一,其表達的蛋白質(zhì)BcL-2蛋白最初發(fā)現(xiàn)于B-淋巴細胞瘤/白血病-2（B cell lymphoma/Leukemia-2,BcL-2)而得名，與線蟲ced9基因表達的Ced-9分子在結(jié)構(gòu)上有同源性，具有抗凋亡作用。BcL-2的高表達能阻抑多種凋亡誘導因素所引發(fā)的細胞凋亡。如-射線、糖皮質(zhì)激素、熱休克、多種化療藥物。,抑制凋亡基因,BcL-2的同源基因和蛋白,其中一類呈抗凋亡作用，有BcL-2,BcL-w，BcL-XL、BFL-1、Brag-1、MCL-1，AI。 另一類呈現(xiàn)促凋亡作用的，有Bax，Bak, Bok，BcL-Xs，Bad, Bid, Bik，Hrk，Bim等。 BcL-2基因家族成員自身或彼此之間有形成二聚體或多聚體的能力，BcL-2家族的蛋白與蛋白相互作用調(diào)節(jié)著細胞的存活與凋亡。,BcL-2抗凋亡機制：,直接抗氧化,抑制線粒體釋放促凋亡蛋白質(zhì),抑制凋亡調(diào)節(jié)蛋白的細胞毒作用,抑制凋亡蛋白酶的激活,維持細胞鈣穩(wěn)態(tài),P53基因,wtP53 修復受損的DNA，如修復失敗則誘導細胞凋亡,突變的P53,失活的P53,喪失監(jiān)視DNA損傷的功能,射線，毒素,P53蛋白,+,細胞凋亡,分子警察,促進凋亡基因,apoptosis,雙向調(diào)控基因,凋亡的調(diào)控,C-myc是一種癌基因，是調(diào)控細胞周期的主要基因。編碼的蛋白是DNA結(jié)合蛋白，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，在GF充足時主要激活介導細胞增殖的基因；反之激活凋亡基因。,C-myc,Bcl-x,是1933年發(fā)現(xiàn)的一類與Bcl-2相關基因。 Bcl-xl抑制細胞凋亡。 Bcl-xs促進細胞凋亡。,apoptosis,概述 凋亡過程與調(diào)控 發(fā)生機制 凋亡與疾病,氧化損傷 1.氧化應激（oxidative stress）的概念 -指機體活性氧產(chǎn)生過多或抗氧化能力下降，活性氧的清除不足，導致活性氧在體內(nèi)積聚并引起氧化損傷的病理過程。 氧化損傷的后果之一就是誘導凋亡。 2.氧化應激引起細胞凋亡的可能機制： DNA受損激活P53基因 膜通透性 Ca內(nèi)流 DNase 生物膜損傷 m 脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物 多聚ADP核糖合成酶活化，NAD耗竭，ATP大量消耗 可活化NF-kB、AP-1，加速細胞凋亡相關的一些基因表達, 鈣穩(wěn)態(tài)失衡 Ca2作為許多細胞生命活動的第二信使，在細胞凋亡中的作用也倍受關注，凋亡發(fā)生時胞漿中Ca2 ，并激活凋亡過程中的關鍵酶類，其誘導細胞凋亡的機制為： 激活Ca2 /Mg2 依賴的DNase 激活谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶（GTase），促進凋亡細 胞中蛋白廣泛交聯(lián)，有利于凋亡小體的形成 激活Ca2 敏感的蛋白酶 核骨架蛋白酶 核基質(zhì)蛋白 絲氨酸蛋白酶 膜蛋白 激活核轉(zhuǎn)錄因子，加速促凋亡基因的轉(zhuǎn)錄, 線粒體損傷 目前證據(jù)顯示，線粒體的功能改變在細胞凋亡 的發(fā)生中起重要作用 表現(xiàn)為 線粒體內(nèi)膜通透性 線粒體內(nèi)膜的跨膜電位m 能量合成水平 線粒體功能和結(jié)構(gòu)破壞引起細胞凋亡的可能機制： 凋亡誘導因素作用于細胞后 線粒體內(nèi)膜跨膜電位（m）下降， 線粒體內(nèi)外膜之間的通透性轉(zhuǎn)換孔PTP開放； 使細胞凋亡啟動因子（Cyt.C）,凋亡蛋白酶激活因子（Apaf）和凋亡誘導因子（AIF）釋放,apoptosis,發(fā)生機制,凋亡誘導因素,線粒體跨膜電位,線粒體PTP開放,Cyt.C,Apaf,等釋放,AIF,潛在Dnase,活化Dnase,激活Caspases,細胞凋亡,線粒體損傷,1.線粒體內(nèi)的凋亡因子 在線粒體內(nèi)外的腔隙中含有許多涉及細胞凋亡的因子， 包括其中特有cyt.c、AIF，以及與胞漿共有的Pro- Caspase-2、3、7、9，很多內(nèi)外因素損傷線粒體膜的 完整性，促使線粒體釋放這些凋亡因子，即可誘導細 胞凋亡。 cyt.c AIF-(+)DNase Apaf Apaf-1 與Ced-4同源 Apaf-2與cyt.c同源 Apaf-3與Pro-Caspase-9同源,2.線粒體膜通透性轉(zhuǎn)變的影響因素 BcL-2基因家族 阻止線粒體膜通透性改變 PKC- Ca2+ 促進線粒體膜通透性改變 線粒體老化 3.線粒體跨膜電位（m）下降與細胞凋亡 以上介紹了細胞凋亡的發(fā)生機制 氧化損傷、鈣穩(wěn)態(tài)失衡、線粒體損傷。三者既可單獨啟動，又可聯(lián)合作用，三種機制互相聯(lián)系，互為因果，是很多凋亡誘導因素的共同通路，也就是所謂細胞凋亡的惡性網(wǎng)絡假說（deleterious network hypothesis),Mitochondria in Apoptosis,apoptosis,概述 凋亡過程與調(diào)控 發(fā)生機制 凋亡與疾病,apoptosis,細胞凋亡與疾病的關系 該“死”的細胞不死，不該“死”的細胞卻死了，也就是說無論凋亡過度或凋亡不足都可以導致疾病的發(fā)生。 細胞凋亡不足：腫瘤，自身免疫病， 細胞凋亡過度：心肌缺血，心力衰竭，神經(jīng)元 退行性疾病，病毒感染 不足與過度并存：動脈粥樣硬化,凋亡與疾病, 細胞凋亡不足 腫瘤：凋亡抑制基因Bcl-2基因過高表達-凋亡衰減（前列 腺癌） 促凋亡基因如p53基因突變或缺失，腫瘤發(fā)生率 自身免疫病 自身抗原受到自身抗體或致敏T淋巴細胞的攻擊而損傷 T、B淋巴細胞通過正選擇和負選擇才能發(fā)育、分化成熟 負選擇：凋亡清除針對自身組織抗原和TCR的雙陽性細胞 正選擇：保留能夠識別自身組織抗原的T細胞，并增殖成熟,如果負選擇機制失調(diào)，針對自身組織抗原的T細胞存活、增殖， 產(chǎn)生自身免疫病。, 細胞凋亡過度 心血管疾病 心力衰竭 心肌缺血與再灌注損傷 壞死與凋亡共存 發(fā)生機制：氧化應激；細胞內(nèi)鈣超載； Fas受體上調(diào)；p53基因轉(zhuǎn)錄增強 凋亡特點：早期凋亡為主，晚期壞死為主 梗死灶中央以壞死為主，周邊凋亡為主 慢性、輕度缺血以凋亡為主，急性、重度缺血則常常發(fā)生壞死 IR引起的細胞凋亡有時比單純?nèi)毖鼑乐?神經(jīng)元退行性疾病 特定神經(jīng)元進行性喪失為病理特征的疾病 阿爾茨海默病（Alzheimer disease AD） AD主要是由于海馬及基底神經(jīng)核的膽堿能神經(jīng)元大量喪失,病理切片上可見-淀粉樣蛋白沉積和神經(jīng)元纏結(jié) 機制： -淀粉樣蛋白基因位于21號染色體，當鈣超載、氧化應激或神經(jīng)生長因子分泌不足時， Ca2內(nèi)流增加，激活與-淀粉樣蛋白合成有關的基因，使-淀粉樣蛋白含量增加，沉積于神經(jīng)元內(nèi)，進一步激活周圍的M釋放細胞因子和炎性介質(zhì)促進凋亡的發(fā)生,病毒感染 病毒感染宿主細胞后有兩種結(jié)局： 一是誘導細胞 凋亡從而限制病毒生長（肝炎病毒）； 二是由病毒基因表達的蛋白抑制宿主細胞凋亡，造成持續(xù)性感染或增加某些病毒的致癌可能性。 AIDS:由HIV感染引起，其關鍵是CD4+淋巴細胞被破壞，導致CD4+淋巴細胞顯著減少，相關免疫功能缺陷。 CD4+淋巴細胞與HIV感染者病情發(fā)生發(fā)展有密切關系，它決定感染者是否發(fā)病和發(fā)病的速度和嚴重程度。,HIV感染導致CD4+淋巴細胞發(fā)生凋亡的相關因素： 1）HIV的基因產(chǎn)物GP120能直接啟動CD4+淋巴細胞的死亡程序 2）合胞體形成： 3）Fas基因表達上調(diào) 4）T細胞激活 激活誘導的細胞死亡