新型SDHI類殺菌劑吡噻菌胺對(duì)橡膠樹膠孢炭疽菌的EC50測(cè)定及敏感性基線建立題目：新型SDHI類殺菌劑吡噻菌胺對(duì)橡膠樹膠孢炭疽菌的EC50測(cè)定及敏感性基線建立摘要橡膠樹所分泌的天然乳膠是我國重要的戰(zhàn)略資源。隨著天然橡膠的廣泛應(yīng)用，人們對(duì)于它的需求日益增加，然而橡膠樹的生長條件要求高，而且容易受到病原菌以及蟲害入侵，其中較為嚴(yán)重的一種病害是橡膠樹炭疽病，病原物為膠孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides）。目前在新型SDHI類殺菌劑的應(yīng)用方面，吡噻菌胺對(duì)于膠孢炭疽菌的防效具有研究和開發(fā)前景，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了吡噻菌胺對(duì)91株膠孢炭疽菌的EC50值,具體分布范圍為0.23~3.38mg/L，計(jì)算得EC50的平均值為1.68±0.65mg/L。在91株膠孢炭疽菌中，最不敏感菌株的EC50值是最敏感菌株的9.09倍，推導(dǎo)得出的敏感性基線接近正態(tài)分布，表明橡膠樹膠孢炭疽菌對(duì)吡噻菌胺較為敏感，吡噻菌胺有防治橡膠樹膠孢炭疽病的潛力。關(guān)鍵字：吡噻菌胺；膠孢炭疽菌；EC50；敏感性基線

AbstractThenaturallatexissecretedbyrubbertrees.Aftersolidificationandprocessing,itbecomesanimportantstrategicresourceinChina.Withthewideapplicationofnaturalrubbers,people'sdemandforthemareincreasingdaybyday.However,the

rubbertrees

needgreatgrowthconditions,and

theyaresusceptibletotheinvasionofpathogensandinsectpests.AkindofseriousdiseaseistheColletotrichumleafdisease.Atpresent,inthepracticalapplicationofnewSDHIfungicides,theproventioneffectof

penthiopyrad

onC.gloeosporioides

hastheprospectofresearchanddevelopment.Inthisexperiment,theEC50valuesofpenthiopyrad

against91strainsofC.gloeosporioidesweredetermined.Thatofpenthiopyradagainst91C.

gloeosporioidesisolatesrangedfrom0.22to3.38mg/L,withameanEC50valueof1.68±0.65mg/L.That

of

theleastsensitivestrainwas9.09timesmorethanthemostsensitiveone.ThecalculautedsensitivitybaselineindicatedthattheC.gloeosporioides

wasnotresistanttothisfungicide,whichmeansthe

penthiopyradcouldbeusedtopreventC.gloeosporioides.Keywords：Penthiopyrad;Colletotrichumgloeosporioides;EC50;Sensitivitybaseline

目錄前言 11試驗(yàn)材料與方法 21.材料 21.1.1供試菌種 21.1.2供試培養(yǎng)基 21.1.3供試藥品 21.1.4實(shí)驗(yàn)儀器 21.2方法 21.2.1藥劑母液配制 21.2.2滅菌 21.2.3培養(yǎng)基配置 31.2.4含藥平板配置 31.2.5接菌 31.2.6調(diào)查結(jié)果與記錄 32結(jié)果與分析 32.1吡噻菌胺對(duì)橡膠樹膠孢炭疽菌的EC50……………………..32.2吡噻菌胺對(duì)橡膠樹膠孢炭疽菌敏感性基線的建立 73總結(jié)與展望 7致謝 9參考文獻(xiàn) 10前言據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球99%以上天然橡膠都來自于巴西橡膠，此類橡膠具備優(yōu)良的耐磨擦性，是用于制造飛機(jī)、航天載具、醫(yī)療器械等所必需的材料，與煤炭、石油、鋼鐵并列的四大基礎(chǔ)工業(yè)原料，其中巴西橡膠樹的橡膠膠質(zhì)好，壽命長產(chǎn)量高且易于采收。炭疽病是橡膠樹上的一種重要葉部病害，其病原菌包括膠孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides）以及尖孢炭疽菌（C.acutatum）兩種，往往容易侵染橡膠樹的葉片，流行爆發(fā)時(shí)經(jīng)常引起嫩葉脫落，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。已有研究證實(shí)目前海南橡膠樹苗圃和開割膠園炭疽病的病原菌以C.gloeosporioides為主[2]。膠孢炭疽菌的分生孢子為單孢，無色，兩端鈍圓，孢子中含有2~3個(gè)油泡，內(nèi)有顆粒狀物質(zhì)[3]。此病原物可以侵染橡膠樹葉片、枝條等組織，造成葉枯、落葉，導(dǎo)致橡膠樹的死亡，造成膠乳大量減產(chǎn)[4]。炭疽菌易在大量嫩葉發(fā)生時(shí)流行，降雨和高濕條件使得炭疽菌的發(fā)生更為頻繁，而風(fēng)雨是病害傳播的主要媒體[5]，而海南高溫高濕的氣候給了炭疽菌良好的傳播環(huán)境。此外，炭疽菌具有多種侵染模式，可以在植物多個(gè)生長階段和組織部位進(jìn)行侵染繁殖，生物防治和栽培管理均不能有效地防治此類病害，目前大多依賴化學(xué)藥劑。但是重復(fù)的使用單一化學(xué)藥劑，容易使病原菌產(chǎn)生耐藥性，所以在已有藥劑的基礎(chǔ)上，開發(fā)新的化學(xué)藥劑變得尤為重要。琥珀酸脫氫酶抑制劑（Succinctdehydrogenaseinhibitors，SDHI），可以影響病原菌的呼吸作用，阻礙病菌線粒體呼吸鏈的電子傳遞，干擾病原菌生長發(fā)育的過程，致其死亡[6]。在2000年后上市的SDHI類殺菌劑中，氟吡菌酰胺等對(duì)炭疽菌幾乎沒有抑菌活性，主要應(yīng)用于白粉病、菌核病等真菌病害防治中[7]；由日本三井化學(xué)公司開發(fā)的吡噻菌胺對(duì)大部分炭疽菌的抑菌活性較高，抑制菌絲生長的EC50在0.3~5.3mg/l，對(duì)菌體產(chǎn)孢、孢子萌發(fā)等環(huán)節(jié)有一定程度的抑制效果，活體防治效果較好。在實(shí)際生產(chǎn)中，吡噻菌胺已經(jīng)開始用于對(duì)果樹，觀賞作物等相關(guān)病害防治，比如殼二孢屬等引起的葉斑病等[8]。然而吡噻菌胺尚未在炭疽病防治上有詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，因此更加需要對(duì)其生物學(xué)活性進(jìn)行詳細(xì)的研究，為其生產(chǎn)應(yīng)用提供充實(shí)的數(shù)據(jù)支撐。本研究以橡膠樹膠孢炭疽菌為實(shí)驗(yàn)材料，通過農(nóng)藥生物測(cè)定等技術(shù)手段，明確吡噻菌胺對(duì)膠孢炭疽菌的生物學(xué)活性，測(cè)定吡噻菌胺對(duì)橡膠樹膠孢炭疽菌的EC50及敏感性基線，為橡膠樹上使用SDHI類殺菌劑提供理論依據(jù)，并為以后的實(shí)際使用進(jìn)行生產(chǎn)指導(dǎo)。1.試驗(yàn)材料與方法1.1材料1.1.1供試菌種2018年~2019年，在炭疽病流行期間，去往海南各地膠區(qū)的感病橡膠樹區(qū)，采集最具有典型癥狀的病葉樣本，置于采集袋中，將其帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離，最終得到測(cè)試菌株。1.1.2供試培養(yǎng)基采用PDA（馬鈴薯葡萄糖瓊脂）培養(yǎng)基，配方：馬鈴薯塊200g，瓊脂粉15g，葡萄糖20g，加入超純水定容到1000mL，121℃高壓濕熱滅菌20min。1.1.3供試藥品實(shí)驗(yàn)室采用的試劑為99.90%吡噻菌胺，生產(chǎn)商為上海阿拉丁生化科技公司。1.1.4實(shí)驗(yàn)儀器電子天平，培養(yǎng)皿，培養(yǎng)箱，高壓干熱滅菌鍋，超凈工作臺(tái)，直尺等。1.2方法1.2.1藥劑母液配制使用分析天平稱取吡噻菌胺原藥0.1001g（精確至0.0001g），轉(zhuǎn)移到10mL容量瓶中，加入丙酮，定容至10mL，得到10000mg/L吡噻菌胺母液。采用逐級(jí)稀釋法，使用丙酮將10000mg/L的母液逐級(jí)稀釋到5000、1000、500、100、50mg/L，將配好的藥劑分別轉(zhuǎn)移到15mL離心管中，于-20℃冰箱備用。1.2.2滅菌進(jìn)行滅菌時(shí)，將提前清洗好的玻璃儀器置于干熱滅菌鍋中，滅菌溫度為170℃溫度，持續(xù)2小時(shí)。1.2.3培養(yǎng)基配置制作PDA培養(yǎng)基，首先削去馬鈴薯的表皮，切條，稱取200g放入鍋中，加入1000mL蒸餾水煮沸；待土豆變軟后，過濾并保留濾液；往濾液中加入20g葡萄糖，邊加入邊緩慢攪拌；稱取15g瓊脂粉，加熱攪拌至完全溶解，之后再次過濾并轉(zhuǎn)移到1L容量瓶，分裝到錐形瓶中，在滅菌鍋中處理40分鐘。1.2.4藥劑平板配置選擇濃度為1000mg/L的藥劑母液，分別吸取0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mL入到200mL的PDA培養(yǎng)基中搖晃混勻，使混合后的培養(yǎng)基中吡噻菌胺的濃度為0.25、0.5、1、2、4、8mg/L，同時(shí)設(shè)置等體積的清水和溶劑（丙酮）對(duì)照，每濃度至少3個(gè)培養(yǎng)基。1.2.5接菌接菌操作需在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行，點(diǎn)燃酒精燈，將直徑為0.5cm打孔器燒至紅色滅菌，靜置冷卻，在直徑為7-8m的菌絲培養(yǎng)基中打取菌餅，用接種針選擇菌絲長勢(shì)一致的菌餅，準(zhǔn)確接于培養(yǎng)皿正中央，在培養(yǎng)蓋上標(biāo)記濃度，用保鮮膜密封，然后將打包好的培養(yǎng)皿治愈恒溫培養(yǎng)箱中。1.2.6調(diào)查結(jié)果與記錄3-5天之后，觀察培養(yǎng)皿中的菌落直徑，待空白組病原菌菌絲生長7-8cm時(shí)，使用十字交叉法測(cè)量菌落直徑并計(jì)算平均值，在此過程中如有污染，需重新補(bǔ)上；根據(jù)數(shù)據(jù)計(jì)算菌絲生長抑制率。使用DPS7.05等軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)算得出吡噻菌胺對(duì)各菌株毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)R2和有效中濃度EC50值，最后根據(jù)敏感性分布情況建立橡膠樹膠孢炭疽菌對(duì)吡噻菌胺的敏感性基線。2.結(jié)果與分析2.1.吡噻菌胺對(duì)橡膠樹膠孢炭疽菌的EC50采用菌絲生長速率法測(cè)定了91株田間分離的橡膠樹炭疽菌對(duì)吡噻菌胺的敏感性，EC50值如表1所示。如圖，EC50分布范圍為0.23~3.38mg/L，平均值為1.68±0.65mg/L。表1吡噻菌胺對(duì)91株橡膠樹膠孢炭疽菌EC50及劑量效應(yīng)Table1-1EC50anddoeseffectofpenthiopyradon91Colletotrichumgloeosporioidesisolates供試菌株Isolate毒力回歸方程（y=）RegressionequationoftoxicityEC50（mg/L）相關(guān)系數(shù)（r2）CorrelationcoefficientCG1y=4.63+1.26x1.970.94CG2y=4.71+1.17x0.240.96CG3y=4.68+1.34x1.720.97CG4y=4.71+1.50x1.560.96CG5y=4.63+1.39x1.840.86CG6y=5.23+0.99x0.580.97CG7y=5.27+0.96x0.520.98CG8y=4.71+1.55x1.550.95CG9y=4.71+1.20x1.760.97CG10y=4.93+1.07x1.170.99CG11y=4.95+1.19x1.100.89CG12y=4.17+2.03x2.550.87CG13y=4.94+1.09x1.150.98CG14y=4.93+1.28x1.140.98CG15y=4.80+1.18x1.470.99CG16y=4.54+1.52x2.000.91CG17y=4.71+1.55x1.530.96CG18y=4.87+1.07x1.340.92CG19y=4.84+1.22x1.340.98CG20y=4.87+1.24x1.260.98CG21y=4.54+1.31x2.230.99CG22y=4.80+1.50x1.360.96CG23y=4.57+1.19x2.300.91CG24y=5.04+1.15x0.930.94CG25y=4.71+1.06x0.270.96CG26y=4.57+1.34x2.070.98CG27y=4.48+1.66x2.060.97CG28y=4.24+2.00x2.400.97CG29y=4.58+1.21x2.210.97CG30y=4.65+1.16x2.010.92CG31y=4.75+1.06x1.710.95CG32y=5.05+0.93x0.870.90CG33y=5.17+0.89x0.650.99CG34y=5.36+0.83x0.370.93CG35y=4.62+1.33x1.920.98CG36y=4.69+1.42x1.640.99CG37y=4.78+1.26x1.490.97CG38y=4.63+1.42x1.830.97CG39y=4.52+1.26x2.390.98CG40y=4.70+1.36x1.660.99CG41y=4.95+1.05x1.120.96CG42y=4.51+1.12x2.740.39CG43y=4.51+1.25x2.480.95CG44y=4.40+1.36x2.760.89CG45y=4.56+1.23x2.270.98CG46y=4.79+0.91x1.720.91CG47y=4.81+0.87x1.660.94CG48y=4.45+1.04x3.380.88CG49y=4.69+1.11x1.900.94CG50y=4.43+1.15x0.500.96CG51y=4.34+1.37x3.030.99CG52y=4.16+1.55x0.540.97CG53y=4.56+1.26x2.220.96CG54y=4.55+1.24x2.300.96CG55y=4.54+1.18x2.430.97CG56y=4.67+1.32x1.780.97CG57y=4.30+1.52x2.860.86CG58y=4.53+1.31x2.290.99CG59y=4.58+1.36x2.030.99CG60y=4.80+1.12x1.500.99CG61y=4.73+1.09x1.780.99CG62y=4.75+1.09x1.710.99CG63y=4.75+1.08x1.720.99CG64y=4.83+1.27x1.350.93CG65y=4.79+1.28x1.450.95CG66y=4.77+1.11x1.600.99CG67y=4.76+1.10x1.640.99CG68y=4.82+1.59x1.290.98CG69y=4.87+1.63x1.210.98CG70y=5.02+1.20x0.960.91CG71y=4.67+1.68x1.570.93CG72y=4.70+1.91x1.440.94CG73y=4.55+1.59x1.910.93CG74y=4.51+1.18x2.580.99CG75y=4.55+1.22x2.350.99CG76y=4.46+1.24x2.720.98CG77y=4.55+1.19x2.400.96CG78y=4.83+1.36x1.340.96CG79y=4.88+1.37x1.230.93CG80y=4.69+1.47x1.620.99CG81y=4.72+1.41x1.570.93CG82y=4.90+1.48x1.180.95CG83y=4.86+1.49x1.240.98CG84y=4.61+1.38x1.930.97CG85y=4.38+1.36x0.460.96CG86y=4.56+1.52x1.960.98CG87y=4.95+1.07x1.110.99CG88y=4.53+1.72x1.880.91CG89y=4.50+1.33x2.350.96CG90y=4.66+1.28x1.840.97CG91y=4.60+1.13x2.250.992.2吡噻菌胺對(duì)橡膠樹膠孢炭疽菌敏感性基線的建立91株橡膠樹膠孢炭疽菌對(duì)吡噻菌胺感性頻率分布呈連續(xù)單峰曲線，接近正態(tài)分布（圖1）。其中沒有發(fā)現(xiàn)敏感性顯著下降的菌株，表明試驗(yàn)所測(cè)菌株均為吡噻菌胺的野生敏感型。所以，該敏感性頻率分布曲線可以作為橡膠樹膠孢炭疽菌對(duì)吡噻菌胺的敏感性基線。圖191株橡膠樹膠孢炭疽菌對(duì)吡噻菌胺的敏感性分布Fig.1Frequencydistributionofsensitivityof91C.

gloeosporioidesisolatestopenthiopyrad3．總結(jié)與展望由膠孢炭疽菌引起的橡膠樹炭疽病，嚴(yán)重威脅著海南當(dāng)?shù)氐南鹉z樹種植業(yè)，張春霞等于2008年，在云南的西雙版納發(fā)現(xiàn)國內(nèi)首例由尖孢炭疽菌引起的橡膠樹炭疽病[9]。隨著橡膠樹炭疽病研究的深入，越來越多的病原菌開始出現(xiàn)，蔣桂芝等[10]在云南橡膠園發(fā)現(xiàn)一種新的橡膠樹炭疽病，經(jīng)鑒定，確認(rèn)病原菌是博寧炭疽Colletotrichumboninense，但是群體數(shù)量極少；在2018年的一篇文獻(xiàn)中，作者指出中國的優(yōu)勢(shì)種為膠孢炭疽菌復(fù)合群中的C.siamense和C.fructicola[11]。從以上證據(jù)中不難發(fā)現(xiàn)，膠孢炭疽菌作為橡膠樹膠孢炭疽菌的主要病原菌，具有重要的研究價(jià)值和前景。本研究進(jìn)行了新型SDHI類殺菌劑吡噻菌胺對(duì)于橡膠樹膠孢炭疽菌的EC50測(cè)定，并且建立了敏感性基線。在采集到的91株橡膠樹膠孢炭疽菌的菌株中，隨機(jī)挑選了45株進(jìn)行分子鑒定，發(fā)現(xiàn)以C.siamense菌株居多，其次為C.fructicola菌株，均為目前國內(nèi)造成橡膠樹炭疽病的主要病原物，因此采用本研究此前收集到的菌株進(jìn)行試驗(yàn)，確實(shí)具有一定的代表性。通過測(cè)定分離得到的91株橡膠樹膠孢炭疽菌對(duì)吡噻菌胺的敏感性，具體分布范圍為0.23~3.38mg/L，計(jì)算得EC50的平均值為1.68±0.65mg/L。其中沒有發(fā)現(xiàn)敏感性顯著下降的菌株，表明試驗(yàn)所測(cè)菌株均為吡噻菌胺的野生敏感型，證明該敏感性頻率分布曲線可以作為橡膠樹膠孢炭疽菌對(duì)吡噻菌胺的敏感性基線。盡管相比于曹學(xué)仁[12]與林春花[13]等測(cè)定的多菌靈和咪鮮胺殺菌劑的EC50平均值，本次實(shí)驗(yàn)的吡噻菌胺的平均EC50值略高，但是仍然在可接受的范圍內(nèi)。從目前田間殺菌劑的使用情況來看，包括吡噻菌胺在內(nèi)的新型SDHI類殺菌劑并沒有得到實(shí)際應(yīng)用，本研究采集到的橡膠樹膠孢炭疽菌，在實(shí)驗(yàn)過程中，并沒有發(fā)現(xiàn)抗藥性菌株，這意味著SDHI類殺菌劑具有潛在的應(yīng)用前景，且橡膠樹膠孢炭疽菌對(duì)其不易抗藥性，從而吡噻菌胺可用于防治橡膠樹膠孢炭疽病，并通過多種農(nóng)藥的交替使用，進(jìn)一步延緩橡膠樹炭疽菌的抗藥性的產(chǎn)生，降低其抗藥性風(fēng)險(xiǎn)[14]。

致謝本篇論文是在梁曉宇老師的耐心指導(dǎo)下完成的，在此前的實(shí)驗(yàn)中，我碰到諸多困難，都是梁老師在細(xì)心地指導(dǎo)，告知我詳細(xì)的操作方法。從開始選擇課題，到試驗(yàn)過程中，因?yàn)槲医佑|試驗(yàn)的時(shí)間比較晚，很多試驗(yàn)常識(shí)都不了解，是梁老師的指導(dǎo)跟糾正，讓我在課題研究以及對(duì)于科研一途的探索，有了更多的學(xué)習(xí)，并積累了許多經(jīng)驗(yàn)。同時(shí)，在做試驗(yàn)的過程中，梁老師體現(xiàn)出來的專業(yè)素養(yǎng)，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)牟僮?，以及?xì)致入微的觀察力，都讓我感到深深的佩服，我由衷的感謝梁老師一直以來的幫助跟指導(dǎo)，在此，我表示深刻的感謝。此外，在做實(shí)驗(yàn)這段時(shí)間，同實(shí)驗(yàn)室的師兄師姐給予了我很大的幫助，彭昀師兄，董國然師兄，杜艷楠師姐，龍明滕師姐以及鄒麗君師姐，從我剛進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室時(shí)，就耐心的指導(dǎo)我，學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)室的基本知識(shí)，在試驗(yàn)過程中，無私的幫助我，為試驗(yàn)的順利開展提供了莫大的幫助，同時(shí)提供了很多試驗(yàn)材料，在論文書寫上也給予了支持，各位師兄師姐的幫助，我會(huì)牢牢記住。

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