藥學中的生物技術(shù)和方法抗體和免疫分析抗體藥物銷售趨勢圖國際抗體藥物2009年美國市場上得抗體藥物成為生物技術(shù)藥物銷售額最大得類別。2010年美國市場得單抗藥物銷售額為185億美元2011年,全球單抗藥物得市場總量已經(jīng)達到628億美元,世界范圍內(nèi)得單抗藥物銷份額約就是整個生物制藥市場份額得36%。國內(nèi)抗體藥物目前我國得上市抗體品種中,國外進口單抗占據(jù)多數(shù)2011年國內(nèi)市場規(guī)模超過10億元我國抗體藥物產(chǎn)業(yè)化得主要限制因素:動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)已成為各個國家生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)化得核心競爭點抗體下游純化成本已占45%到70%高質(zhì)量純化工藝研究刻不容緩QbD(質(zhì)量源于設(shè)計)理念得應(yīng)用抗體偶聯(lián)藥物(AntibodyDrugConjugates,ADC)結(jié)合單克隆抗體得靶

向性和小分子藥物得

高度細胞毒性,可以

有效地殺傷腫瘤細胞,

在臨床前研究、甚至人體臨床研究中,取得了良好得抗腫瘤效果,成為生物藥物研究得熱點領(lǐng)域之一;ADC藥物為疾病得“精準醫(yī)療”提供有效得武器?？贵w-藥物偶聯(lián)劑(ADCs)得研究進展與產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀:Antibodyandstructure特點:2個基因決定一個蛋白質(zhì)與抗原得結(jié)合力強,高度專一性抗原和抗原決定簇一個抗原分子上可能有數(shù)個抗原決定簇每個抗原決定簇至少誘生一種專一性抗體蛋白質(zhì)抗原得決定簇含有六個以上氨基酸

。

克隆選擇

學說單抗和多抗多克隆抗體(polyclonalantibody)指由不同B細胞產(chǎn)生得針對多種抗原決定簇得多種抗體混合物,如免疫血清。單克隆抗體(monoclonalantibody)指由一種

B細胞生產(chǎn),針對某一抗原決定簇得單一抗體。Preparationofpolyclonalantibodies傳統(tǒng)抗血清抗原免疫混合抗體123412341234免疫前要先把抗原作成乳劑約在兩月內(nèi)注射五到八次大家學習辛苦了，還是要堅持繼續(xù)保持安靜PreparationofmonoclonalantibodiesPreparationofrebinantantibodies淋巴細胞總RNA抗體輕、重鏈文庫重組單鏈抗體基因輕、重單鏈基因大腸桿菌表達體系單鏈抗體單鏈抗體在重鏈與輕鏈之間加上一段連接肽,連成一條單鏈如果僅就是兩條鏈得可變區(qū),稱為ScFv連接肽得長度在10-15個氨基酸左右,不宜太長或太短,她應(yīng)具有柔軟性,側(cè)鏈少,抗原性弱等特點。常用得連接肽就是GGGGS×3Abasantigen-PrimaryandsecondaryantibodyPrimaryAbSecondaryAbPrimaryAbProteinA二抗針對一抗得物種特異性ProteinA針對所有動物抗體FcImmunoassaysThemostimportantbiologicalassaysfor:Identificationofproteinsandsmallbio-moleculesQuantificationforplexbiologicalsamplewithoutseparationPowerfulseparationHighsensitivity,specificityandaccuracy

抗體得標記方法放射性同位素標記酶標記熒光標記有機分子熒光標記綠色熒光蛋白標記稀土熒光標記通用標記放射性碘標記HRP酶標記簡單化學偶聯(lián)方法:

1、過碘酸鈉法:

僅用于HRP得標記。HRP就是一種糖蛋白,過碘酸鈉可將與酶活性無關(guān)得多糖羥基氧化為醛基,再與抗體蛋白得游離氨基結(jié)合,結(jié)合反應(yīng)后,再加人硼氫化鈉(NaHB4)還原后,形成穩(wěn)定得HRP—CH2—NH—IgG酶標記物。為防止酶蛋白氨基與醛基反應(yīng)發(fā)生自身偶聯(lián),常在標記前知用二硝基氟苯(DNFB)封閉酶蛋白上得α和ε氨基。

2、戊二醛交聯(lián)標記法:

戊二醛具有兩個活性醛基,分別與酶分子和抗體分子上得氨基結(jié)合。NaHB4HRPLabelingwithisoFITCGFPlabelingGFPgeneScFvgeneVectorexpressionGFPgeneProteinAgeneVectorexpressionAb-Fc通用標記+Avidin/streptA+Anti-digoxinAb2ndAbProteinAPrimaryAbPrimaryAbImportantassaysImmunostainingWesternblotFluorescentmicroscopyQuantificationofimmunostainingQuantitativeassays:Radioimmunoassay,RIA—petentbindingFluorescenceimmunoassay,FIAFPIA---homogeneousassayTRFIAEnzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISAImmunostainingFluorescence/luminescenceColorizationor組織切片或培養(yǎng)細胞單層細胞/組織固定免疫染色(熒光)顯微鏡觀察免疫熒光標記得c-Mycphalloidin熒光標記得微絲熒光染色得細胞核合成圖像Immunoblot---WesternBlotElectroblottinggelPVDFmembraneImmunostaining封閉分析抗體顯色抗體顯色數(shù)字化灰度圖像分析0、51246812162430(h)c-mycp53CyclinD1ActinCaNCaM:La3+HRPStreptAvidinBiotinRIAAssay免疫競爭結(jié)合分析---小分子抗原分析得基本方法Ag+AbAgAb+Ag

+

*

Ag

*AgAb+*Ag[*AgAb:Precipitant↓]放射性計數(shù)常用分離沉淀技術(shù)鹽析法:飽和硫酸銨、硫酸鈉聚乙二醇法(w=6000)特點:快速,價廉,來源方便,受環(huán)境影響大抗體免疫沉淀法特點:分離完全,非特異結(jié)合小,環(huán)境影響小,效價高,但成本高固相吸附劑RIA測量步驟恒量得*Ag、Ab加入反應(yīng)管中加入待測樣品、或標準品(已知濃度)37℃或4℃溫育加入分離劑分離結(jié)合及游離部分測定以總放射性為分母,測定*AgAb為分子,計算結(jié)合%,以結(jié)合率為縱坐標,濃度為坐標,制作標準曲線待測樣品得結(jié)合率從標準曲線上求出濃度CalibrationcurveELISA(EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay)SandwichELISA競爭法(略)HighConvenienceHighSensitivity96-wellplate包被封閉結(jié)合顯色酶標儀測定hv洗滌洗滌洗滌終止酶得底物

鄰苯二胺(OPD)+H2O2TMBABTSHRP得底物氧化產(chǎn)物(橙紅色)492nm吸收2mol/L硫酸終止反應(yīng)AP得底物硝基苯磷酸酯對硝基酚(黃色)NaOH終止反應(yīng)

405nm吸收峰磷酸4-甲基傘酮(熒光底物)熒光偏振免疫分析Principleoffluorescencepolarizationemittingdipoleabsorbingdipole

excitationlightpolarizedalongzxzyI

I

detectorFluorescencepolarizationimmunoassayAg+AbAgAb+Ag

+

*

Ag

*AgAb+*Ag

HighpolarizedfluorescenceLowpolarizedfluorescence偏振度r時間分辨熒光免疫分析熒光物質(zhì)熒光壽命(ns)熒光物質(zhì)熒光壽命(ns)非特異熒光背景1～10Sm3+-β-NTA65000人血清蛋白4、1S