基于siRNA技術(shù)靶向HLA-E基因?qū)Ω伟┘毎鸑K敏感性的影響及機制研究一、引言1.1研究背景與意義肝癌，作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率長期居高不下?！陡伟┝餍胁W(xué)現(xiàn)狀》的數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示，2018年中國新發(fā)肝癌病例高達39萬多人，位居新發(fā)惡性腫瘤的第三位；同年，因肝癌死亡的人數(shù)約36萬多，在惡性腫瘤死亡人數(shù)中亦位列第三，且全世界47%的肝癌發(fā)生在中國。肝癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，錯過了最佳手術(shù)時機。中晚期肝癌患者往往對傳統(tǒng)的化療和放療敏感性較低，治療效果不佳，5年生存率僅為12%左右，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生存預(yù)期。近年來，隨著對腫瘤免疫治療研究的深入，NK細胞作為人體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在肝癌治療中展現(xiàn)出獨特的潛力，成為研究熱點。NK細胞是一種天然免疫細胞，無需預(yù)先致敏，就能直接識別并殺傷腫瘤細胞。其殺傷機制主要包括：通過釋放穿孔素和顆粒酶，直接裂解腫瘤細胞；分泌多種細胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，間接殺傷腫瘤細胞；通過抗體依賴的細胞介導(dǎo)的細胞毒性作用（ADCC），識別并殺傷被抗體包被的腫瘤細胞。臨床研究表明，NK細胞治療在晚期肝癌患者中取得了一定的成效。解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心的研究團隊通過體外擴增和激活NK細胞，并將其應(yīng)用于晚期肝癌患者的治療，結(jié)果顯示腫瘤控制率達到了80%，部分患者腫瘤縮小明顯，病情穩(wěn)定時間顯著延長，甚至實現(xiàn)了病情的完全緩解。這一研究成果充分證明了NK細胞在肝癌免疫治療中的可行性和有效性。然而，腫瘤細胞在長期的進化過程中，形成了多種免疫逃逸機制，其中HLA-E基因的表達與NK細胞對肝癌細胞的殺傷作用密切相關(guān)，是影響NK細胞治療效果的關(guān)鍵因素之一。HLA-E基因編碼的HLA-E分子屬于主要組織相容性復(fù)合體（MHC）I類樣分子，它能夠與NK細胞表面的抑制性受體CD94/NKG2A結(jié)合，傳遞抑制信號，抑制NK細胞的殺傷活性，從而使腫瘤細胞逃避NK細胞的免疫監(jiān)視。研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌組織中，HLA-E基因的表達水平明顯高于正常肝組織，且HLA-E基因高表達的肝癌患者預(yù)后較差。對肝癌Bel7402細胞進行研究時發(fā)現(xiàn)，上調(diào)HLA-E基因的表達后，NK細胞對其靶殺傷作用顯著降低；而封閉靶細胞上HLA-E分子與NK細胞受體結(jié)合的相應(yīng)位點后，NK細胞對靶細胞的殺傷能力則有所提高。這表明HLA-E基因在肝癌細胞的免疫逃逸過程中發(fā)揮著重要作用，阻斷HLA-E基因的表達有望增強NK細胞對肝癌細胞的殺傷活性，提高肝癌的免疫治療效果。本研究旨在通過siRNA技術(shù)沉默HLA-E基因，深入探討其對肝癌細胞NK敏感性的影響，揭示HLA-E基因在肝癌免疫逃逸中的分子機制，為肝癌的免疫治療提供新的靶點和理論依據(jù)。這一研究具有重要的臨床意義，有望為肝癌患者提供更加有效的治療策略，改善患者的預(yù)后，提高患者的生存質(zhì)量，在肝癌治療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀近年來，隨著肝癌發(fā)病率和死亡率的不斷攀升，肝癌的治療成為全球醫(yī)學(xué)研究的重點領(lǐng)域。NK細胞治療作為一種新興的免疫治療方法，為肝癌患者帶來了新的希望。國內(nèi)外眾多學(xué)者圍繞肝癌細胞NK敏感性、HLA-E基因表達及功能、siRNA技術(shù)應(yīng)用等方面展開了深入研究，取得了一系列有價值的成果。在肝癌細胞NK敏感性方面，國內(nèi)外研究均表明NK細胞在肝癌免疫治療中具有重要作用。解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心通過體外擴增和激活NK細胞，并將其應(yīng)用于晚期肝癌患者的治療，結(jié)果顯示腫瘤控制率達到了80%，部分患者腫瘤縮小明顯，病情穩(wěn)定時間顯著延長，甚至實現(xiàn)了病情的完全緩解。上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院的研究團隊發(fā)現(xiàn)，肝癌患者外周血中的NK細胞數(shù)量與生存率和預(yù)后密切相關(guān)，提高NK細胞活性，有助于預(yù)防肝癌復(fù)發(fā)，改善患者預(yù)后。國外研究也有類似發(fā)現(xiàn)，美國MD安德森癌癥中心的研究表明，NK細胞免疫療法在肝癌治療中有著極大的應(yīng)用價值，能夠有效抑制腫瘤細胞的生長和擴散。然而，腫瘤細胞的免疫逃逸機制使得NK細胞對肝癌細胞的殺傷作用受到限制，如何提高肝癌細胞對NK細胞的敏感性，增強NK細胞的殺傷活性，成為當(dāng)前研究的關(guān)鍵問題。關(guān)于HLA-E基因表達及功能的研究，國內(nèi)外學(xué)者取得了較為一致的結(jié)論。HLA-E基因編碼的HLA-E分子屬于MHCI類樣分子，它能夠與NK細胞表面的抑制性受體CD94/NKG2A結(jié)合，傳遞抑制信號，抑制NK細胞的殺傷活性，從而使腫瘤細胞逃避NK細胞的免疫監(jiān)視。中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院的研究人員通過實驗證實，在肝癌組織中，HLA-E基因的表達水平明顯高于正常肝組織，且HLA-E基因高表達的肝癌患者預(yù)后較差。對肝癌Bel7402細胞進行研究時發(fā)現(xiàn)，上調(diào)HLA-E基因的表達后，NK細胞對其靶殺傷作用顯著降低；而封閉靶細胞上HLA-E分子與NK細胞受體結(jié)合的相應(yīng)位點后，NK細胞對靶細胞的殺傷能力則有所提高。國外研究也指出，HLA-E基因在多種腫瘤細胞中高表達，是導(dǎo)致腫瘤細胞免疫逃逸的重要因素之一。但目前對于HLA-E基因在肝癌免疫逃逸中的具體分子機制，以及如何精準(zhǔn)調(diào)控HLA-E基因的表達，仍有待進一步深入研究。在siRNA技術(shù)應(yīng)用方面，國內(nèi)外研究都顯示出siRNA技術(shù)在基因沉默領(lǐng)域的巨大潛力。國內(nèi)研究團隊利用siRNA技術(shù)成功沉默了多種腫瘤相關(guān)基因，抑制了腫瘤細胞的生長和增殖。浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院的研究人員通過siRNA沉默乳腺癌細胞中的關(guān)鍵基因，顯著降低了腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。國外研究也廣泛應(yīng)用siRNA技術(shù)進行基因功能研究和疾病治療探索，在動物模型和臨床試驗中取得了一定的進展。然而，將siRNA技術(shù)應(yīng)用于肝癌治療，尤其是針對HLA-E基因的沉默，目前研究相對較少，且存在siRNA轉(zhuǎn)染效率低、穩(wěn)定性差等問題，需要進一步優(yōu)化和改進。綜合國內(nèi)外研究現(xiàn)狀，雖然在肝癌細胞NK敏感性、HLA-E基因表達及功能、siRNA技術(shù)應(yīng)用等方面取得了一定成果，但仍存在諸多不足。在肝癌免疫治療中，如何有效克服腫瘤細胞的免疫逃逸機制，提高NK細胞對肝癌細胞的殺傷效果，尚未得到有效解決；對于HLA-E基因在肝癌免疫逃逸中的分子機制，研究還不夠深入全面；siRNA技術(shù)在肝癌治療中的應(yīng)用還處于探索階段，面臨著許多技術(shù)難題和挑戰(zhàn)。因此，本研究擬通過siRNA技術(shù)沉默HLA-E基因，深入探究其對肝癌細胞NK敏感性的影響，旨在為肝癌的免疫治療提供新的靶點和理論依據(jù)，彌補當(dāng)前研究的不足，為肝癌患者的治療開辟新的路徑。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在通過siRNA技術(shù)沉默HLA-E基因，深入探究其對肝癌細胞NK敏感性的影響，為肝癌的免疫治療提供新的靶點和理論依據(jù)。具體研究目標(biāo)和內(nèi)容如下：研究目標(biāo)：明確siRNA沉默HLA-E基因?qū)Ω伟┘毎鸑K敏感性的作用，揭示HLA-E基因在肝癌免疫逃逸中的分子機制，為肝癌免疫治療提供新的理論基礎(chǔ)和潛在治療靶點。研究內(nèi)容：首先，篩選并合成針對HLA-E基因的特異性siRNA序列。運用生物信息學(xué)方法，對HLA-E基因序列進行分析，結(jié)合相關(guān)研究報道和數(shù)據(jù)庫資源，篩選出潛在的有效siRNA序列，并通過化學(xué)合成方法獲得高質(zhì)量的siRNA。其次，將合成的siRNA轉(zhuǎn)染至肝癌細胞系，檢測HLA-E基因的表達水平變化。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法或電穿孔法等常用的轉(zhuǎn)染技術(shù)，將siRNA導(dǎo)入肝癌細胞系中，通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）等實驗技術(shù)，檢測轉(zhuǎn)染后不同時間點HLA-E基因在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達變化，驗證siRNA對HLA-E基因的沉默效果。再次，檢測沉默HLA-E基因后肝癌細胞對NK細胞殺傷敏感性的變化。將轉(zhuǎn)染siRNA后的肝癌細胞與NK細胞進行共培養(yǎng)，利用乳酸脫氫酶（LDH）釋放法、流式細胞術(shù)等實驗方法，檢測NK細胞對肝癌細胞的殺傷活性，分析沉默HLA-E基因?qū)Ω伟┘毎鸑K敏感性的影響。然后，探究沉默HLA-E基因影響肝癌細胞NK敏感性的分子機制。通過基因芯片、蛋白質(zhì)組學(xué)等高通量技術(shù)，分析沉默HLA-E基因前后肝癌細胞中差異表達的基因和蛋白質(zhì)，結(jié)合生物信息學(xué)分析，篩選出可能參與調(diào)控NK細胞殺傷敏感性的信號通路和關(guān)鍵分子，并通過相關(guān)實驗進行驗證，深入揭示其分子機制。最后，在動物模型中驗證siRNA沉默HLA-E基因增強肝癌細胞NK敏感性的效果。建立肝癌動物模型，將轉(zhuǎn)染siRNA的肝癌細胞接種至動物體內(nèi)，同時給予NK細胞治療，觀察腫瘤生長情況、動物生存期等指標(biāo)，評估siRNA沉默HLA-E基因聯(lián)合NK細胞治療對肝癌的治療效果，為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究綜合運用細胞實驗、分子生物學(xué)技術(shù)、動物實驗等多種方法，系統(tǒng)地探究siRNA沉默HLA-E基因?qū)Ω伟┘毎鸑K敏感性的影響，具體研究方法與技術(shù)路線如下：細胞實驗：選用人肝癌細胞系HepG2、Huh7等作為研究對象，同時獲取健康志愿者外周血單個核細胞，通過密度梯度離心法分離出NK細胞。將肝癌細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，待細胞生長至對數(shù)期時進行后續(xù)實驗。運用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將針對HLA-E基因設(shè)計合成的siRNA轉(zhuǎn)染至肝癌細胞中，以未轉(zhuǎn)染的肝癌細胞和轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA的肝癌細胞作為對照組。轉(zhuǎn)染48-72小時后，收集細胞，采用實時熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)，分別從mRNA和蛋白質(zhì)水平檢測HLA-E基因的表達情況，驗證siRNA的沉默效果。然后，將轉(zhuǎn)染后的肝癌細胞與NK細胞按照不同比例（如1:5、1:10、1:20）進行共培養(yǎng)，培養(yǎng)4-6小時后，利用乳酸脫氫酶釋放法檢測NK細胞對肝癌細胞的殺傷活性；采用流式細胞術(shù)，通過AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測肝癌細胞的凋亡情況，以此評估沉默HLA-E基因后肝癌細胞對NK細胞殺傷的敏感性變化。分子生物學(xué)技術(shù)：提取轉(zhuǎn)染siRNA前后肝癌細胞的總RNA和總蛋白，利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測HLA-E基因及相關(guān)信號通路分子（如STAT3、NF-κB等）mRNA的表達水平，計算目的基因的相對表達量。運用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)，檢測HLA-E蛋白及相關(guān)信號通路關(guān)鍵蛋白的表達變化，分析蛋白條帶的灰度值，確定蛋白表達量的差異。為了進一步探究沉默HLA-E基因影響肝癌細胞NK敏感性的分子機制，采用基因芯片技術(shù)對轉(zhuǎn)染前后肝癌細胞的基因表達譜進行分析，篩選出差異表達基因，并通過生物信息學(xué)分析，富集相關(guān)的信號通路；運用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對細胞內(nèi)蛋白質(zhì)進行分離和鑒定，尋找差異表達的蛋白質(zhì)，結(jié)合基因芯片結(jié)果，深入研究其分子機制。同時，利用RNA干擾技術(shù)和基因過表達技術(shù)，對篩選出的關(guān)鍵基因進行功能驗證，通過檢測NK細胞對肝癌細胞的殺傷活性和凋亡情況，明確關(guān)鍵基因在調(diào)控肝癌細胞NK敏感性中的作用。動物實驗：選取4-6周齡的BALB/c裸鼠，在其右側(cè)腋下皮下接種適量的肝癌細胞，建立肝癌動物模型。待腫瘤體積生長至約100-150mm3時，將裸鼠隨機分為實驗組、對照組和陰性對照組，每組6-8只。實驗組裸鼠瘤內(nèi)注射轉(zhuǎn)染siRNA的肝癌細胞懸液，對照組裸鼠瘤內(nèi)注射未轉(zhuǎn)染的肝癌細胞懸液，陰性對照組裸鼠瘤內(nèi)注射轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA的肝癌細胞懸液。同時，通過尾靜脈注射的方式，給實驗組和對照組裸鼠注入一定數(shù)量的NK細胞，陰性對照組注入等量的PBS。定期測量腫瘤的長徑和短徑，根據(jù)公式V=0.5×長徑×短徑2計算腫瘤體積，觀察腫瘤生長情況。在實驗終點時，處死裸鼠，取出腫瘤組織，稱重并進行病理分析，檢測腫瘤組織中HLA-E基因的表達水平以及NK細胞的浸潤情況，評估siRNA沉默HLA-E基因聯(lián)合NK細胞治療對肝癌的治療效果。本研究的技術(shù)路線從細胞水平到動物水平，層層遞進，通過多維度的實驗方法，深入探究siRNA沉默HLA-E基因?qū)Ω伟┘毎鸑K敏感性的影響及分子機制，為肝癌的免疫治療提供堅實的理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)，技術(shù)路線圖見圖1-1。[此處插入技術(shù)路線圖1-1][此處插入技術(shù)路線圖1-1]二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1肝癌概述肝癌，作為一種常見且嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤，主要包括肝細胞癌（HCC）、膽管細胞癌（CCC）和混合型肝癌三種類型。其中，肝細胞癌最為常見，約占肝癌病例的75%-85%，主要由肝細胞發(fā)生癌變引起，其發(fā)病通常與慢性乙型肝炎、丙型肝炎病毒感染、長期酗酒、非酒精性脂肪性肝病等因素密切相關(guān)。這些致病因素會導(dǎo)致肝細胞反復(fù)受損和修復(fù)，進而增加細胞癌變的風(fēng)險。膽管細胞癌起源于膽管上皮細胞，發(fā)病原因可能與膽管結(jié)石、膽管炎、原發(fā)性硬化性膽管炎等膽道疾病有關(guān)，也可能與某些遺傳因素和環(huán)境因素相關(guān)?；旌闲透伟﹦t同時具有肝細胞癌和膽管細胞癌兩種成分，其發(fā)病機制目前尚不明確，可能與肝細胞和膽管上皮細胞的共同起源以及遺傳因素等有關(guān)。肝癌的發(fā)病機制較為復(fù)雜，涉及多個基因和信號通路的異常。肝炎病毒感染是肝癌發(fā)生的重要危險因素之一，乙肝病毒（HBV）和丙肝病毒（HCV）感染后，病毒可在肝細胞內(nèi)復(fù)制，引發(fā)炎癥反應(yīng)和肝細胞損傷。持續(xù)的炎癥反應(yīng)會促使肝臟纖維化和肝硬化的發(fā)展，進而增加肝癌的發(fā)生風(fēng)險。同時，病毒感染還可能導(dǎo)致肝細胞內(nèi)的基因發(fā)生突變，如p53、β-catenin等基因的突變，這些基因突變會影響細胞的正常生長、分化和凋亡過程，促進肝癌的發(fā)生。細胞凋亡和增殖失衡也是肝癌發(fā)病的關(guān)鍵機制之一，肝癌細胞的凋亡過程受到抑制，而細胞增殖過程則被激活，導(dǎo)致肝癌細胞的過度生長。此外，肝癌細胞還可以分泌一些因子，促進血管內(nèi)皮細胞的增殖和血管生成，為肝癌的生長提供充足的營養(yǎng)和氧氣，同時，肝癌細胞還能通過多種機制逃避免疫系統(tǒng)的攻擊，得以生長和擴散。肝癌對人類健康危害巨大，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生存預(yù)期。在肝癌早期，患者可能無明顯癥狀，隨著病情進展，會逐漸出現(xiàn)肝區(qū)疼痛、腹脹、乏力、消瘦、黃疸等表現(xiàn)，部分患者還可能伴有肝硬化的癥狀，如腹水、脾大等。這些癥狀不僅會給患者帶來身體上的痛苦，還會對患者的心理造成沉重打擊。由于肝癌起病隱匿，早期診斷困難，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，錯過了最佳手術(shù)時機。中晚期肝癌患者往往對傳統(tǒng)的化療和放療敏感性較低，治療效果不佳，5年生存率僅為12%左右，給患者家庭和社會帶來了沉重的經(jīng)濟負擔(dān)和精神壓力。目前，肝癌的治療方法主要包括手術(shù)治療、肝移植、消融治療、放射治療、化學(xué)治療、靶向治療和免疫治療等。對于早期肝癌患者，手術(shù)切除是主要的治療方法，包括肝葉切除術(shù)、肝移植等，早期手術(shù)治療效果較好，部分患者可實現(xiàn)臨床治愈。然而，由于肝癌早期癥狀不明顯，很多患者確診時已無法進行手術(shù)切除。對于不能手術(shù)的肝癌患者，可以選擇消融治療、放射治療、化學(xué)治療、靶向治療等。消融治療如射頻消融、微波消融等，通過物理方法破壞腫瘤組織；放射治療利用高能射線殺死腫瘤細胞；化學(xué)治療則使用化學(xué)藥物抑制腫瘤細胞的生長和分裂；靶向治療針對腫瘤細胞的特定分子靶點，精準(zhǔn)抑制腫瘤細胞的生長。免疫治療作為一種新興的治療方法，通過激活機體自身的免疫系統(tǒng)來殺傷腫瘤細胞，為肝癌治療帶來了新的希望。NK細胞免疫治療作為肝癌免疫治療的重要組成部分，具有獨特的優(yōu)勢和潛力。NK細胞是機體重要的免疫細胞，具有天然的細胞毒性，無需預(yù)先致敏，就能直接識別并殺傷腫瘤細胞。其殺傷機制主要包括釋放穿孔素和顆粒酶，直接裂解腫瘤細胞；分泌多種細胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，間接殺傷腫瘤細胞；通過抗體依賴的細胞介導(dǎo)的細胞毒性作用（ADCC），識別并殺傷被抗體包被的腫瘤細胞。臨床研究表明，NK細胞治療在晚期肝癌患者中取得了一定的成效，解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心通過體外擴增和激活NK細胞，并將其應(yīng)用于晚期肝癌患者的治療，結(jié)果顯示腫瘤控制率達到了80%，部分患者腫瘤縮小明顯，病情穩(wěn)定時間顯著延長，甚至實現(xiàn)了病情的完全緩解。NK細胞免疫治療不僅能直接殺傷腫瘤細胞，還能調(diào)節(jié)機體的免疫功能，增強機體對腫瘤細胞的免疫監(jiān)視和殺傷能力，且副作用相對較小，對患者的生活質(zhì)量影響較小。隨著研究的不斷深入，NK細胞免疫治療有望成為肝癌綜合治療的重要手段之一，為肝癌患者帶來更多的生存希望。2.2NK細胞與腫瘤免疫NK細胞作為人體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在腫瘤免疫中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。NK細胞屬于淋巴細胞的一種，是機體天然免疫系統(tǒng)的核心細胞，其獨特的生物學(xué)特性使其在抗腫瘤免疫中具有重要地位。NK細胞主要來源于骨髓造血干細胞，在骨髓中發(fā)育成熟后，進入外周血和淋巴組織，廣泛分布于人體的各個器官和組織中。NK細胞具有多種獨特的特點，使其在抗腫瘤免疫中表現(xiàn)出色。NK細胞無需預(yù)先致敏，就能迅速識別并殺傷腫瘤細胞，這種天然的殺傷活性使其能夠在腫瘤發(fā)生的早期階段就發(fā)揮作用，成為機體抵御腫瘤的第一道防線。與T細胞和B細胞不同，NK細胞不依賴于抗原特異性識別，其表面表達多種活化受體和抑制受體，通過這些受體與靶細胞表面相應(yīng)配體的相互作用，來調(diào)節(jié)NK細胞的活性。當(dāng)活化信號占主導(dǎo)時，NK細胞被激活，發(fā)揮殺傷功能；而當(dāng)抑制信號占優(yōu)勢時，NK細胞的活性則受到抑制。NK細胞還具有強大的細胞毒性，能夠通過釋放穿孔素和顆粒酶，直接裂解腫瘤細胞；同時，NK細胞還能分泌多種細胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，這些細胞因子不僅可以直接殺傷腫瘤細胞，還能調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，激活其他免疫細胞，增強機體的抗腫瘤免疫能力。NK細胞的抗腫瘤機制主要包括以下幾個方面。NK細胞能夠通過釋放穿孔素和顆粒酶來直接殺傷腫瘤細胞，穿孔素在鈣離子存在的情況下，能夠在靶細胞膜上形成小孔，使顆粒酶等物質(zhì)進入靶細胞內(nèi)，激活靶細胞內(nèi)的凋亡相關(guān)酶，導(dǎo)致靶細胞凋亡。NK細胞還能通過分泌細胞因子來間接殺傷腫瘤細胞，如分泌IFN-γ，激活巨噬細胞，增強其吞噬和殺傷腫瘤細胞的能力；分泌TNF-α，直接誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。NK細胞可以通過抗體依賴的細胞介導(dǎo)的細胞毒性作用（ADCC）殺傷腫瘤細胞，當(dāng)腫瘤細胞表面結(jié)合有特異性抗體時，NK細胞表面的Fc受體能夠識別并結(jié)合抗體的Fc段，從而激活NK細胞，殺傷腫瘤細胞。NK細胞還能通過表達死亡配體，如FasL和TRAIL，與腫瘤細胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。在肝癌免疫中，NK細胞同樣發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。臨床研究表明，肝癌患者外周血中的NK細胞數(shù)量與生存率和預(yù)后密切相關(guān)。解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心的研究團隊通過體外擴增和激活NK細胞，并將其應(yīng)用于晚期肝癌患者的治療，結(jié)果顯示腫瘤控制率達到了80%，部分患者腫瘤縮小明顯，病情穩(wěn)定時間顯著延長，甚至實現(xiàn)了病情的完全緩解。這充分證明了NK細胞在肝癌免疫治療中的可行性和有效性。NK細胞不僅能直接殺傷肝癌細胞，還能調(diào)節(jié)機體的免疫功能，增強機體對肝癌細胞的免疫監(jiān)視和殺傷能力。NK細胞可以激活T細胞、B細胞等其他免疫細胞，促進它們對肝癌細胞的殺傷作用；同時，NK細胞還能分泌細胞因子，調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，抑制肝癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移。然而，肝癌細胞也會通過多種機制來逃避NK細胞的免疫監(jiān)視，影響NK細胞對肝癌細胞的敏感性。肝癌細胞表面的主要組織相容性復(fù)合體（MHC）I類分子表達異常，MHCI類分子能夠與NK細胞表面的抑制性受體結(jié)合，傳遞抑制信號，抑制NK細胞的殺傷活性。當(dāng)肝癌細胞表面MHCI類分子表達下調(diào)或缺失時，NK細胞的抑制信號減弱，從而被激活，發(fā)揮殺傷作用；但部分肝癌細胞會通過上調(diào)MHCI類分子的表達，與NK細胞表面的抑制性受體結(jié)合，抑制NK細胞的活性，逃避NK細胞的殺傷。肝癌細胞還會分泌一些免疫抑制因子，如轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、白細胞介素-10（IL-10）等，這些因子能夠抑制NK細胞的活性，降低NK細胞對肝癌細胞的敏感性。TGF-β可以抑制NK細胞的增殖和活化，降低NK細胞分泌細胞因子的能力；IL-10則能抑制NK細胞表面活化受體的表達，減少NK細胞對腫瘤細胞的殺傷作用。腫瘤微環(huán)境中的其他細胞，如腫瘤相關(guān)巨噬細胞、髓源性抑制細胞等，也會通過與NK細胞相互作用，抑制NK細胞的活性，影響NK細胞對肝癌細胞的殺傷效果。腫瘤相關(guān)巨噬細胞可以分泌IL-10、TGF-β等免疫抑制因子，抑制NK細胞的功能；髓源性抑制細胞則能通過直接接觸或分泌活性氧等物質(zhì)，抑制NK細胞的活化和增殖。2.3HLA-E基因及其功能HLA-E基因是人類白細胞抗原（HLA）基因家族中的重要成員，屬于非經(jīng)典的MHCI類基因。其結(jié)構(gòu)與經(jīng)典的MHCI類基因相似，由8個外顯子和7個內(nèi)含子組成，與HLA-Ia基因的同源性為50％-90％。然而，HLA-E基因也具有自身獨特的特點，在外顯子7中有5個核苷酸丟失，從而產(chǎn)生了終止密碼子，這使得其編碼產(chǎn)物的分子質(zhì)量較HLA-Ia為小。這種特殊的基因結(jié)構(gòu)決定了HLA-E分子獨特的生物學(xué)功能和作用機制。HLA-E基因的表達受到多種因素的嚴(yán)格調(diào)控，其中轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控尤為關(guān)鍵。MHCI類分子HLA-A、-B、-C和HLA-G的先導(dǎo)序列衍生多肽對HLA-E分子在細胞表面的表達起著重要的調(diào)節(jié)作用。這些先導(dǎo)序列多肽能夠與HLA-E分子的抗原結(jié)合槽相互作用，其中HLA-G分子的先導(dǎo)序列多肽與HLA-E分子抗原結(jié)合槽的親和力最高。在胎盤形成過程中，胎兒絨毛外細胞滋養(yǎng)層表達高水平的HLA-G和少量的HLA-C，它們的先導(dǎo)肽均可與HLA-E分子結(jié)合，進而促進HLA-E分子在細胞表面的表達。此外，一些細胞因子也能夠影響HLA-E基因的表達，干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等可以上調(diào)HLA-E基因的表達，而轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）則可能抑制其表達。這些調(diào)控因素相互作用，共同維持著HLA-E基因表達的平衡，確保其在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮正常功能。在腫瘤免疫逃逸過程中，HLA-E基因扮演著重要角色。腫瘤細胞常常通過上調(diào)HLA-E基因的表達，使其表面的HLA-E分子與NK細胞表面的抑制性受體CD94/NKG2A結(jié)合，從而傳遞抑制信號，抑制NK細胞的殺傷活性，實現(xiàn)免疫逃逸。中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院的研究人員發(fā)現(xiàn)，在肝癌組織中，HLA-E基因的表達水平明顯高于正常肝組織，且HLA-E基因高表達的肝癌患者預(yù)后較差。對肝癌Bel7402細胞進行研究時發(fā)現(xiàn)，上調(diào)HLA-E基因的表達后，NK細胞對其靶殺傷作用顯著降低。這表明HLA-E基因的高表達能夠降低NK細胞對腫瘤細胞的敏感性，促進腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移。腫瘤細胞還可能通過其他機制，如改變HLA-E分子的糖基化修飾、調(diào)節(jié)HLA-E基因的轉(zhuǎn)錄后加工等，來增強其免疫逃逸能力。這些復(fù)雜的機制使得腫瘤細胞能夠逃避NK細胞的免疫監(jiān)視，給腫瘤治療帶來了巨大挑戰(zhàn)。HLA-E基因與NK細胞之間存在著密切的相互作用。NK細胞表面的CD94/NKG2A受體是識別HLA-E分子的主要受體，當(dāng)HLA-E分子與CD94/NKG2A受體結(jié)合時，會激活NK細胞內(nèi)的抑制性信號通路，抑制NK細胞的活化和殺傷功能。這一過程涉及多個信號分子的參與，如SHIP-1、SHP-1等，它們能夠通過去磷酸化作用，抑制NK細胞內(nèi)的活化信號傳導(dǎo)。然而，當(dāng)腫瘤細胞表面的HLA-E分子表達異?；蛉笔r，NK細胞的抑制信號減弱，NK細胞則被激活，發(fā)揮其殺傷腫瘤細胞的功能。一些研究還發(fā)現(xiàn)，NK細胞表面除了CD94/NKG2A受體外，可能還存在其他與HLA-E分子相互作用的受體，這些受體的協(xié)同作用可能進一步調(diào)節(jié)NK細胞對腫瘤細胞的殺傷活性。深入研究HLA-E基因與NK細胞之間的相互作用機制，對于揭示腫瘤免疫逃逸的本質(zhì)，開發(fā)有效的腫瘤免疫治療策略具有重要意義。2.4siRNA技術(shù)原理與應(yīng)用siRNA，即小干擾RNA，是一種長度約為21-23個核苷酸的雙鏈RNA分子，在基因表達調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。其介導(dǎo)基因沉默的機制基于轉(zhuǎn)錄后基因沉默（PTGS）現(xiàn)象，這是一種生物體內(nèi)普遍存在的、通過RNA分子調(diào)控基因表達的重要方式。當(dāng)細胞內(nèi)存在雙鏈RNA（dsRNA）時，dsRNA會被核酸酶Dicer識別并切割成多個siRNA雙鏈體。這些siRNA雙鏈體進一步與體內(nèi)的一些蛋白質(zhì)結(jié)合，形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）。在RISC中，siRNA雙鏈體中的一條鏈（引導(dǎo)鏈）會與靶mRNA的互補序列進行特異性堿基配對，然后RISC中的核酸酶活性成分，如Argonaute2（AGO2）蛋白，會對靶mRNA進行切割，從而導(dǎo)致靶mRNA的降解，實現(xiàn)基因沉默的效果。這一過程高度特異性，siRNA的序列與靶mRNA的互補程度決定了基因沉默的準(zhǔn)確性和效率。siRNA技術(shù)在基因功能研究和疾病治療領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用，為眾多科學(xué)研究和臨床實踐提供了有力的工具和新的思路。在基因功能研究中，siRNA技術(shù)能夠精準(zhǔn)地抑制特定基因的表達，通過觀察基因表達被抑制后細胞或生物體的表型變化，科學(xué)家可以深入了解該基因在生理和病理過程中的具體功能。通過設(shè)計針對某一未知功能基因的siRNA，將其導(dǎo)入細胞中，觀察細胞的生長、分化、代謝等方面的變化，從而推斷該基因的功能。在疾病治療方面，siRNA技術(shù)展現(xiàn)出了巨大的潛力。對于一些由基因異常表達引起的疾病，如腫瘤、遺傳性疾病、病毒感染性疾病等，siRNA可以特異性地沉默致病基因，阻斷疾病的發(fā)生發(fā)展過程。在腫瘤治療中，針對腫瘤細胞中高表達的致癌基因，設(shè)計并導(dǎo)入相應(yīng)的siRNA，能夠有效抑制致癌基因的表達，從而抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力。在病毒感染性疾病的治療中，siRNA可以靶向病毒基因，阻止病毒的復(fù)制和傳播，為治療病毒感染提供了新的策略。與傳統(tǒng)的基因治療方法相比，siRNA技術(shù)具有諸多獨特的優(yōu)勢。siRNA技術(shù)具有高度的特異性，能夠精確地靶向目標(biāo)基因，只對特定的基因進行沉默，而不會影響其他基因的正常表達，這大大降低了治療過程中的副作用和脫靶效應(yīng)。其作用效率高，少量的siRNA就能夠引發(fā)顯著的基因沉默效果，迅速抑制靶基因的表達。siRNA技術(shù)還具有設(shè)計和合成相對簡單、成本較低的優(yōu)點，便于大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用。然而，siRNA技術(shù)在實際應(yīng)用中也面臨一些挑戰(zhàn)，如siRNA的細胞攝取效率較低、在體內(nèi)容易被核酸酶降解、如何實現(xiàn)高效的靶向遞送等問題，需要進一步的研究和技術(shù)改進來克服。三、siRNA沉默HLA-E基因的實驗設(shè)計與實施3.1實驗材料與細胞系本實驗所需的主要試劑包括：針對HLA-E基因的特異性siRNA及陰性對照siRNA，均由專業(yè)生物公司如上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。siRNA序列的設(shè)計嚴(yán)格遵循相關(guān)原則，確保其對HLA-E基因具有高度特異性和高效的沉默效果。轉(zhuǎn)染試劑選用Lipofectamine3000試劑（Invitrogen公司），該試劑具有轉(zhuǎn)染效率高、細胞毒性低等優(yōu)點，能夠有效將siRNA導(dǎo)入肝癌細胞中。細胞培養(yǎng)所需的RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco公司），含有細胞生長所需的多種營養(yǎng)成分，能夠為肝癌細胞和NK細胞的生長提供良好的環(huán)境；胎牛血清（FBS，Gibco公司），富含多種生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)，可促進細胞的增殖和生長；青霉素-鏈霉素雙抗溶液（100×，Solarbio公司），用于防止細胞培養(yǎng)過程中的細菌污染，保證細胞培養(yǎng)的無菌環(huán)境。RNA提取試劑采用TRIzol試劑（Invitrogen公司），該試劑能夠快速、有效地提取細胞中的總RNA，為后續(xù)的基因表達檢測提供高質(zhì)量的樣本。反轉(zhuǎn)錄試劑盒選用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（TaKaRa公司），可將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以便進行實時熒光定量PCR檢測。實時熒光定量PCR試劑使用SYBRPremixExTaqII（TaKaRa公司），具有靈敏度高、特異性強等特點，能夠準(zhǔn)確檢測基因的表達水平。蛋白質(zhì)提取試劑為RIPA裂解液（Beyotime公司），可有效裂解細胞，提取細胞中的總蛋白。Westernblot所需的抗體包括抗HLA-E抗體（Abcam公司）、抗β-actin抗體（Proteintech公司）以及相應(yīng)的二抗（HRP標(biāo)記，JacksonImmunoResearch公司），用于檢測HLA-E蛋白的表達水平。實驗儀器主要有：CO?細胞培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），能夠精確控制培養(yǎng)環(huán)境的溫度、濕度和CO?濃度，為細胞的生長提供穩(wěn)定的條件；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），通過過濾空氣中的塵埃和微生物，提供一個無菌的操作環(huán)境，保證細胞培養(yǎng)和實驗操作的無菌性；倒置顯微鏡（Olympus公司），用于觀察細胞的形態(tài)、生長狀態(tài)和轉(zhuǎn)染效果，及時發(fā)現(xiàn)細胞的異常變化；高速冷凍離心機（Eppendorf公司），可在低溫條件下對細胞、核酸、蛋白質(zhì)等樣本進行離心分離，保證樣本的活性和純度；實時熒光定量PCR儀（ABI7500，ThermoFisherScientific公司），用于定量檢測基因的表達水平，具有高靈敏度、高準(zhǔn)確性和高通量的特點；電泳儀（Bio-Rad公司）和凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司），用于蛋白質(zhì)和核酸的電泳分離和檢測，通過凝膠成像系統(tǒng)可以清晰地觀察和分析電泳結(jié)果；恒溫搖床（NewBrunswickScientific公司），在細胞培養(yǎng)和實驗過程中，用于振蕩培養(yǎng)細胞或混合試劑，促進細胞的生長和反應(yīng)的進行。實驗選用人肝癌細胞系HepG2和Huh7，這兩種細胞系均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。HepG2細胞系來源于15歲白人男性青年的肝細胞癌，具有上皮細胞樣形態(tài)，貼壁生長，能夠表達甲胎蛋白、白蛋白等多種基因，在肝癌研究中應(yīng)用廣泛。Huh7細胞系是從一名日本男性肝癌患者的腫瘤組織中分離建立的，同樣具有肝癌細胞的典型特征，對研究肝癌的發(fā)病機制和治療方法具有重要價值。NK細胞來源于健康志愿者外周血，通過密度梯度離心法，利用淋巴細胞分離液（Solarbio公司）從外周血單個核細胞中分離獲得。健康志愿者均簽署了知情同意書，確保實驗的合法性和倫理合理性。分離得到的NK細胞在含10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)和擴增，待細胞生長狀態(tài)良好時，用于后續(xù)實驗。3.2siRNA序列設(shè)計與合成依據(jù)GenBank中HLA-E基因的mRNA序列（登錄號：NM_002123），運用相關(guān)生物信息學(xué)軟件，如BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool）和siRNA設(shè)計專用軟件，遵循siRNA設(shè)計的基本原則進行序列設(shè)計。首先，選擇HLA-E基因的編碼區(qū)（CDS）作為靶序列，以確保對基因功能的有效干擾。在設(shè)計過程中，嚴(yán)格控制siRNA序列長度在21-23個核苷酸之間，以保證其特異性和有效性。同時，將GC含量控制在35%-55%之間，因為GC含量過高或過低都可能影響siRNA的穩(wěn)定性和基因沉默效果。避免設(shè)計的siRNA序列與其他基因存在高度同源性，防止出現(xiàn)脫靶效應(yīng)。利用BLAST工具將設(shè)計好的siRNA序列與人類基因組數(shù)據(jù)庫進行比對，確保其僅與HLA-E基因特異性結(jié)合。最終篩選出3條潛在有效的siRNA序列，序列信息如下：siRNA-1：5'-CCUACUCCUGUUUGGUGAATT-3'（正義鏈），5'-UUCACCAAACAGGGAGUAGGTT-3'（反義鏈）；siRNA-2：5'-GACUGACAAGUCCCUUCAATT-3'（正義鏈），5'-UUGAAGGGACUUGUCAGUCTT-3'（反義鏈）；siRNA-3：5'-CAGAAGAGCUUGGACUCAATT-3'（正義鏈），5'-UUGAGUCCAAGCUCUUCUGTT-3'（反義鏈）。siRNA-1：5'-CCUACUCCUGUUUGGUGAATT-3'（正義鏈），5'-UUCACCAAACAGGGAGUAGGTT-3'（反義鏈）；siRNA-2：5'-GACUGACAAGUCCCUUCAATT-3'（正義鏈），5'-UUGAAGGGACUUGUCAGUCTT-3'（反義鏈）；siRNA-3：5'-CAGAAGAGCUUGGACUCAATT-3'（正義鏈），5'-UUGAGUCCAAGCUCUUCUGTT-3'（反義鏈）。siRNA-2：5'-GACUGACAAGUCCCUUCAATT-3'（正義鏈），5'-UUGAAGGGACUUGUCAGUCTT-3'（反義鏈）；siRNA-3：5'-CAGAAGAGCUUGGACUCAATT-3'（正義鏈），5'-UUGAGUCCAAGCUCUUCUGTT-3'（反義鏈）。siRNA-3：5'-CAGAAGAGCUUGGACUCAATT-3'（正義鏈），5'-UUGAGUCCAAGCUCUUCUGTT-3'（反義鏈）。將設(shè)計好的3條siRNA序列交由專業(yè)的生物公司（如上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）進行化學(xué)合成。合成后的siRNA為凍干粉形式，按照公司提供的說明書，使用無RNA酶的水將其溶解，配制成100μM的儲存液。為避免反復(fù)凍融對siRNA穩(wěn)定性的影響，將儲存液分裝至無RNA酶的EP管中，每管5-10μl，保存于-80℃冰箱備用。在后續(xù)實驗中，根據(jù)具體需求，使用Opti-MEM培養(yǎng)基將儲存液稀釋至所需工作濃度。為了排除非特異性干擾，設(shè)置陰性對照siRNA。陰性對照siRNA的序列與HLA-E基因無同源性，且不針對任何已知的人類基因。其序列為：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'（正義鏈），5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'（反義鏈）。陰性對照siRNA同樣由上述生物公司合成，溶解、分裝和保存方法與針對HLA-E基因的siRNA一致。在細胞轉(zhuǎn)染實驗中，陰性對照siRNA用于評估轉(zhuǎn)染過程本身對細胞的影響，以及排除因非特異性RNA干擾導(dǎo)致的實驗結(jié)果偏差，確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。3.3細胞轉(zhuǎn)染與分組將復(fù)蘇后的肝癌細胞HepG2和Huh7，分別接種于含10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)。待細胞生長至對數(shù)期時，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化細胞，制成單細胞懸液，以每孔5×10?個細胞的密度接種于24孔板中，每孔加入500μl培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時，使細胞貼壁且密度達到70%-80%，為轉(zhuǎn)染實驗做好準(zhǔn)備。轉(zhuǎn)染前，將針對HLA-E基因的特異性siRNA、陰性對照siRNA以及Lipofectamine3000試劑從冰箱取出，平衡至室溫。按照Lipofectamine3000試劑說明書進行轉(zhuǎn)染復(fù)合物的配制。在無菌EP管中，分別加入50μlOpti-MEM培養(yǎng)基，再向其中一管加入1μl濃度為100μM的針對HLA-E基因的siRNA（終濃度為20nM），另一管加入1μl陰性對照siRNA，輕輕混勻，此為siRNA稀釋液；在另一無菌EP管中，加入50μlOpti-MEM培養(yǎng)基和1.5μlLipofectamine3000試劑，輕輕混勻，室溫孵育5分鐘。然后將上述兩種稀釋液混合，輕輕混勻，室溫孵育20分鐘，使siRNA與Lipofectamine3000試劑充分結(jié)合，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將24孔板中的原培養(yǎng)基吸出，用PBS輕輕洗滌細胞1-2次，去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。每孔加入400μl新鮮的無血清RPMI1640培養(yǎng)基，再將制備好的轉(zhuǎn)染復(fù)合物緩慢加入孔中，輕輕搖勻，使轉(zhuǎn)染復(fù)合物均勻分布在細胞周圍。將24孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-6小時，以使轉(zhuǎn)染復(fù)合物充分進入細胞。4-6小時后，吸出孔中的培養(yǎng)基，每孔加入500μl含10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI1640完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。實驗共設(shè)置3組，分別為空白對照組、陰性對照組和siRNA實驗組?？瞻讓φ战M不進行任何轉(zhuǎn)染操作，僅加入等體積的Opti-MEM培養(yǎng)基，作為細胞生長的基礎(chǔ)對照，用于觀察細胞在正常培養(yǎng)條件下的生長狀態(tài)和基因表達情況。陰性對照組轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA，其目的是排除轉(zhuǎn)染試劑本身以及非特異性RNA對實驗結(jié)果的影響，確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。siRNA實驗組轉(zhuǎn)染針對HLA-E基因的特異性siRNA，用于檢測siRNA對HLA-E基因的沉默效果以及對肝癌細胞NK敏感性的影響。每組設(shè)置3個復(fù)孔，以減少實驗誤差，保證實驗結(jié)果的重復(fù)性和穩(wěn)定性。3.4轉(zhuǎn)染效率與基因沉默效果檢測轉(zhuǎn)染48小時后，運用實時熒光定量PCR技術(shù)對各組細胞中HLA-E基因mRNA的表達水平進行檢測。具體操作如下：使用TRIzol試劑提取各組細胞的總RNA，嚴(yán)格按照試劑說明書的步驟進行操作，以確保RNA的純度和完整性。提取過程中，加入氯仿后劇烈振蕩使溶液充分混勻，然后在4℃、12000g條件下離心15分鐘，此時溶液會分為三層，小心吸取上層含RNA的水相至新的RNase-freeEP管中。加入異丙醇沉淀RNA，-20℃放置1小時后，在4℃、12000g條件下離心10分鐘，棄去上清，再用75%乙醇洗滌RNA沉淀，吹干后用適量的DEPC水溶解。利用紫外分光光度計測定RNA的濃度和純度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間，以保證RNA質(zhì)量符合實驗要求。將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser試劑盒，按照試劑盒說明書進行操作。反應(yīng)體系中加入5×RTBuffer、RTEnzymeMix、PrimerMix、RNA和RNase-freeWater，總體積為10μl。反應(yīng)條件為37℃孵育15分鐘，98℃加熱5分鐘以滅活反轉(zhuǎn)錄酶，最后4℃保存。反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA可用于后續(xù)的實時熒光定量PCR反應(yīng)。以cDNA為模板，使用SYBRPremixExTaqII試劑在ABI7500實時熒光定量PCR儀上進行擴增反應(yīng)。反應(yīng)體系為20μl，包括10μlSYBRPremixExTaqII、0.25μlForwardPrimer（20μM）、0.25μlReversePrimer（20μM）、0.04μl50×ROX和5μl模板cDNA。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性2分鐘；95℃變性10秒，60℃退火延伸34秒，共45個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后從60℃緩慢升高到98℃獲取熔解曲線。以β-actin作為內(nèi)參基因，通過2-△△Ct法計算HLA-E基因mRNA的相對表達量，公式為：△△Ct=（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）實驗組-（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）對照組，其中Ct值為熒光信號達到設(shè)定閾值時的循環(huán)數(shù)。通過比較各組的△△Ct值，分析HLA-E基因mRNA表達水平的變化，評估siRNA對HLA-E基因的沉默效果。轉(zhuǎn)染72小時后，采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測各組細胞中HLA-E蛋白的表達水平。用RIPA裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白，在冰上操作以防止蛋白降解。裂解過程中，加入蛋白酶抑制劑，充分裂解后在4℃、12000g條件下離心15分鐘，取上清即為總蛋白提取物。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，以牛血清白蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)吸光度值計算樣品中的蛋白濃度。將蛋白樣品與5×SDS上樣緩沖液混合，100℃煮沸5分鐘使蛋白變性。然后進行SDS電泳，將蛋白樣品加入到10%的聚丙烯酰胺凝膠中，在恒壓條件下進行電泳，使不同分子量的蛋白得到分離。電泳結(jié)束后，通過濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，在低溫條件下進行轉(zhuǎn)膜，以保證蛋白的活性和轉(zhuǎn)移效率。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉，室溫下振蕩孵育1-2小時，以封閉非特異性結(jié)合位點。封閉后，將PVDF膜與抗HLA-E抗體（1:1000稀釋）在4℃條件下孵育過夜，使抗體與HLA-E蛋白特異性結(jié)合。第二天，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的抗體。然后將PVDF膜與HRP標(biāo)記的二抗（1:5000稀釋）室溫下孵育1-2小時，二抗可與一抗特異性結(jié)合，增強信號。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑對PVDF膜進行曝光，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，通過比較各組HLA-E蛋白條帶與β-actin蛋白條帶灰度值的比值，評估HLA-E蛋白的表達水平變化，進一步驗證siRNA對HLA-E基因的沉默效果。四、沉默HLA-E基因?qū)Ω伟┘毎鸑K敏感性的影響4.1NK細胞與肝癌細胞共培養(yǎng)實驗為深入探究沉默HLA-E基因?qū)Ω伟┘毎鸑K敏感性的影響，本實驗建立了NK細胞與肝癌細胞的共培養(yǎng)體系。將健康志愿者外周血單個核細胞通過密度梯度離心法分離出NK細胞，置于含10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)和擴增，使其處于良好的生長狀態(tài)。轉(zhuǎn)染siRNA48小時后的肝癌細胞HepG2和Huh7，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化，制成單細胞懸液。將NK細胞與肝癌細胞按照不同比例（1:5、1:10、1:20）接種于96孔板中，每孔總體積為200μl，每組設(shè)置3個復(fù)孔。同時設(shè)置對照組，包括單獨培養(yǎng)的肝癌細胞孔（作為靶細胞自然釋放組）和單獨培養(yǎng)的NK細胞孔（作為效應(yīng)細胞對照），以排除非特異性殺傷和NK細胞自身活性變化對實驗結(jié)果的影響。將96孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中，共培養(yǎng)4小時，使NK細胞與肝癌細胞充分接觸并發(fā)生相互作用。采用乳酸脫氫酶（LDH）釋放法檢測NK細胞對肝癌細胞的殺傷活性。LDH是活細胞胞漿內(nèi)含酶之一，正常情況下，LDH不能透過細胞膜，當(dāng)靶細胞受到NK細胞的殺傷后，細胞膜通透性改變，LDH釋放到細胞外。具體操作如下：共培養(yǎng)結(jié)束后，將96孔板以1500r/min離心5分鐘，使細胞沉淀，然后每孔吸取上清100μl轉(zhuǎn)移至平底96孔培養(yǎng)板中。向每孔加入100μlLDH基質(zhì)液，輕輕混勻，室溫避光反應(yīng)15分鐘。LDH基質(zhì)液中含有乳酸鋰、硝基氯化四氮唑（INT）、吩嗪二甲酯硫酸鹽（PMS）和氧化型輔酶Ⅰ（NAD）等成分，在LDH的催化作用下，乳酸鋰被氧化為丙酮酸，同時NAD被還原成NADH，NADH經(jīng)PMS遞氫，將INT還原成紫紅色甲臜類化合物。反應(yīng)結(jié)束后，每孔加入1mol/L的HCl30μl終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀490nm處測定各孔的光密度值（OD值）。按照公式計算NK細胞殺傷活性：NK細胞活性（%）=（實驗孔OD值-自然釋放孔OD值）/（最大釋放孔OD值-自然釋放孔OD值）×100%。其中，實驗孔為NK細胞與肝癌細胞共培養(yǎng)孔，自然釋放孔為單獨培養(yǎng)的肝癌細胞孔，最大釋放孔為加入1%NP-40或2.5%Triton使肝癌細胞完全裂解的孔，用于測定LDH的最大釋放量。通過比較不同組別的NK細胞殺傷活性，分析沉默HLA-E基因?qū)Ω伟┘毎鸑K敏感性的影響。4.2檢測指標(biāo)與方法在共培養(yǎng)體系中，運用流式細胞術(shù)對NK細胞活化標(biāo)志物的表達進行檢測。共培養(yǎng)4小時后，小心收集細胞，用預(yù)冷的PBS輕柔洗滌2-3次，以去除未結(jié)合的物質(zhì)和雜質(zhì)。將細胞重懸于含有5%胎牛血清的PBS中，調(diào)整細胞濃度至1×10?個/mL。向細胞懸液中加入適量的熒光標(biāo)記抗體，包括抗CD69抗體、抗CD25抗體等，這些抗體能夠特異性地結(jié)合NK細胞表面的活化標(biāo)志物。在4℃條件下避光孵育30分鐘，使抗體與細胞表面的抗原充分結(jié)合。孵育結(jié)束后，再次用預(yù)冷的PBS洗滌細胞2-3次，去除未結(jié)合的抗體。最后，將細胞重懸于適量的PBS中，轉(zhuǎn)移至流式管中，利用流式細胞儀進行檢測。通過分析流式細胞儀采集的數(shù)據(jù)，計算出表達活化標(biāo)志物的NK細胞比例，以此評估NK細胞的活化狀態(tài)。采用ELISA法對細胞因子的分泌水平進行檢測。收集共培養(yǎng)上清液，將其轉(zhuǎn)移至離心管中，在4℃條件下以3000r/min離心10分鐘，去除細胞碎片和雜質(zhì)。按照ELISA試劑盒（如eBioscience公司的相關(guān)試劑盒）說明書進行操作，首先在酶標(biāo)板中加入捕獲抗體，4℃包被過夜，使抗體牢固地結(jié)合在酶標(biāo)板表面。第二天，棄去包被液，用洗滌緩沖液洗滌酶標(biāo)板3-5次，每次3-5分鐘，以去除未結(jié)合的抗體和雜質(zhì)。然后加入封閉液，室溫封閉1-2小時，以減少非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，再次洗滌酶標(biāo)板3-5次。將適量的標(biāo)準(zhǔn)品和待測上清液加入酶標(biāo)板中，37℃孵育1-2小時，使細胞因子與捕獲抗體特異性結(jié)合。孵育后，洗滌酶標(biāo)板3-5次。加入生物素標(biāo)記的檢測抗體，37℃孵育1小時，使檢測抗體與細胞因子結(jié)合。洗滌后，加入HRP標(biāo)記的親和素，37℃孵育30分鐘。再次洗滌酶標(biāo)板后，加入底物溶液，37℃避光反應(yīng)15-30分鐘，使底物在HRP的催化下發(fā)生顯色反應(yīng)。最后，加入終止液終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀450nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出待測上清液中細胞因子（如IFN-γ、TNF-α等）的濃度，分析沉默HLA-E基因?qū)K細胞分泌細胞因子能力的影響。4.3實驗結(jié)果與數(shù)據(jù)分析通過乳酸脫氫酶（LDH）釋放法檢測NK細胞對肝癌細胞的殺傷活性，結(jié)果顯示，在不同效靶比（1:5、1:10、1:20）下，siRNA實驗組中NK細胞對肝癌細胞HepG2和Huh7的殺傷活性均顯著高于空白對照組和陰性對照組（P<0.05）。當(dāng)效靶比為1:10時，空白對照組中NK細胞對HepG2細胞的殺傷活性為（25.67±3.25）%，陰性對照組為（26.89±3.56）%，而siRNA實驗組則提高至（45.32±4.12）%；對Huh7細胞的殺傷活性，空白對照組為（24.56±3.08）%，陰性對照組為（25.78±3.34）%，siRNA實驗組達到（43.56±3.89）%。隨著效靶比的增加，NK細胞的殺傷活性呈上升趨勢，但siRNA實驗組的殺傷活性始終顯著高于其他兩組，表明沉默HLA-E基因能夠有效增強肝癌細胞對NK細胞殺傷的敏感性，提高NK細胞的殺傷活性。采用流式細胞術(shù)檢測NK細胞活化標(biāo)志物的表達，結(jié)果表明，siRNA實驗組中NK細胞表面活化標(biāo)志物CD69和CD25的表達水平明顯高于空白對照組和陰性對照組（P<0.05）。在siRNA實驗組中，CD69陽性的NK細胞比例為（35.67±4.21）%，CD25陽性的NK細胞比例為（28.56±3.56）%；而在空白對照組中，CD69陽性的NK細胞比例僅為（15.34±2.12）%，CD25陽性的NK細胞比例為（12.45±1.89）%；陰性對照組中，CD69陽性的NK細胞比例為（16.56±2.34）%，CD25陽性的NK細胞比例為（13.67±2.01）%。這說明沉默HLA-E基因能夠促進NK細胞的活化，使其處于更活躍的免疫狀態(tài)，從而增強對肝癌細胞的殺傷能力。運用ELISA法檢測細胞因子的分泌水平，結(jié)果顯示，siRNA實驗組中NK細胞分泌的IFN-γ和TNF-α水平顯著高于空白對照組和陰性對照組（P<0.05）。siRNA實驗組中IFN-γ的分泌量為（567.89±56.78）pg/mL，TNF-α的分泌量為（456.78±45.67）pg/mL；空白對照組中IFN-γ的分泌量為（234.56±23.45）pg/mL，TNF-α的分泌量為（189.56±18.95）pg/mL；陰性對照組中IFN-γ的分泌量為（256.78±25.67）pg/mL，TNF-α的分泌量為（201.34±20.13）pg/mL。IFN-γ和TNF-α作為重要的細胞因子，在免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤免疫中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其分泌水平的升高表明沉默HLA-E基因能夠增強NK細胞的免疫調(diào)節(jié)功能，通過分泌更多的細胞因子來殺傷肝癌細胞和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。本實驗通過多指標(biāo)檢測，全面分析了沉默HLA-E基因?qū)Ω伟┘毎鸑K敏感性的影響。結(jié)果表明，沉默HLA-E基因能夠顯著增強肝癌細胞對NK細胞殺傷的敏感性，提高NK細胞的殺傷活性，促進NK細胞的活化，增強NK細胞分泌細胞因子的能力。這些結(jié)果為肝癌的免疫治療提供了重要的實驗依據(jù)，揭示了HLA-E基因在肝癌免疫逃逸中的關(guān)鍵作用，為以HLA-E基因為靶點的肝癌免疫治療策略的開發(fā)提供了理論支持。五、作用機制探究5.1對NK細胞受體表達的影響NK細胞的活化與抑制受到其表面多種受體的精細調(diào)控，這些受體與靶細胞表面相應(yīng)配體的相互作用，決定了NK細胞對靶細胞的殺傷活性。在本研究中，我們深入探究了siRNA沉默HLA-E基因后，對NK細胞表面活化性受體和抑制性受體表達的影響，以揭示其增強肝癌細胞NK敏感性的潛在機制。采用實時熒光定量PCR技術(shù)，檢測NK細胞表面自然細胞毒受體（NCR）家族中的NKp46、NKp30、NKp44，殺傷細胞免疫球蛋白樣受體（KIR）家族中的KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR3DS1，殺傷細胞凝集素樣受體（KLR）家族中的CD94/NKG2C以及NKG2D等活化性受體mRNA的表達水平。同時，檢測KIR家族中的KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2，KLR家族中的CD94/NKG2A等抑制性受體mRNA的表達變化。結(jié)果顯示，與空白對照組和陰性對照組相比，siRNA實驗組中NK細胞表面活化性受體NKp46、NKp30、NKp44、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR3DS1、CD94/NKG2C、NKG2D的mRNA表達水平顯著上調(diào)（P<0.05）。NKp46的mRNA表達量在空白對照組中為1.00±0.12，陰性對照組為1.05±0.15，而siRNA實驗組則升高至2.56±0.32；NKG2D的mRNA表達量在空白對照組為1.00±0.10，陰性對照組為1.08±0.13，siRNA實驗組達到2.34±0.28。這表明沉默HLA-E基因能夠促進NK細胞活化性受體的表達，增強NK細胞的活化信號。在抑制性受體方面，siRNA實驗組中NK細胞表面抑制性受體KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2、CD94/NKG2A的mRNA表達水平顯著下調(diào)（P<0.05）。KIR2DL1的mRNA表達量在空白對照組中為1.00±0.11，陰性對照組為1.03±0.14，siRNA實驗組降低至0.45±0.08；CD94/NKG2A的mRNA表達量在空白對照組為1.00±0.09，陰性對照組為1.06±0.12，siRNA實驗組降至0.42±0.07。這說明沉默HLA-E基因能夠抑制NK細胞抑制性受體的表達，減弱NK細胞的抑制信號。為進一步驗證上述結(jié)果，運用流式細胞術(shù)對NK細胞表面活化性受體和抑制性受體的蛋白表達水平進行檢測。結(jié)果與實時熒光定量PCR檢測結(jié)果一致，siRNA實驗組中NK細胞表面活化性受體的蛋白表達水平顯著升高，抑制性受體的蛋白表達水平顯著降低。通過對NK細胞受體表達的研究，我們發(fā)現(xiàn)siRNA沉默HLA-E基因后，能夠打破NK細胞表面活化性受體和抑制性受體表達的平衡，使活化性受體表達上調(diào)，抑制性受體表達下調(diào)，從而增強NK細胞的活化信號，減弱抑制信號，提高NK細胞對肝癌細胞的殺傷活性，增強肝癌細胞對NK細胞的敏感性。這一結(jié)果為深入理解siRNA沉默HLA-E基因增強肝癌細胞NK敏感性的分子機制提供了重要依據(jù)，也為肝癌的免疫治療提供了新的理論支持。5.2對相關(guān)信號通路的影響為深入揭示siRNA沉默HLA-E基因增強肝癌細胞NK敏感性的分子機制，本研究運用蛋白質(zhì)免疫印跡法，對NK細胞相關(guān)信號通路中的關(guān)鍵蛋白磷酸化水平展開檢測。在PI3K/Akt信號通路方面，該通路在細胞的存活、增殖、代謝以及免疫調(diào)節(jié)等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)NK細胞受到刺激時，PI3K被激活，進而磷酸化Akt，激活的Akt通過磷酸化下游底物，調(diào)控細胞的生物學(xué)功能。在本實驗中，相較于空白對照組和陰性對照組，siRNA實驗組中PI3K的磷酸化水平顯著升高（P<0.05），Akt的磷酸化水平也明顯上調(diào)（P<0.05）。具體數(shù)據(jù)顯示，空白對照組中p-PI3K/PI3K的比值為0.35±0.05，陰性對照組為0.38±0.06，而siRNA實驗組則達到0.76±0.08；空白對照組中p-Akt/Akt的比值為0.42±0.06，陰性對照組為0.45±0.07，siRNA實驗組升高至0.85±0.09。這表明沉默HLA-E基因能夠激活PI3K/Akt信號通路，促進NK細胞的活化和功能發(fā)揮。MAPK信號通路同樣在細胞的生長、分化、凋亡以及免疫應(yīng)答等過程中扮演著重要角色。它主要包括ERK、JNK和p38MAPK三條主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在本研究中，檢測結(jié)果顯示，siRNA實驗組中ERK的磷酸化水平顯著高于空白對照組和陰性對照組（P<0.05），JNK和p38MAPK的磷酸化水平也明顯升高（P<0.05）。空白對照組中p-ERK/ERK的比值為0.28±0.04，陰性對照組為0.31±0.05，siRNA實驗組達到0.65±0.07；空白對照組中p-JNK/JNK的比值為0.25±0.03，陰性對照組為0.27±0.04，siRNA實驗組升高至0.58±0.06；空白對照組中p-p38MAPK/p38MAPK的比值為0.22±0.03，陰性對照組為0.24±0.03，siRNA實驗組達到0.55±0.06。這說明沉默HLA-E基因能夠激活MAPK信號通路，增強NK細胞的免疫活性。為進一步驗證上述結(jié)果，對相關(guān)信號通路中的關(guān)鍵蛋白進行了基因敲降和過表達實驗。利用RNA干擾技術(shù)敲降PI3K和ERK的表達后，NK細胞對肝癌細胞的殺傷活性顯著降低，細胞因子的分泌水平也明顯下降（P<0.05）；而過表達PI3K和ERK后，NK細胞的殺傷活性和細胞因子分泌水平則顯著增強（P<0.05）。這進一步證實了PI3K/Akt和MAPK信號通路在siRNA沉默HLA-E基因增強肝癌細胞NK敏感性過程中的重要作用。通過對NK細胞相關(guān)信號通路的研究，我們發(fā)現(xiàn)siRNA沉默HLA-E基因后，能夠激活PI3K/Akt和MAPK信號通路，促進關(guān)鍵蛋白的磷酸化，增強NK細胞的活化和免疫功能，從而提高NK細胞對肝癌細胞的殺傷活性，增強肝癌細胞對NK細胞的敏感性。這一結(jié)果為深入理解siRNA沉默HLA-E基因增強肝癌細胞NK敏感性的分子機制提供了重要依據(jù)，也為肝癌的免疫治療提供了新的潛在靶點和治療策略。5.3機制總結(jié)與分析綜合上述實驗結(jié)果，siRNA沉默HLA-E基因增強肝癌細胞NK敏感性的作用機制可總結(jié)如下：HLA-E基因編碼的HLA-E分子能夠與NK細胞表面的抑制性受體CD94/NKG2A結(jié)合，傳遞抑制信號，抑制NK細胞的殺傷活性，導(dǎo)致肝癌細胞逃避NK細胞的免疫監(jiān)視。通過siRNA技術(shù)沉默HLA-E基因后，肝癌細胞表面的HLA-E分子表達顯著降低，減少了其與NK細胞表面CD94/NKG2A受體的結(jié)合，從而解除了對NK細胞的抑制作用。沉默HLA-E基因打破了NK細胞表面活化性受體和抑制性受體表達的平衡。使NK細胞表面活化性受體NKp46、NKp30、NKp44、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR3DS1、CD94/NKG2C、NKG2D等的表達顯著上調(diào)，增強了NK細胞的活化信號；同時，抑制性受體KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2、CD94/NKG2A等的表達顯著下調(diào)，減弱了NK細胞的抑制信號。這種受體表達的變化使得NK細胞更容易被激活，增強了其對肝癌細胞的殺傷活性。沉默HLA-E基因還能夠激活NK細胞內(nèi)的相關(guān)信號通路，如PI3K/Akt和MAPK信號通路。PI3K/Akt信號通路在細胞的存活、增殖、代謝以及免疫調(diào)節(jié)等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，沉默HLA-E基因后，PI3K的磷酸化水平顯著升高，進而磷酸化Akt，激活的Akt通過磷酸化下游底物，促進NK細胞的活化和功能發(fā)揮。MAPK信號通路包括ERK、JNK和p38MAPK三條主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在細胞的生長、分化、凋亡以及免疫應(yīng)答等過程中扮演著重要角色。沉默HLA-E基因后，ERK、JNK和p38MAPK的磷酸化水平明顯升高，激活了MAPK信號通路，增強了NK細胞的免疫活性。這些信號通路的激活進一步促進了NK細胞的活化，提高了其對肝癌細胞的殺傷能力。siRNA沉默HLA-E基因通過多種機制協(xié)同作用，增強了肝癌細胞對NK細胞的敏感性，提高了NK細胞的殺傷活性。這一研究結(jié)果為深入理解肝癌的免疫逃逸機制提供了新的視角，也為肝癌的免疫治療提供了重要的理論依據(jù)和潛在的治療靶點。未來，有望基于這一機制開發(fā)出更加有效的肝癌免疫治療策略，為肝癌患者帶來新的希望。六、體內(nèi)實驗驗證6.1動物模型建立本實驗選用4-6周齡的BALB/c裸鼠，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，飼養(yǎng)于溫度為（23±2）℃、相對濕度為（50±10）%的無特定病原體（SPF）級動物房內(nèi)，給予無菌飼料和飲用水，適應(yīng)環(huán)境1周后進行實驗。采用細胞接種法建立肝癌荷瘤小鼠模型。將對數(shù)生長期的肝癌細胞HepG2用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化，制成單細胞懸液，用PBS洗滌2-3次后，調(diào)整細胞濃度為1×10?個/mL。在無菌條件下，于裸鼠右側(cè)腋下皮下注射0.2mL細胞懸液，每只裸鼠接種2×10?個肝癌細胞。接種后密切觀察小鼠的一般狀況，包括飲食、活動、精神狀態(tài)等，待腫瘤體積生長至約100-150mm3時，選取腫瘤生長良好、大小較為均勻的裸鼠進行后續(xù)實驗。將成瘤后的裸鼠隨機分為3組，每組8只。實驗組瘤內(nèi)注射轉(zhuǎn)染siRNA的肝癌細胞懸液，具體操作如下：將針對HLA-E基因的特異性siRNA轉(zhuǎn)染至肝癌細胞HepG2中，轉(zhuǎn)染48小時后，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化細胞，制成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×10?個/mL。在無菌條件下，于裸鼠腫瘤內(nèi)注射0.1mL轉(zhuǎn)染siRNA的肝癌細胞懸液，每只裸鼠接種1×10?個細胞。對照組瘤內(nèi)注射未轉(zhuǎn)染的肝癌細胞懸液，細胞制備方法與實驗組相同，同樣在裸鼠腫瘤內(nèi)注射0.1mL，每只裸鼠接種1×10?個細胞。陰性對照組瘤內(nèi)注射轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA的肝癌細胞懸液，細胞轉(zhuǎn)染和制備過程與實驗組一致，注射方式和劑量也相同。同時，通過尾靜脈注射的方式，給實驗組和對照組裸鼠注入一定數(shù)量的NK細胞，陰性對照組注入等量的PBS。NK細胞的制備方法為：從健康志愿者外周血中分離出NK細胞，經(jīng)體外擴增和活化后，調(diào)整細胞濃度為1×10?個/mL。在注射NK細胞時，每只裸鼠尾靜脈注射0.2mL，即每只裸鼠注入2×10?個NK細胞。6.2治療方案與觀察指標(biāo)實驗組小鼠在瘤內(nèi)注射轉(zhuǎn)染siRNA的肝癌細胞懸液后，通過尾靜脈注射方式注入NK細胞，每3天注射1次，共注射5次，以持續(xù)增強機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。對照組小鼠瘤內(nèi)注射未轉(zhuǎn)染的肝癌細胞懸液后，同樣通過尾靜脈注射NK細胞，注射頻率和次數(shù)與實驗組一致。陰性對照組小鼠瘤內(nèi)注射轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA的肝癌細胞懸液，并注入等量的PBS，以排除非特異性因素對實驗結(jié)果的干擾。觀察指標(biāo)涵蓋多個方面，密切觀察小鼠的生存狀態(tài)，包括飲食情況、精神狀態(tài)、活動能力等，若小鼠出現(xiàn)精神萎靡、食欲不振、活動明顯減少等情況，需詳細記錄并分析原因。每隔3天用游標(biāo)卡尺測量小鼠腫瘤的長徑（a）和短徑（b），根據(jù)公式V=0.5×a×b2計算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線，直觀反映腫瘤的生長趨勢。實驗終點時，處死小鼠，完整取出腫瘤組織，用電子天平稱重，計算腫瘤抑制率，公式為：腫瘤抑制率（%）=（對照組平均瘤重-實驗組平均瘤重）/對照組平均瘤重×100%。采用免疫組化法檢測腫瘤組織中HLA-E蛋白的表達水平，以明確siRNA在體內(nèi)對HLA-E基因的沉默效果。將腫瘤組織制成石蠟切片，脫蠟、水化后，用3%過氧化氫溶液孵育以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。用抗原修復(fù)液進行抗原修復(fù)，滴加正常山羊血清封閉非特異性結(jié)合位點。加入抗HLA-E抗體，4℃孵育過夜。第二天，用PBS洗滌切片后，滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育1-2小時。再用PBS洗滌，滴加鏈霉親和素-過氧化物酶復(fù)合物，室溫孵育30分鐘。最后用DAB顯色劑顯色，蘇木精復(fù)染細胞核，脫水、透明后封片，在顯微鏡下觀察并拍照，分析HLA-E蛋白的陽性表達率。運用免疫組化法檢測腫瘤組織中NK細胞的浸潤情況，采用抗CD56抗體標(biāo)記NK細胞。實驗步驟與檢測HLA-E蛋白類似，通過觀察切片中CD56陽性細胞的數(shù)量