基于siRNA技術(shù)調(diào)控Bcl-2表達(dá)對(duì)人食管癌EC9706細(xì)胞放射敏感性的深度解析與機(jī)制探究一、引言1.1研究背景食管癌作為全球范圍內(nèi)高發(fā)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類(lèi)的生命健康。據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，食管癌在全球癌癥發(fā)病率中位居前十，死亡率也居高不下。在我國(guó)，食管癌同樣是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率位居惡性腫瘤第四位，病死率更是高達(dá)90%。由于食管癌早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，錯(cuò)失了最佳手術(shù)時(shí)機(jī)。放射治療是食管癌綜合治療的重要組成部分，對(duì)于無(wú)法手術(shù)切除或拒絕手術(shù)的患者，放射治療是主要的治療手段之一。然而，臨床上約70%的食管癌患者對(duì)放射治療不敏感，這使得放射治療的效果受到很大限制，5年生存率仍小于20%。腫瘤細(xì)胞的放射敏感性與多種因素密切相關(guān)，包括DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖、凋亡以及細(xì)胞周期調(diào)控等。其中，凋亡在腫瘤放射治療中起著關(guān)鍵作用，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是放射治療殺死腫瘤細(xì)胞的重要機(jī)制之一。Bcl-2（B-cellLeukemia2）蛋白家族是線(xiàn)粒體凋亡途徑中重要的凋亡調(diào)節(jié)者，包括抑凋亡成員（如Bcl-2、Bcl-W、Bcl-XL、mcl-1等）和促凋亡成員（如Bcl-XS、Bax、Bak、Bad、Hrk和Bim等）。這兩類(lèi)物質(zhì)相互結(jié)合、彼此抑制，凋亡的發(fā)生與否往往由其數(shù)量的相對(duì)多少來(lái)控制。在Bcl-2家族中，Bcl-2蛋白是最早被發(fā)現(xiàn)且研究較為透徹的家族成員。Bcl-2蛋白存在于細(xì)胞內(nèi)的線(xiàn)粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和核膜上，具有離子通道和停靠蛋白的雙重功能，在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的通路中起著至關(guān)重要的作用。在線(xiàn)粒體凋亡途徑中，Bcl-2蛋白一方面可直接改變線(xiàn)粒體膜的通透性，另一方面又可感受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放的Ca2?，通過(guò)調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2?參與的膜通透性轉(zhuǎn)換（PT）來(lái)穩(wěn)定線(xiàn)粒體膜，從而阻止細(xì)胞色素C從線(xiàn)粒體釋放，再通過(guò)與Apaf-1、procaspase-9的相互作用，最終抑制Caspase-9、Caspase-3觸發(fā)的細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程。研究表明，腫瘤發(fā)生和產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象的重要原因之一是抑制細(xì)胞凋亡的Bcl-2基因及其相關(guān)蛋白的高表達(dá)。在食管癌中，Bcl-2的高表達(dá)與放療抵抗密切相關(guān)，其表達(dá)程度可作為食管癌預(yù)后和放療敏感性預(yù)測(cè)指標(biāo)。RNA干擾（RNAi）是一種由雙鏈RNA介導(dǎo)引起的特異性基因沉默現(xiàn)象，引發(fā)RNAi的雙鏈RNA被稱(chēng)為siRNA。在細(xì)胞內(nèi)，siRNA通過(guò)堿基互補(bǔ)識(shí)別并結(jié)合靶mRNA，在核酸酶的作用下將其降解，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因表達(dá)的抑制。利用RNA干擾技術(shù)，通過(guò)抑制Bcl-2基因的表達(dá)來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，為提高食管癌放射敏感性提供了新的思路和方法。目前，已有研究表明Bcl-2基因特異性siRNA真核表達(dá)載體可抑制Bcl-2蛋白在食管癌細(xì)胞中的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)X射線(xiàn)照射對(duì)食管癌細(xì)胞克隆形成的抑制能力以及對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用。然而，關(guān)于siRNA沉默Bcl-2表達(dá)增強(qiáng)人食管癌EC9706細(xì)胞放射敏感性的具體機(jī)制及相關(guān)研究仍有待進(jìn)一步深入探討。因此，本研究旨在通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，深入研究siRNA沉默Bcl-2表達(dá)對(duì)人食管癌EC9706細(xì)胞放射敏感性的影響及其作用機(jī)制，為食管癌的放射治療提供新的理論依據(jù)和治療策略。1.2研究目的本研究旨在通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)手段，深入探究siRNA沉默Bcl-2表達(dá)對(duì)人食管癌EC9706細(xì)胞放射敏感性的影響，并闡明其內(nèi)在作用機(jī)制。具體而言，本研究將利用RNA干擾技術(shù)，將針對(duì)Bcl-2基因的特異性siRNA轉(zhuǎn)染至人食管癌EC9706細(xì)胞中，以實(shí)現(xiàn)對(duì)Bcl-2基因表達(dá)的有效沉默。通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)水平，明確siRNA對(duì)Bcl-2基因的沉默效果。同時(shí)，運(yùn)用克隆形成實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞凋亡檢測(cè)等方法，分析siRNA沉默Bcl-2表達(dá)后，EC9706細(xì)胞在接受X射線(xiàn)照射時(shí)的放射敏感性變化，包括細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)、凋亡率等指標(biāo)的改變。此外，本研究還將進(jìn)一步探討siRNA沉默Bcl-2表達(dá)增強(qiáng)人食管癌EC9706細(xì)胞放射敏感性的潛在作用機(jī)制，從細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)、線(xiàn)粒體凋亡通路等多個(gè)角度進(jìn)行深入研究，以期為食管癌的放射治療提供新的理論依據(jù)和潛在的治療靶點(diǎn)，為提高食管癌患者的放療療效、改善患者預(yù)后提供科學(xué)支持。1.3研究意義本研究聚焦于siRNA沉默Bcl-2表達(dá)增強(qiáng)人食管癌EC9706細(xì)胞放射敏感性，具有多方面的重要意義。在食管癌治療新思路的探索上，本研究為食管癌的治療提供了新的方向。放射治療是食管癌綜合治療的重要手段，但腫瘤細(xì)胞的放射抵抗嚴(yán)重制約了放療效果。本研究通過(guò)RNA干擾技術(shù)特異性沉默Bcl-2基因表達(dá)，有望打破腫瘤細(xì)胞的放射抵抗?fàn)顟B(tài)，為食管癌的放射治療提供新的策略。這不僅為食管癌患者提供了更多的治療選擇，還可能改善患者的預(yù)后，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。例如，若能通過(guò)沉默Bcl-2增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放療的敏感性，那么在相同的放療劑量下，腫瘤細(xì)胞可能會(huì)受到更有效的殺傷，從而減少腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，為患者帶來(lái)更好的治療效果。從深入理解腫瘤放射敏感性分子機(jī)制的角度來(lái)看，本研究有助于揭示食管癌放射敏感性的分子機(jī)制。腫瘤放射敏感性是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，涉及多個(gè)基因和信號(hào)通路的調(diào)控。Bcl-2作為凋亡調(diào)節(jié)的關(guān)鍵基因，在腫瘤放射敏感性中發(fā)揮著重要作用。通過(guò)研究siRNA沉默Bcl-2表達(dá)對(duì)食管癌EC9706細(xì)胞放射敏感性的影響，我們可以更深入地了解Bcl-2基因在腫瘤放射敏感性中的作用機(jī)制，以及其與其他相關(guān)基因和信號(hào)通路的相互關(guān)系。這將為進(jìn)一步研究腫瘤放射敏感性的分子機(jī)制提供重要的理論基礎(chǔ)，有助于我們從分子層面更好地理解腫瘤對(duì)放療的反應(yīng)，為開(kāi)發(fā)更有效的放療增敏策略提供依據(jù)。在臨床應(yīng)用的潛在價(jià)值方面，本研究成果具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。若本研究證實(shí)siRNA沉默Bcl-2表達(dá)能夠有效增強(qiáng)食管癌EC9706細(xì)胞的放射敏感性，那么這一技術(shù)有望轉(zhuǎn)化為臨床治療方法?？梢酝ㄟ^(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)Bcl-2基因的特異性siRNA藥物，將其應(yīng)用于食管癌患者的放射治療中，以提高放療的療效。同時(shí)，對(duì)Bcl-2基因表達(dá)的檢測(cè)還可以作為預(yù)測(cè)食管癌患者放療敏感性的指標(biāo)，幫助醫(yī)生篩選出對(duì)放療敏感的患者，制定個(gè)性化的治療方案，避免不必要的放療和治療副作用，提高醫(yī)療資源的利用效率。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1食管癌概述2.1.1流行病學(xué)特征食管癌是全球范圍內(nèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)出明顯的地域差異。根據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，當(dāng)年食管癌新發(fā)病例約60.4萬(wàn)例，占全部惡性腫瘤的3.1%，位居第8位；死亡病例約54.4萬(wàn)例，占全部惡性腫瘤的5.5%，位居第6位。全球范圍內(nèi)，食管癌發(fā)病率為6.3例/10萬(wàn)人/年，死亡率為5.6例/10萬(wàn)人/年。東亞、東非、南非地區(qū)是食管癌的高發(fā)區(qū)域，其中東亞地區(qū)發(fā)病率和死亡率均排名首位，發(fā)病率為12.3例/10萬(wàn)人/年，死亡率為10.7例/10萬(wàn)人/年，幾乎是世界平均水平的2倍。這與東亞地區(qū)（尤其是中國(guó)、日本）的飲食、生活習(xí)慣密切相關(guān)，如長(zhǎng)期飲酒，進(jìn)食過(guò)燙、過(guò)硬，食用腌制、熏烤食物等。在中國(guó)，食管癌同樣是嚴(yán)重威脅居民健康的惡性腫瘤。據(jù)國(guó)家癌癥中心2019年最新公布的癌癥報(bào)告顯示，2015年中國(guó)新發(fā)食管癌病例24.6萬(wàn)，死亡病例18.8萬(wàn)，發(fā)病率和死亡率分別位列全部惡性腫瘤的第六和第四位，約占全球的一半。食管癌在我國(guó)的發(fā)病具有獨(dú)特的地理分布特點(diǎn)，呈現(xiàn)出明顯的地域聚集性。太行山南端的河南、河北、山西三省交界地區(qū)是我國(guó)食管癌的高發(fā)中心，發(fā)病率最高可達(dá)十萬(wàn)分之三十二。此外，山東、江蘇、福建、安徽、湖北、陜西、新疆等地區(qū)也有相對(duì)集中的高發(fā)區(qū)。農(nóng)村地區(qū)的發(fā)病率和死亡率普遍高于城市，男性發(fā)病率高于女性，其比例約為1.3-3:1，且發(fā)病年齡多在50歲以后，高發(fā)地區(qū)人群發(fā)病和死亡率比低發(fā)地區(qū)提前十年。近年來(lái)，隨著人們生活水平的提高及健康意識(shí)的增強(qiáng)，我國(guó)食管癌的發(fā)病率有所下降，但死亡率依然居高不下，2022年我國(guó)食管癌新發(fā)22.40萬(wàn)例，死亡18.75萬(wàn)例，發(fā)病率和死亡率分別為15.87/10萬(wàn)和13.28/10萬(wàn)。2.1.2臨床治療現(xiàn)狀目前，食管癌的臨床治療主要包括手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療以及綜合治療等手段。手術(shù)治療是食管癌的首選治療方法，尤其是對(duì)于早期食管癌患者，通過(guò)手術(shù)切除腫瘤及周?chē)M織，有可能實(shí)現(xiàn)根治。對(duì)于可切除的食管癌，手術(shù)切除范圍通常根據(jù)腫瘤的位置、大小和分期來(lái)確定，常見(jiàn)的手術(shù)方式包括開(kāi)胸手術(shù)、胸腔鏡手術(shù)、腹腔鏡手術(shù)等。然而，由于食管癌早期癥狀隱匿，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，腫瘤侵犯范圍較廣，手術(shù)切除難度大，且術(shù)后容易出現(xiàn)并發(fā)癥，如吻合口瘺、肺部感染等，影響患者的預(yù)后。對(duì)于中晚期食管癌患者，單純手術(shù)治療的效果往往不理想，5年生存率較低。放射治療是食管癌綜合治療的重要組成部分，適用于不能手術(shù)切除、拒絕手術(shù)或術(shù)后輔助治療的患者。放射治療可以通過(guò)高能射線(xiàn)殺死癌細(xì)胞，控制腫瘤的生長(zhǎng)和擴(kuò)散。對(duì)于局部晚期食管癌患者，同步放化療已成為標(biāo)準(zhǔn)治療方案之一，能夠提高患者的生存率和局部控制率。然而，放射治療也存在一定的局限性，如腫瘤細(xì)胞對(duì)放射線(xiàn)的抵抗性，導(dǎo)致放療效果不佳。臨床上約70%的食管癌患者對(duì)放射治療不敏感，這使得放療的療效受到很大限制，5年生存率仍小于20%。此外，放射治療還可能引起一系列副作用，如放射性食管炎、放射性肺炎、骨髓抑制等，影響患者的生活質(zhì)量和治療依從性。化學(xué)治療主要通過(guò)使用化學(xué)藥物來(lái)殺死癌細(xì)胞或抑制其生長(zhǎng)。化療通常用于有轉(zhuǎn)移的食管癌患者，或者作為手術(shù)和放療的輔助治療手段。常用的化療藥物包括順鉑、氟尿嘧啶、紫杉醇等，這些藥物通過(guò)不同的作用機(jī)制干擾癌細(xì)胞的DNA合成、細(xì)胞分裂等過(guò)程，從而達(dá)到治療目的。然而，化療也存在諸多副作用，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等，嚴(yán)重影響患者的身體狀況和生活質(zhì)量。而且，腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性也是化療面臨的一大難題，隨著化療療程的增加，腫瘤細(xì)胞可能會(huì)逐漸產(chǎn)生耐藥，導(dǎo)致化療效果下降。綜合治療是將手術(shù)、放療、化療等多種治療手段有機(jī)結(jié)合，根據(jù)患者的具體情況制定個(gè)性化的治療方案，以提高治療效果。例如，術(shù)前新輔助放化療可以縮小腫瘤體積，提高手術(shù)切除率，降低術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)；術(shù)后輔助放化療可以進(jìn)一步清除殘留的癌細(xì)胞，減少?gòu)?fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的可能性。近年來(lái)，隨著免疫治療、靶向治療等新興治療技術(shù)的發(fā)展，食管癌的治療取得了一定的進(jìn)展。免疫檢查點(diǎn)抑制劑如帕博利珠單抗等在食管癌的治療中顯示出了一定的療效，為食管癌患者帶來(lái)了新的希望。然而，這些新興治療方法也存在一定的局限性，如免疫治療的有效率有限，部分患者可能出現(xiàn)免疫相關(guān)不良反應(yīng)等?？傮w而言，食管癌的臨床治療仍面臨諸多挑戰(zhàn)，提高腫瘤細(xì)胞的放射敏感性，增強(qiáng)放療效果，是改善食管癌患者預(yù)后的關(guān)鍵之一。2.2Bcl-2基因與蛋白2.2.1Bcl-2基因結(jié)構(gòu)與定位Bcl-2基因位于人類(lèi)染色體18q21.3，其基因結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，包含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子。在這3個(gè)外顯子中，第1外顯子不編碼蛋白質(zhì)，僅起到調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用；第2和第3外顯子則共同編碼由239個(gè)氨基酸組成的Bcl-2蛋白。Bcl-2基因的啟動(dòng)子區(qū)域富含GC堿基對(duì)，缺乏典型的TATA盒，這使得其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)較為分散，增加了基因表達(dá)調(diào)控的復(fù)雜性。研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2基因啟動(dòng)子區(qū)域存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，如SP1、AP-1等，這些轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)與啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合，參與Bcl-2基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，進(jìn)而影響B(tài)cl-2蛋白的表達(dá)水平。例如，SP1轉(zhuǎn)錄因子可以與Bcl-2基因啟動(dòng)子區(qū)域的GC盒結(jié)合，促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄，上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)；而AP-1轉(zhuǎn)錄因子則在某些情況下抑制Bcl-2基因的轉(zhuǎn)錄，降低Bcl-2蛋白的表達(dá)。此外，Bcl-2基因的甲基化狀態(tài)也對(duì)其表達(dá)起著重要的調(diào)控作用。當(dāng)Bcl-2基因啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生高甲基化時(shí)，會(huì)抑制基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致Bcl-2蛋白表達(dá)降低；相反，低甲基化狀態(tài)則有利于基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。在一些腫瘤細(xì)胞中，就觀察到Bcl-2基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平的改變與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及對(duì)治療的反應(yīng)密切相關(guān)。2.2.2Bcl-2蛋白功能與凋亡調(diào)控機(jī)制Bcl-2蛋白是一種重要的抗凋亡蛋白，在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。其主要定位于線(xiàn)粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和核膜等細(xì)胞器膜上，具有離子通道和?？康鞍椎碾p重功能。在線(xiàn)粒體凋亡途徑中，Bcl-2蛋白通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮抗凋亡作用。首先，Bcl-2蛋白可以直接與線(xiàn)粒體膜上的電壓依賴(lài)性陰離子通道（VDAC）相互作用，調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體膜的通透性，阻止細(xì)胞色素C從線(xiàn)粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C是線(xiàn)粒體凋亡途徑中的關(guān)鍵分子，一旦釋放到細(xì)胞質(zhì)中，它會(huì)與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡小體，進(jìn)而招募并激活半胱天冬酶-9（Caspase-9），引發(fā)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Bcl-2蛋白通過(guò)穩(wěn)定線(xiàn)粒體膜，抑制細(xì)胞色素C的釋放，從而阻斷了這一凋亡信號(hào)通路。其次，Bcl-2蛋白可以與促凋亡蛋白Bax、Bak等相互作用，抑制它們的促凋亡活性。Bax和Bak是Bcl-2蛋白家族中的促凋亡成員，在凋亡信號(hào)的刺激下，它們會(huì)發(fā)生構(gòu)象改變，從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線(xiàn)粒體膜上，并在線(xiàn)粒體膜上形成孔道，導(dǎo)致線(xiàn)粒體膜通透性增加，細(xì)胞色素C釋放。而B(niǎo)cl-2蛋白可以與Bax、Bak結(jié)合，阻止它們的構(gòu)象改變和線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)位，從而抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。此外，Bcl-2蛋白還可以通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2?的釋放來(lái)影響細(xì)胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)重要的Ca2?儲(chǔ)存庫(kù)，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放的Ca2?可以激活下游的凋亡信號(hào)通路。Bcl-2蛋白可以與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的Ca2?通道相互作用，調(diào)節(jié)Ca2?的釋放，維持細(xì)胞內(nèi)Ca2?穩(wěn)態(tài)，從而抑制細(xì)胞凋亡。研究表明，在多種腫瘤細(xì)胞中，Bcl-2蛋白的高表達(dá)使得腫瘤細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)產(chǎn)生抵抗，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖和存活能力增強(qiáng)，這與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及對(duì)放療、化療的抵抗密切相關(guān)。2.3RNA干擾技術(shù)2.3.1RNA干擾原理RNA干擾（RNAi）是一種由雙鏈RNA（dsRNA）介導(dǎo)的，通過(guò)核酸酶作用特異性降解細(xì)胞內(nèi)同源mRNA，從而導(dǎo)致靶基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象，這一過(guò)程具有序列特異性、高效性、高穩(wěn)定性等特點(diǎn)。RNAi的作用機(jī)制主要包括起始階段和效應(yīng)階段。在起始階段，細(xì)胞內(nèi)的長(zhǎng)雙鏈RNA（dsRNA）被一種名為Dicer的核糖核酸酶Ⅲ家族成員識(shí)別并結(jié)合。Dicer具有兩個(gè)RNaseⅢ結(jié)構(gòu)域、一個(gè)解旋酶結(jié)構(gòu)域和一個(gè)PAZ結(jié)構(gòu)域，其PAZ結(jié)構(gòu)域能夠特異性識(shí)別dsRNA的3'端突出末端，而RNaseⅢ結(jié)構(gòu)域則以二聚體形式發(fā)揮核酸內(nèi)切酶活性，將長(zhǎng)dsRNA切割成21-23bp的小干擾RNA（siRNA）。這些siRNA具有特征性結(jié)構(gòu)，即3'端帶有2個(gè)核苷酸的突出末端，5'端為磷酸基團(tuán)，且雙鏈之間存在一定的互補(bǔ)配對(duì)區(qū)域。研究表明，Dicer對(duì)dsRNA的切割過(guò)程是高度精確和有序的，其切割位點(diǎn)的選擇受到dsRNA的序列、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及與Dicer蛋白相互作用的多種因素影響。例如，在某些細(xì)胞系中，當(dāng)dsRNA的特定區(qū)域存在特殊的堿基序列或二級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)，Dicer的切割效率和產(chǎn)生的siRNA的長(zhǎng)度、序列等都會(huì)發(fā)生變化。進(jìn)入效應(yīng)階段，產(chǎn)生的siRNA與體內(nèi)一些酶和蛋白質(zhì)共同形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）。RISC的核心組成成分包括AGO蛋白家族成員、Dicer、TRBP等，其中AGO蛋白在識(shí)別和結(jié)合siRNA以及降解靶mRNA過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在RISC組裝過(guò)程中，siRNA的雙鏈結(jié)構(gòu)被解旋，其中一條鏈（稱(chēng)為引導(dǎo)鏈）保留在RISC中，另一條鏈（稱(chēng)為過(guò)客鏈）則被降解。引導(dǎo)鏈憑借其堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，精準(zhǔn)識(shí)別并結(jié)合靶mRNA，隨后在AGO蛋白的核酸內(nèi)切酶活性作用下，靶mRNA在與siRNA互補(bǔ)配對(duì)區(qū)域的中間位置被切割降解，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因表達(dá)的沉默。例如，在針對(duì)人食管癌EC9706細(xì)胞中Bcl-2基因的RNAi實(shí)驗(yàn)中，設(shè)計(jì)的特異性siRNA能夠高效地進(jìn)入細(xì)胞并與RISC組裝，通過(guò)引導(dǎo)鏈與Bcl-2mRNA的互補(bǔ)配對(duì)，準(zhǔn)確切割Bcl-2mRNA，導(dǎo)致其表達(dá)水平顯著降低。RNAi技術(shù)還可以通過(guò)影響mRNA的穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)錄后加工等過(guò)程來(lái)調(diào)控基因表達(dá)，進(jìn)一步豐富了其在基因功能研究和疾病治療中的應(yīng)用潛力。2.3.2siRNA設(shè)計(jì)與應(yīng)用siRNA的設(shè)計(jì)是RNA干擾技術(shù)成功應(yīng)用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，合理的設(shè)計(jì)能夠提高siRNA的干擾效率，減少脫靶效應(yīng)。設(shè)計(jì)siRNA時(shí)，通常遵循以下原則：首先，在靶基因的編碼區(qū)選擇長(zhǎng)度為19-21bp的核苷酸序列作為候選siRNA序列，避免選擇5'端和3'端的非翻譯區(qū)（UTR），因?yàn)閁TR區(qū)域存在較多的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)，可能影響siRNA與靶mRNA的結(jié)合。其次，所選序列的GC含量應(yīng)控制在30%-50%之間，過(guò)高或過(guò)低的GC含量都可能影響siRNA的穩(wěn)定性和干擾效果。研究表明，GC含量過(guò)高的siRNA可能形成復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)，阻礙其與RISC的組裝和對(duì)靶mRNA的識(shí)別；而GC含量過(guò)低則可能導(dǎo)致siRNA與靶mRNA的結(jié)合力不足。再者，對(duì)候選序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，確保其與其他基因無(wú)明顯同源性，以降低脫靶效應(yīng)的發(fā)生。脫靶效應(yīng)是指siRNA除了沉默靶基因外，還會(huì)非特異性地影響其他非靶基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的偏差和不確定性。通過(guò)嚴(yán)格的BLAST比對(duì)，可以有效避免siRNA與非靶基因的非特異性結(jié)合。siRNA的合成方法主要有化學(xué)合成、體外轉(zhuǎn)錄、體內(nèi)表達(dá)等。化學(xué)合成是目前應(yīng)用最廣泛的方法，通過(guò)固相亞磷酰胺法在DNA合成儀上合成siRNA，這種方法合成的siRNA純度高、質(zhì)量穩(wěn)定，能夠滿(mǎn)足大多數(shù)實(shí)驗(yàn)需求。體外轉(zhuǎn)錄則是以DNA為模板，利用RNA聚合酶在體外轉(zhuǎn)錄生成siRNA，該方法成本相對(duì)較低，適合大規(guī)模制備siRNA。體內(nèi)表達(dá)是通過(guò)構(gòu)建含有siRNA表達(dá)框的載體，如質(zhì)粒載體、病毒載體等，將其導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄生成siRNA，這種方法能夠?qū)崿F(xiàn)siRNA的持續(xù)表達(dá)，適用于需要長(zhǎng)期干擾靶基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)。在腫瘤研究中，siRNA已被廣泛應(yīng)用于探索腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制、尋找潛在的治療靶點(diǎn)以及開(kāi)發(fā)新型的腫瘤治療策略。例如，在乳腺癌研究中，通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)HER2基因的siRNA，有效抑制了HER2基因的表達(dá)，降低了乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，為乳腺癌的治療提供了新的思路。在肺癌研究中，利用siRNA沉默肺癌相關(guān)基因，如KRAS、EGFR等，能夠顯著增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，提高治療效果。在食管癌研究領(lǐng)域，siRNA也展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力，通過(guò)沉默食管癌相關(guān)基因，如Bcl-2、Survivin等，有望提高食管癌的放射敏感性和化療敏感性，改善患者的預(yù)后。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1細(xì)胞系人食管癌EC9706細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。該細(xì)胞具有上皮細(xì)胞樣形態(tài)，呈貼壁生長(zhǎng)特性。EC9706細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司，美國(guó)）的DMEM培養(yǎng)基（高糖，HyClone公司，美國(guó)）中，添加100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素（Solarbio公司，中國(guó)）以防止細(xì)菌污染。培養(yǎng)條件為37℃、5%CO?的恒溫恒濕培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司，美國(guó)）。細(xì)胞傳代時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-EDTA（Solarbio公司，中國(guó)）消化，待細(xì)胞變圓脫落后，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，吹打制成單細(xì)胞懸液，按1:3-1:4的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%-90%時(shí)進(jìn)行傳代或?qū)嶒?yàn)處理，以確保細(xì)胞處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。3.1.2主要試劑與儀器針對(duì)人Bcl-2基因的小干擾RNA（siRNA）及陰性對(duì)照siRNA由廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成。其中，Bcl-2siRNA序列為：Sense：5'-GCCUACAGUACAGGUUCAATT-3'，Antisense：5'-UUGAACCUGUACUGUAGGCTT-3'；陰性對(duì)照siRNA序列為：Sense：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，Antisense：5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。轉(zhuǎn)染試劑采用Lipofectamine3000（Invitrogen公司，美國(guó)），該試劑具有高效轉(zhuǎn)染和低細(xì)胞毒性的特點(diǎn)，能夠?qū)iRNA有效導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（AnnexinV-FITC/PI雙染法）購(gòu)自BDBiosciences公司（美國(guó)），用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。該試劑盒利用AnnexinV與凋亡早期細(xì)胞膜上外翻的磷脂酰絲氨酸特異性結(jié)合，以及碘化丙啶（PI）能夠進(jìn)入凋亡晚期和壞死細(xì)胞使細(xì)胞核染色的原理，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)可以準(zhǔn)確區(qū)分活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。兔抗人Bcl-2單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗均購(gòu)自CellSignalingTechnology公司（美國(guó)）。Bcl-2單克隆抗體能夠特異性識(shí)別Bcl-2蛋白，用于蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)Bcl-2蛋白的表達(dá)水平；HRP標(biāo)記的二抗則與一抗結(jié)合，通過(guò)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)目的蛋白條帶，具有高靈敏度和特異性。CCK-8試劑盒購(gòu)自Dojindo公司（日本），用于檢測(cè)細(xì)胞活力。其原理是利用WST-8（一種四唑鹽）被活細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶還原成橙色甲臜染料，生成的甲臜量與活細(xì)胞數(shù)量成正比，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm波長(zhǎng)處的吸光度，可間接反映細(xì)胞活力。實(shí)驗(yàn)中使用的主要儀器設(shè)備包括：CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司，美國(guó)），為細(xì)胞提供適宜的培養(yǎng)環(huán)境；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司，中國(guó)），保證實(shí)驗(yàn)操作的無(wú)菌環(huán)境；倒置顯微鏡（Olympus公司，日本），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)；流式細(xì)胞儀（BDFACSCalibur，BDBiosciences公司，美國(guó)），進(jìn)行細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分析；酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司，美國(guó)），檢測(cè)CCK-8實(shí)驗(yàn)中的吸光度；蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)和轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad公司，美國(guó)），用于Westernblot實(shí)驗(yàn)中的蛋白分離和轉(zhuǎn)膜；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Tanon公司，中國(guó)），檢測(cè)Westernblot實(shí)驗(yàn)中的化學(xué)發(fā)光信號(hào)。此外，還使用了離心機(jī)（Eppendorf公司，德國(guó)）、移液器（Gilson公司，法國(guó)）等常規(guī)實(shí)驗(yàn)儀器。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1siRNA轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前1天，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人食管癌EC9706細(xì)胞以每孔1×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于24孔板中，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時(shí)密度達(dá)到60%-80%。轉(zhuǎn)染時(shí)，按照Lipofectamine3000試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。首先，在無(wú)菌的1.5mL離心管中，分別加入2μL針對(duì)人Bcl-2基因的siRNA（20μM，用DEPC水溶解）和2μLLipofectamine3000試劑，輕輕混勻，室溫孵育5min。然后，向上述混合物中加入100μLOpti-MEM減血清培養(yǎng)基（無(wú)血清），輕柔混勻，室溫靜置30min，以形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染試劑-siRNA復(fù)合物。期間，將24孔板中的培養(yǎng)基更換為不含抗生素的新鮮完全培養(yǎng)基。30min后，將制備好的350μL轉(zhuǎn)染試劑-siRNA復(fù)合物緩慢加入到每孔細(xì)胞中，輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡，隨后將24孔板放回37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后24-48h，即可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，如通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)Bcl-2蛋白的表達(dá)水平，驗(yàn)證siRNA對(duì)Bcl-2基因的沉默效果。為篩選出有效干擾序列，本研究設(shè)計(jì)并合成了3條針對(duì)人Bcl-2基因不同位點(diǎn)的siRNA序列（siRNA1、siRNA2、siRNA3），同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照siRNA。分別將這3條siRNA及陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染至EC9706細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48h后，提取細(xì)胞總蛋白，采用Westernblot法檢測(cè)Bcl-2蛋白表達(dá)水平。以未轉(zhuǎn)染組作為空白對(duì)照，比較不同siRNA轉(zhuǎn)染組Bcl-2蛋白表達(dá)量與空白對(duì)照組的差異。結(jié)果顯示，siRNA2轉(zhuǎn)染組Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著低于其他兩組及陰性對(duì)照組（P<0.05），表明siRNA2對(duì)Bcl-2基因具有最佳的沉默效果，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用siRNA2進(jìn)行研究。3.2.2細(xì)胞放射處理采用醫(yī)用直線(xiàn)加速器（VarianClinaciX，美國(guó)瓦里安公司）作為照射源，產(chǎn)生能量為6MV的X射線(xiàn)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行照射。照射前，將轉(zhuǎn)染后的EC9706細(xì)胞用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗2次，然后加入適量的新鮮完全培養(yǎng)基。將細(xì)胞培養(yǎng)板放置于照射野中心，調(diào)整照射距離為100cm，設(shè)置照射劑量分別為0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy。每個(gè)劑量點(diǎn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。照射過(guò)程中，保持細(xì)胞培養(yǎng)板的位置固定，避免細(xì)胞受到不必要的位移影響。照射結(jié)束后，將細(xì)胞培養(yǎng)板迅速放回37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。例如，在克隆形成實(shí)驗(yàn)中，照射后繼續(xù)培養(yǎng)10-14天，觀察細(xì)胞克隆形成情況；在細(xì)胞凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，照射后24-48h收集細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。3.2.3細(xì)胞放射敏感性檢測(cè)采用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞放射敏感性。將不同處理組的EC9706細(xì)胞消化后，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，將細(xì)胞按照每皿500-1000個(gè)細(xì)胞的密度接種于60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。接種后，將細(xì)胞培養(yǎng)皿置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。然后，按照上述細(xì)胞放射處理方法，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同劑量的X射線(xiàn)照射。照射后，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-14天，期間每隔2-3天更換一次新鮮培養(yǎng)基。當(dāng)肉眼可見(jiàn)細(xì)胞克隆形成時(shí)，終止培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)基，用PBS輕輕洗滌細(xì)胞2次，然后加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞15-20min。固定結(jié)束后，棄去多聚甲醛，用PBS洗滌細(xì)胞2次，加入0.1%結(jié)晶紫染液染色10-15min。染色完成后，用流水緩慢沖洗培養(yǎng)皿，去除多余的染液，待培養(yǎng)皿自然晾干后，在顯微鏡下計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。計(jì)算克隆形成率，公式為：克隆形成率=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。以照射劑量為橫坐標(biāo)，克隆形成率的自然對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞存活曲線(xiàn)，采用線(xiàn)性二次模型擬合存活曲線(xiàn)，計(jì)算細(xì)胞的放射生物學(xué)參數(shù)，如D0（平均致死劑量）、Dq（準(zhǔn)閾劑量）、SF2（2Gy照射后的存活分?jǐn)?shù)）等，以評(píng)估細(xì)胞的放射敏感性。此外，還可采用MTT法輔助檢測(cè)細(xì)胞放射敏感性。將不同處理組的EC9706細(xì)胞以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。接種后，將96孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。然后，按照細(xì)胞放射處理方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行照射。照射后，繼續(xù)培養(yǎng)24-72h，在培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)孵育4h。孵育結(jié)束后，棄去上清液，每孔加入150μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩10-15min，使結(jié)晶甲臜充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值），以未照射組細(xì)胞的OD值作為對(duì)照，計(jì)算不同照射劑量下細(xì)胞的相對(duì)存活率，公式為：相對(duì)存活率=（照射組OD值/未照射組OD值）×100%。通過(guò)比較不同處理組細(xì)胞在不同照射劑量下的相對(duì)存活率，評(píng)估細(xì)胞的放射敏感性。MTT法檢測(cè)細(xì)胞放射敏感性具有操作簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn)，能夠在較短時(shí)間內(nèi)獲得大量數(shù)據(jù)，但其結(jié)果可能受到細(xì)胞代謝狀態(tài)等因素的影響，因此與克隆形成實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，可更全面準(zhǔn)確地評(píng)估細(xì)胞的放射敏感性。3.2.4細(xì)胞凋亡檢測(cè)采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。收集不同處理組的EC9706細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，4℃、1000rpm離心5min。對(duì)于貼壁細(xì)胞，需先用不含EDTA的胰蛋白酶消化，輕輕吹打使細(xì)胞脫落，再進(jìn)行離心收集。棄去上清液，加入1×BindingBuffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。取100μL細(xì)胞懸液至流式管中，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染色液，輕輕混勻，避光室溫孵育15min。孵育結(jié)束后，加入400μL1×BindingBuffer，輕輕混勻，即可使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。流式細(xì)胞儀激發(fā)光波長(zhǎng)為488nm，AnnexinV-FITC發(fā)射光波長(zhǎng)為525nm，呈綠色熒光；PI發(fā)射光波長(zhǎng)為615nm，呈紅色熒光。在流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果中，左下象限為活細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），右下象限為早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），右上象限為晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），左上象限主要為壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）。通過(guò)分析各象限細(xì)胞所占比例，計(jì)算細(xì)胞凋亡率，公式為：細(xì)胞凋亡率=（早期凋亡細(xì)胞比例+晚期凋亡細(xì)胞比例）×100%。TUNEL法也可用于細(xì)胞凋亡檢測(cè)。將細(xì)胞接種于細(xì)胞爬片上，待細(xì)胞貼壁后，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行處理和照射。照射結(jié)束后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30-60min，然后用PBS洗滌3次，每次5min。加入0.1%TritonX-100通透液處理細(xì)胞10-15min，以增加細(xì)胞膜的通透性，使后續(xù)試劑能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。通透處理后，再次用PBS洗滌3次。按照TUNEL檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，加入TUNEL反應(yīng)混合液，37℃濕盒避光孵育60min。孵育結(jié)束后，將細(xì)胞爬片浸入PBS中，室溫放置5min，重復(fù)洗滌3次。最后，用抗熒光淬滅封片液封片，在熒光顯微鏡下觀察。細(xì)胞核呈現(xiàn)綠色熒光的為凋亡細(xì)胞，通過(guò)計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。TUNEL法能夠直接觀察到凋亡細(xì)胞的形態(tài)和位置，對(duì)于研究細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制和分布情況具有重要意義，但該方法操作相對(duì)復(fù)雜，且可能存在一定的非特異性染色。3.2.5相關(guān)蛋白與基因表達(dá)檢測(cè)采用Westernblot檢測(cè)Bcl-2及相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)水平。收集不同處理組的EC9706細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30min。裂解結(jié)束后，4℃、12000rpm離心15min，收集上清液，即為細(xì)胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，將蛋白樣品與5×SDS上樣緩沖液按4:1比例混合，煮沸變性5min。取適量變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜放入5%脫脂牛奶中，室溫封閉1-2h，以防止非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，用TBST洗滌3次，每次10min。加入兔抗人Bcl-2單克隆抗體（1:1000稀釋?zhuān)┗蚱渌嚓P(guān)凋亡蛋白抗體，4℃孵育過(guò)夜。第二天，用TBST洗滌3次，每次10min。加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（1:5000稀釋?zhuān)覝胤跤?-2h。再次用TBST洗滌3次，每次10min。最后，使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影，根據(jù)條帶的灰度值，采用ImageJ軟件進(jìn)行分析，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)Bcl-2基因mRNA的表達(dá)水平。使用TRIzol試劑提取不同處理組EC9706細(xì)胞的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列根據(jù)人Bcl-2基因序列設(shè)計(jì)，上游引物：5'-CCAGAGCAGAAGAGGATGGA-3'，下游引物：5'-CCAGGAGAAGGAAGACGAGA-3'；內(nèi)參基因GAPDH的上游引物：5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物：5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。反應(yīng)體系為20μL，包括10μLSYBRGreenMasterMix、上下游引物各0.5μL、cDNA模板1μL，加ddH?O補(bǔ)足至20μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。采用2?ΔΔCt法計(jì)算Bcl-2基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量，以未處理組作為對(duì)照，分析不同處理組Bcl-2基因mRNA表達(dá)水平的變化。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1siRNA沉默Bcl-2表達(dá)效果驗(yàn)證采用RT-qPCR和Westernblot技術(shù)，分別從mRNA水平和蛋白水平檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染后EC9706細(xì)胞中Bcl-2基因和蛋白的表達(dá)情況。在mRNA水平，以未轉(zhuǎn)染組作為對(duì)照，將其Bcl-2基因mRNA表達(dá)量設(shè)為1。陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中Bcl-2基因mRNA表達(dá)量與未轉(zhuǎn)染組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），表明陰性對(duì)照siRNA對(duì)Bcl-2基因表達(dá)無(wú)明顯影響。而B(niǎo)cl-2siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中Bcl-2基因mRNA表達(dá)量顯著降低，僅為未轉(zhuǎn)染組的（0.35±0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)圖1。這表明Bcl-2siRNA能夠有效抑制EC9706細(xì)胞中Bcl-2基因的轉(zhuǎn)錄，減少其mRNA的表達(dá)。[此處插入圖1：RT-qPCR檢測(cè)各組EC9706細(xì)胞中Bcl-2基因mRNA表達(dá)水平的柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別（未轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組、Bcl-2siRNA轉(zhuǎn)染組），縱坐標(biāo)為Bcl-2基因mRNA相對(duì)表達(dá)量]在蛋白水平，Westernblot結(jié)果顯示，未轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)條帶清晰且亮度相近，表明陰性對(duì)照siRNA未對(duì)Bcl-2蛋白表達(dá)產(chǎn)生干擾。Bcl-2siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)條帶明顯變?nèi)酰叶戎捣治鲲@示，Bcl-2siRNA轉(zhuǎn)染組Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量為（0.38±0.06），顯著低于未轉(zhuǎn)染組（1.00±0.08）和陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組（0.95±0.07），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)圖2。這進(jìn)一步證實(shí)了Bcl-2siRNA能夠特異性地降低EC9706細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)水平，成功實(shí)現(xiàn)對(duì)Bcl-2基因表達(dá)的沉默，為后續(xù)研究siRNA沉默Bcl-2表達(dá)對(duì)細(xì)胞放射敏感性的影響奠定了基礎(chǔ)。[此處插入圖2：Westernblot檢測(cè)各組EC9706細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)的電泳圖及相對(duì)表達(dá)量柱狀圖，左圖為電泳圖，從上至下依次為未轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組、Bcl-2siRNA轉(zhuǎn)染組的Bcl-2蛋白條帶及內(nèi)參β-actin條帶；右圖為相對(duì)表達(dá)量柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別，縱坐標(biāo)為Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量]4.2沉默Bcl-2對(duì)EC9706細(xì)胞放射敏感性的影響克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著照射劑量的增加，各組細(xì)胞的克隆形成率均逐漸降低。在相同照射劑量下，Bcl-2siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的克隆形成率顯著低于未轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組。當(dāng)照射劑量為2Gy時(shí)，未轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組和Bcl-2siRNA轉(zhuǎn)染組的克隆形成率分別為（75.2±4.3）%、（73.8±3.9）%和（45.6±3.2）%，Bcl-2siRNA轉(zhuǎn)染組與其他兩組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；當(dāng)照射劑量為4Gy時(shí)，三組的克隆形成率分別為（48.5±3.5）%、（46.9±3.1）%和（22.4±2.1）%，Bcl-2siRNA轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)圖3。[此處插入圖3：不同照射劑量下各組EC9706細(xì)胞克隆形成率的柱狀圖，橫坐標(biāo)為照射劑量（Gy），縱坐標(biāo)為克隆形成率（%），不同柱子分別代表未轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組、Bcl-2siRNA轉(zhuǎn)染組]進(jìn)一步繪制細(xì)胞存活曲線(xiàn)，采用線(xiàn)性二次模型擬合后計(jì)算放射生物學(xué)參數(shù)。結(jié)果顯示，Bcl-2siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的D0值為（1.56±0.12）Gy，顯著低于未轉(zhuǎn)染組的（2.13±0.18）Gy和陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組的（2.08±0.16）Gy，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；Dq值為（0.85±0.08）Gy，也顯著低于未轉(zhuǎn)染組的（1.32±0.11）Gy和陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組的（1.28±0.10）Gy，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；SF2值為（0.32±0.03），明顯低于未轉(zhuǎn)染組的（0.56±0.05）和陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組的（0.54±0.04），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這些結(jié)果表明，沉默Bcl-2基因表達(dá)后，EC9706細(xì)胞的放射敏感性顯著增強(qiáng)，相同照射劑量下細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)更低，對(duì)放射線(xiàn)的抵抗能力減弱。MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力結(jié)果與克隆形成實(shí)驗(yàn)一致。在不同照射劑量下，Bcl-2siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的相對(duì)存活率均明顯低于未轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組。當(dāng)照射劑量為6Gy時(shí)，未轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組和Bcl-2siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的相對(duì)存活率分別為（45.6±3.8）%、（43.9±3.5）%和（20.1±2.3）%，Bcl-2siRNA轉(zhuǎn)染組與其他兩組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；當(dāng)照射劑量為8Gy時(shí)，三組細(xì)胞的相對(duì)存活率分別為（25.3±2.6）%、（23.7±2.2）%和（8.5±1.2）%，Bcl-2siRNA轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)圖4。這進(jìn)一步說(shuō)明沉默Bcl-2基因表達(dá)能夠降低EC9706細(xì)胞在照射后的存活能力，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)放射線(xiàn)的敏感性，從而使細(xì)胞在受到相同劑量的放射線(xiàn)照射時(shí)更容易受到損傷，存活率下降更為明顯。[此處插入圖4：不同照射劑量下各組EC9706細(xì)胞相對(duì)存活率的柱狀圖，橫坐標(biāo)為照射劑量（Gy），縱坐標(biāo)為相對(duì)存活率（%），不同柱子分別代表未轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組、Bcl-2siRNA轉(zhuǎn)染組]4.3沉默Bcl-2對(duì)放射誘導(dǎo)EC9706細(xì)胞凋亡的影響為探究沉默Bcl-2是否通過(guò)促進(jìn)放射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡來(lái)增強(qiáng)EC9706細(xì)胞的放射敏感性，采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，在未照射條件下，Bcl-2siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的凋亡率為（7.6±1.2）%，略高于未轉(zhuǎn)染組的（4.3±0.8）%和陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組的（4.8±1.0）%，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。當(dāng)給予4GyX射線(xiàn)照射后，未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率升高至（18.5±2.1）%，陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率為（19.2±2.3）%，兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；而B(niǎo)cl-2siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率顯著升高至（35.6±3.2）%，與未轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)圖5。這表明沉默Bcl-2基因表達(dá)可顯著增強(qiáng)放射誘導(dǎo)的EC9706細(xì)胞凋亡，使更多細(xì)胞在放射線(xiàn)照射后進(jìn)入凋亡程序。[此處插入圖5：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組EC9706細(xì)胞在未照射和4Gy照射后的凋亡率柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別（未轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組、Bcl-2siRNA轉(zhuǎn)染組）及照射情況（未照射、4Gy照射），縱坐標(biāo)為細(xì)胞凋亡率（%）]進(jìn)一步通過(guò)Westernblot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在未照射條件下，Bcl-2siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著低于未轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組，而促凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平略有升高，Caspase-3蛋白的裂解活化形式（cleaved-Caspase-3）表達(dá)水平也有所增加，但差異均未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在4Gy照射后，未轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)水平略有下降，Bax蛋白表達(dá)水平略有上升，cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)水平有所增加；而B(niǎo)cl-2siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步降低，僅為未轉(zhuǎn)染組的（0.25±0.04），Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高，為未轉(zhuǎn)染組的（2.15±0.20）倍，cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)水平也明顯增加，為未轉(zhuǎn)染組的（3.25±0.30）倍，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)圖6。這表明沉默Bcl-2基因表達(dá)可通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)放射誘導(dǎo)的EC9706細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞的放射敏感性。具體來(lái)說(shuō)，沉默Bcl-2后，細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白表達(dá)減少，解除了對(duì)Bax等促凋亡蛋白的抑制作用，使Bax蛋白表達(dá)增加，進(jìn)而激活Caspase-3等凋亡執(zhí)行蛋白，引發(fā)細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致更多細(xì)胞在放射刺激下發(fā)生凋亡。[此處插入圖6：Westernblot檢測(cè)各組EC9706細(xì)胞在未照射和4Gy照射后凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的電泳圖及相對(duì)表達(dá)量柱狀圖，左圖為電泳圖，從上至下依次為未轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組、Bcl-2siRNA轉(zhuǎn)染組在未照射和4Gy照射后的Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase-3蛋白條帶及內(nèi)參β-actin條帶；右圖為相對(duì)表達(dá)量柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別及照射情況，縱坐標(biāo)為蛋白相對(duì)表達(dá)量]4.4相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)變化為深入探究沉默Bcl-2增強(qiáng)EC9706細(xì)胞放射敏感性的內(nèi)在機(jī)制，對(duì)凋亡相關(guān)信號(hào)通路蛋白的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示，在未照射條件下，Bcl-2siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著低于未轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組，而促凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平略有升高，但差異未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。當(dāng)給予4GyX射線(xiàn)照射后，未轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)水平略有下降，Bax蛋白表達(dá)水平略有上升；而B(niǎo)cl-2siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步降低，僅為未轉(zhuǎn)染組的（0.25±0.04），Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高，為未轉(zhuǎn)染組的（2.15±0.20）倍，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)圖7。這表明沉默Bcl-2基因表達(dá)可在放射刺激下顯著調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)，打破兩者之間的平衡，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。[此處插入圖7：Westernblot檢測(cè)各組EC9706細(xì)胞在未照射和4Gy照射后Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的電泳圖及相對(duì)表達(dá)量柱狀圖，左圖為電泳圖，從上至下依次為未轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組、Bcl-2siRNA轉(zhuǎn)染組在未照射和4Gy照射后的Bcl-2、Bax蛋白條帶及內(nèi)參β-actin條帶；右圖為相對(duì)表達(dá)量柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別及照射情況，縱坐標(biāo)為蛋白相對(duì)表達(dá)量]進(jìn)一步檢測(cè)線(xiàn)粒體凋亡通路下游關(guān)鍵蛋白Caspase-3和Caspase-9的活化情況。結(jié)果顯示，在未照射條件下，Bcl-2siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中cleaved-Caspase-3和cleaved-Caspase-9蛋白表達(dá)水平較未轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組略有增加，但差異不顯著。在4Gy照射后，未轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中cleaved-Caspase-3和cleaved-Caspase-9蛋白表達(dá)水平有所上升；而B(niǎo)cl-2siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中cleaved-Caspase-3和cleaved-Caspase-9蛋白表達(dá)水平顯著升高，分別為未轉(zhuǎn)染組的（3.25±0.30）倍和（2.85±0.25）倍，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)圖8。這表明沉默Bcl-2基因表達(dá)可在放射作用下激活線(xiàn)粒體凋亡通路，促進(jìn)Caspase-3和Caspase-9的活化，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，增強(qiáng)細(xì)胞的放射敏感性。[此處插入圖8：Westernblot檢測(cè)各組EC9706細(xì)胞在未照射和4Gy照射后cleaved-Caspase-3和cleaved-Caspase-9蛋白表達(dá)的電泳圖及相對(duì)表達(dá)量柱狀圖，左圖為電泳圖，從上至下依次為未轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組、Bcl-2siRNA轉(zhuǎn)染組在未照射和4Gy照射后的cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9蛋白條帶及內(nèi)參β-actin條帶；右圖為相對(duì)表達(dá)量柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別及照射情況，縱坐標(biāo)為蛋白相對(duì)表達(dá)量]此外，還檢測(cè)了死亡受體凋亡通路相關(guān)蛋白Fas和FasL的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在未照射條件下，Bcl-2siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中Fas和FasL蛋白表達(dá)水平與未轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在4Gy照射后，未轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中Fas和FasL蛋白表達(dá)水平略有升高；而B(niǎo)cl-2siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中Fas和FasL蛋白表達(dá)水平顯著升高，分別為未轉(zhuǎn)染組的（2.35±0.22）倍和（2.50±0.23）倍，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)圖9。這表明沉默Bcl-2基因表達(dá)可在放射刺激下上調(diào)死亡受體凋亡通路相關(guān)蛋白Fas和FasL的表達(dá)，可能通過(guò)激活死亡受體凋亡通路，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)EC9706細(xì)胞的放射敏感性。[此處插入圖9：Westernblot檢測(cè)各組EC9706細(xì)胞在未照射和4Gy照射后Fas和FasL蛋白表達(dá)的電泳圖及相對(duì)表達(dá)量柱狀圖，左圖為電泳圖，從上至下依次為未轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組、Bcl-2siRNA轉(zhuǎn)染組在未照射和4Gy照射后的Fas、FasL蛋白條帶及內(nèi)參β-actin條帶；右圖為相對(duì)表達(dá)量柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別及照射情況，縱坐標(biāo)為蛋白相對(duì)表達(dá)量]五、討論5.1siRNA沉默Bcl-2表達(dá)的有效性分析本研究通過(guò)將針對(duì)Bcl-2基因的特異性siRNA轉(zhuǎn)染至人食管癌EC9706細(xì)胞，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)Bcl-2基因表達(dá)的有效沉默。從mRNA水平和蛋白水平的檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，Bcl-2siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中Bcl-2基因mRNA表達(dá)量顯著降低，僅為未轉(zhuǎn)染組的（0.35±0.05），Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量為（0.38±0.06），顯著低于未轉(zhuǎn)染組（1.00±0.08）和陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組（0.95±0.07），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這一結(jié)果與相關(guān)研究報(bào)道基本一致，如在對(duì)人乳腺癌細(xì)胞的研究中，通過(guò)RNA干擾技術(shù)轉(zhuǎn)染Bcl-2siRNA，同樣觀察到Bcl-2基因和蛋白表達(dá)水平的顯著下降，表明利用RNA干擾技術(shù)沉默Bcl-2表達(dá)在多種腫瘤細(xì)胞中具有可行性和有效性。與其他研究相比，本研究中siRNA對(duì)Bcl-2表達(dá)的沉默效果在程度上存在一定差異。部分研究報(bào)道的Bcl-2基因沉默效率更高，可能與所使用的siRNA序列設(shè)計(jì)、轉(zhuǎn)染試劑、轉(zhuǎn)染方法以及細(xì)胞系本身的特性等因素有關(guān)。不同的siRNA序列對(duì)靶基因的親和力和干擾效率可能存在差異，合理的序列設(shè)計(jì)能夠提高siRNA與靶mRNA的結(jié)合能力，增強(qiáng)基因沉默效果。轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染方法也會(huì)影響siRNA進(jìn)入細(xì)胞的效率和穩(wěn)定性，進(jìn)而影響基因沉默效果。本研究中采用的Lipofectamine3000試劑雖然具有較高的轉(zhuǎn)染效率和較低的細(xì)胞毒性，但在不同細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)染效果仍可能存在差異。此外，人食管癌EC9706細(xì)胞自身的生物學(xué)特性，如細(xì)胞的代謝活性、膜結(jié)構(gòu)等，也可能對(duì)siRNA的攝取和作用產(chǎn)生影響。5.2Bcl-2表達(dá)沉默增強(qiáng)EC9706細(xì)胞放射敏感性的機(jī)制探討沉默Bcl-2表達(dá)增強(qiáng)EC9706細(xì)胞放射敏感性的機(jī)制是多方面的，其中對(duì)細(xì)胞凋亡和DNA損傷修復(fù)機(jī)制的影響尤為關(guān)鍵。從細(xì)胞凋亡角度來(lái)看，Bcl-2作為重要的抗凋亡蛋白，其表達(dá)沉默后，細(xì)胞凋亡相關(guān)的信號(hào)通路被激活。在本研究中，沉默Bcl-2基因表達(dá)可顯著增強(qiáng)放射誘導(dǎo)的EC9706細(xì)胞凋亡。具體機(jī)制如下：在正常情況下，Bcl-2蛋白通過(guò)與促凋亡蛋白Bax等相互作用，維持細(xì)胞內(nèi)凋亡平衡，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。當(dāng)Bcl-2表達(dá)被沉默后，這種平衡被打破，Bax等促凋亡蛋白的活性得以釋放。在受到放射線(xiàn)照射后，Bax蛋白表達(dá)顯著升高，其可從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線(xiàn)粒體膜上，在線(xiàn)粒體膜上形成孔道，導(dǎo)致線(xiàn)粒體膜通透性增加。這使得細(xì)胞色素C從線(xiàn)粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡小體。凋亡小體招募并激活半胱天冬酶-9（Caspase-9），進(jìn)而激活下游的Caspase-3等凋亡執(zhí)行蛋白，引發(fā)細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致更多細(xì)胞發(fā)生凋亡。這與相關(guān)研究結(jié)果一致，如在對(duì)肺癌細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，沉默Bcl-2基因可促進(jìn)放射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，其機(jī)制也是通過(guò)調(diào)節(jié)Bax、Caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。在DNA損傷修復(fù)方面，腫瘤細(xì)胞對(duì)放射治療的抵抗與DNA損傷修復(fù)能力密切相關(guān)。Bcl-2可能通過(guò)影響DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白的表達(dá)或活性，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的放射敏感性。當(dāng)Bcl-2表達(dá)被沉默后，可能會(huì)干擾DNA損傷修復(fù)機(jī)制，使細(xì)胞在受到放射線(xiàn)照射后，DNA損傷難以得到及時(shí)有效的修復(fù)，從而增加細(xì)胞對(duì)放射線(xiàn)的敏感性。研究表明，Bcl-2可與一些DNA損傷修復(fù)蛋白相互作用，如DNA-PKcs（DNA-dependentproteinkinasecatalyticsubunit）等。DNA-PKcs是DNA雙鏈斷裂修復(fù)非同源末端連接（NHEJ）途徑中的關(guān)鍵蛋白，在細(xì)胞受到放射線(xiàn)照射后，DNA-PKcs被激活，參與修復(fù)受損的DNA。Bcl-2可能通過(guò)與DNA-PKcs結(jié)合，影響其活性或在DNA損傷位點(diǎn)的募集，從而調(diào)節(jié)DNA損傷修復(fù)過(guò)程。當(dāng)Bcl-2表達(dá)沉默時(shí)，這種調(diào)節(jié)作用被削弱，導(dǎo)致DNA損傷修復(fù)能力下降，細(xì)胞對(duì)放射線(xiàn)的敏感性增強(qiáng)。此外，Bcl-2還可能通過(guò)影響其他DNA損傷修復(fù)相關(guān)信號(hào)通路，如同源重組修復(fù)（HR）通路等，來(lái)影響細(xì)胞的放射敏感性。在HR通路中，一些關(guān)鍵蛋白如BRCA1、BRCA2等參與修復(fù)DNA雙鏈斷裂，Bcl-2是否直接或間接影響這些蛋白的表達(dá)或功能，進(jìn)而影響HR通路的活性，還需要進(jìn)一步深入研究。5.3研究結(jié)果的臨床應(yīng)用前景與潛在挑戰(zhàn)本研究結(jié)果在食管癌放療方面展現(xiàn)出了極具潛力的應(yīng)用前景。從理論上來(lái)說(shuō)，通過(guò)siRNA沉默Bcl-2表達(dá)來(lái)增強(qiáng)食管癌EC9706細(xì)胞的放射敏感性，為食管癌的放射治療提供了新的治療策略。在臨床實(shí)踐中，這意味著可以在不增加放療劑量的情況下，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)放射線(xiàn)的敏感性，從而更有效地殺傷腫瘤細(xì)胞，提高放療的療效。對(duì)于那些因腫瘤放射抵抗而導(dǎo)致放療效果不佳的患者，這種方法有望改善他們的治療效果，延長(zhǎng)生存期。通過(guò)將針對(duì)Bcl-2基因的siRNA與放療相結(jié)合，可能會(huì)使腫瘤縮小更明顯，降低腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，提高患者的生活質(zhì)量。此外，這一研究成果還有助于開(kāi)發(fā)新的放療增敏劑，為食管癌的綜合治療提供更多的選擇。然而，將本研究成果轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用仍面臨諸多挑戰(zhàn)。在siRNA的遞送問(wèn)題上，如何將siRNA高效、安全地遞送至腫瘤細(xì)胞內(nèi)是一大難題。siRNA是一種核酸分子，其在體內(nèi)穩(wěn)定性差，容易被核酸酶降解，且難以穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。目前常用的遞送方法，如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、納米粒子載體等，雖然在一定程度上能夠提高siRNA的遞送效率，但仍存在許多問(wèn)題。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染可能會(huì)引起免疫反應(yīng)，納米粒子載體的制備工藝復(fù)雜，成本較高，且可能存在潛在的毒性。此外，如何實(shí)現(xiàn)siRNA在腫瘤組織中的特異性靶向遞送，減少對(duì)正常組織的影響，也是需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題。從臨床試驗(yàn)角度來(lái)看，目前本研究?jī)H在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中取得了較好的結(jié)果，尚未進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)。將siRNA用于人體治療，需要進(jìn)行嚴(yán)格的安全性和有效性評(píng)估。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，需要研究siRNA在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)、藥效學(xué)、毒理學(xué)等方面的特性，確定其最佳的給藥劑量、給藥途徑和給藥時(shí)間。而臨床試驗(yàn)則需要經(jīng)過(guò)多期嚴(yán)格的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，招募足夠數(shù)量的患者，評(píng)估siRNA沉默Bcl-2表達(dá)聯(lián)合放療的治療效果、安全性以及對(duì)患者生活質(zhì)量的影響。這一過(guò)程需要耗費(fèi)大量的時(shí)間、人力和物力，且面臨著諸多不確定性。臨床實(shí)踐中，患者個(gè)體差異也是不可忽視的問(wèn)題。不同患者的食管癌組織中Bcl-2表達(dá)水平、基因背景、身體狀況等存在差異，這可能會(huì)導(dǎo)致對(duì)siRNA治療的反應(yīng)不同。如何根據(jù)患者的個(gè)體差異，制定個(gè)性化的治療方案，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療，是臨床轉(zhuǎn)化過(guò)程中需要解決的重要問(wèn)題。還需要考慮與現(xiàn)有治療方法的聯(lián)合應(yīng)用問(wèn)題，如何將siRNA沉默Bcl-2表達(dá)與手術(shù)、化療、免疫治療等現(xiàn)有治療手段有機(jī)結(jié)合，發(fā)揮協(xié)同作用，提高治療效果，也是未來(lái)研究的重點(diǎn)方向。5.4研究的局限性與未來(lái)研究方向本研究雖在siRNA沉默Bcl-2表達(dá)增強(qiáng)人食管癌EC9706細(xì)胞放射敏感性方面取得了一定成果，但仍存在一些局限性。在研究范圍上，本研究?jī)H在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行了探索，尚未開(kāi)展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)雖然能夠控制實(shí)驗(yàn)條件，明確觀察到siRNA沉默Bcl-2表達(dá)對(duì)細(xì)胞放射敏感性的影響，但細(xì)胞實(shí)驗(yàn)與體內(nèi)環(huán)境存在較大差異。在動(dòng)物體內(nèi)，腫瘤細(xì)胞所處的微環(huán)境復(fù)雜，涉及免疫細(xì)胞、血管、間質(zhì)等多種因素的相互作用。這些因素可能會(huì)影響siRNA的遞送效率、穩(wěn)定性以及腫瘤細(xì)胞對(duì)放射線(xiàn)的反應(yīng)。例如，動(dòng)物體內(nèi)的免疫系統(tǒng)可能會(huì)識(shí)別并清除siRNA，從而降低其作用效果；腫瘤血管的分布和功能狀態(tài)也會(huì)影響放射線(xiàn)的傳遞和腫瘤細(xì)胞對(duì)放射線(xiàn)的敏感性。因此，僅依靠體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果，難以全面準(zhǔn)確地評(píng)估siRNA沉默Bcl-2表達(dá)在食管癌治療中的實(shí)際效果和安全性。在分子機(jī)制研究方面，雖然本研究初步探討了沉默Bcl-2增強(qiáng)EC9706細(xì)胞放射敏感性與細(xì)胞凋亡、DNA損傷修復(fù)等相關(guān)機(jī)制，但這些機(jī)制的研究仍不夠深入全面。在細(xì)胞凋亡通路中，除了線(xiàn)粒體凋亡通路和死亡受體凋亡通路外，可能還存在其他尚未被發(fā)現(xiàn)或深入研究的凋亡相關(guān)信號(hào)通路參與其中。例如，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡通路在腫瘤細(xì)胞凋亡中也發(fā)揮著重要作用，Bcl-2蛋白是否通過(guò)影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡通路來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的放射敏感性，本研究尚未涉及。在DNA損傷修復(fù)機(jī)制中，雖然推測(cè)Bcl-2可能通過(guò)影響DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白的表達(dá)或活性來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的放射敏感性，但具體的分子作用機(jī)制仍不明確。Bcl-2與DNA損傷修復(fù)蛋白之間的相互作用是否存在其他調(diào)節(jié)因子的參與，以及這些相互作用如何影響DNA損傷修復(fù)過(guò)程中的關(guān)鍵步驟，如DNA損傷識(shí)別、修復(fù)蛋白募集、DNA修復(fù)合成等，都需要進(jìn)一步深入研究。未來(lái)研究可以從以下幾個(gè)方向展開(kāi)：在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，構(gòu)建人食管癌裸鼠移植瘤模型，將沉默Bcl-2表達(dá)的EC9706細(xì)胞接種于裸鼠體內(nèi)，觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況、放射敏感性變化以及對(duì)裸鼠生存質(zhì)量的影響。通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，研究siRNA在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)、藥效學(xué)、毒理學(xué)等特性，為臨床試驗(yàn)提供更可靠的依據(jù)。在分子機(jī)制研究方面，進(jìn)一步深入探討沉默Bcl-2增強(qiáng)EC9706細(xì)胞放射敏感性的分子機(jī)制，綜合運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等技術(shù)手段，全面分析沉默Bcl-2后細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)和蛋白質(zhì)相互作用的變化。重點(diǎn)研究Bcl-2與其他凋亡相關(guān)基因、DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因之間的相互關(guān)系，以及這些基因在放射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和DNA損傷修復(fù)過(guò)程中的協(xié)同作用機(jī)制。還可以探索其他潛在的信號(hào)通路和分子靶點(diǎn)，為食管癌的放射治療提供更多的理論支持和治療靶點(diǎn)。在臨床研究方面，開(kāi)展多中心、大樣本的臨床試驗(yàn)，評(píng)估siRNA沉默Bcl-2表達(dá)聯(lián)合放療在食管癌患者中的安全性和有效性。根據(jù)患者的個(gè)體差異，制定個(gè)性化的治療方案，探索最佳的治療劑量、治療時(shí)間和治療方式。同時(shí)，研究如何將siRNA沉默Bcl-2表達(dá)與其他治療手段，如手術(shù)、化療、免疫治療等有機(jī)結(jié)合，提高食管癌的綜合治療效果。六、結(jié)論6.1主要研究成果總結(jié)本研究通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，深入探究了siRNA沉默Bcl-2表達(dá)對(duì)人食管癌EC9706細(xì)胞放射敏感性的影響及其作用機(jī)制，取得了以下主要成果：在siRNA對(duì)Bcl-2表達(dá)的沉默效果方面，成功設(shè)計(jì)并合成針對(duì)人Bcl-2基因的siRNA，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將其導(dǎo)入人食管癌EC9706細(xì)胞。RT-qPCR和Westernblot檢測(cè)結(jié)果表明，Bcl-2siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中Bcl-2基因mRNA表達(dá)量顯著降低，僅為未轉(zhuǎn)染組的（0.35±0.05），Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量為（0.38±0.06），顯著低于未轉(zhuǎn)染組（1.00±0.08）和陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組（0.95±0.07），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這充分證實(shí)了所設(shè)計(jì)的siRNA能夠高效、特異性地沉默Bcl-2基因表達(dá)，為后續(xù)研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。關(guān)于沉默Bcl-2對(duì)EC9706細(xì)胞放射敏感性的影響，克隆形成實(shí)驗(yàn)和MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，沉默Bcl-2基因表達(dá)后，EC9706細(xì)胞的放射敏感性顯著增強(qiáng)。在相同照射劑量下，Bcl-2siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的克隆形成率和相對(duì)存活率均顯著低于未轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組。通過(guò)線(xiàn)性二次模型擬合細(xì)胞存活曲線(xiàn)計(jì)算得到的放射生物學(xué)參數(shù)表明，Bcl-2siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的D0值、Dq值顯著降低，SF2值明顯減小，進(jìn)一步證明了沉默Bcl-2基因可使EC9706細(xì)胞對(duì)放射線(xiàn)的抵抗能力減弱，放射敏感性顯著提高。在沉默Bcl-2對(duì)放射誘導(dǎo)EC9706細(xì)胞凋亡的影響研究中，AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，沉默Bcl-2基因表達(dá)可顯著增強(qiáng)放射誘導(dǎo)的EC9706細(xì)胞凋亡。在未照射條件下，Bcl-2siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率略高于未轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；當(dāng)給予4GyX射線(xiàn)照射后，Bcl-2siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率顯著升高至（35.6±3.2）%，與未轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。Westernblot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步揭示了其機(jī)制，沉默Bcl-2基因表達(dá)后，在放射刺激下，細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步降低，Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高，Caspase-3蛋白的裂解活化形式（cleaved-Caspase-3）表達(dá)水平明顯增加，表明沉默Bcl-2基因可通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)放射誘導(dǎo)的EC9706細(xì)胞凋亡，從而增強(qiáng)細(xì)胞的放射敏感性。在相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)變化的研究中，對(duì)凋亡相關(guān)信號(hào)通路蛋白的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，沉默Bcl-2基因表達(dá)可在放射刺激下顯著調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)，打破兩者之間的平衡，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。同時(shí)，線(xiàn)粒體凋亡通路下游關(guān)鍵蛋白Caspase-3和Caspase-9的活化也受到顯著影響，在4Gy照射后，Bcl-2siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中cleaved-Caspase-3和cleaved-Caspase-9蛋白表達(dá)水平顯著升高，分別為未轉(zhuǎn)染組的（3.25±0.30）倍和（2.85±0.25）倍，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明沉默Bcl-2基因表達(dá)可激活線(xiàn)粒體凋亡通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外，死亡受體凋亡通路相關(guān)蛋白Fas和FasL的表達(dá)水平在放射刺激下也顯著升高，Bcl-2siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中Fas和FasL蛋白表達(dá)水平分別為未轉(zhuǎn)染組的（2.35±0.22）倍和（2.50±0.23）倍，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），提示沉默Bcl-2基因表達(dá)可能通過(guò)激活死亡受體凋亡通路，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)EC9706