基于RNA干擾技術(shù)構(gòu)建MMP-9基因沉默胃癌動物模型及機制探究一、引言1.1研究背景與意義胃癌是全球范圍內(nèi)嚴重威脅人類健康的重大疾病之一，其發(fā)病率和死亡率在各類惡性腫瘤中一直居高不下。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥數(shù)據(jù)顯示，胃癌的新發(fā)病例數(shù)約為108.9萬，死亡病例數(shù)約為76.9萬，分別位居全球癌癥發(fā)病和死亡的第五位和第四位。在中國，胃癌的形勢更為嚴峻，每年新發(fā)胃癌病例數(shù)占全球新發(fā)病例數(shù)的近一半，且大多數(shù)患者確診時已處于中晚期，治療難度大，預后較差。早期胃癌患者手術(shù)治療后的5年生存率超過90％，而晚期胃癌患者的生存期往往不超過1年，嚴重影響患者的生活質(zhì)量和生命健康。因此，深入研究胃癌的發(fā)病機制并尋找有效的治療靶點具有迫切的臨床需求。在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中，眾多基因和分子參與其中，基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）便是關(guān)鍵分子之一。MMP-9屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族，主要功能是降解細胞外基質(zhì)和基底膜的主要成分，如Ⅳ型膠原蛋白等。在正常生理狀態(tài)下，MMP-9的表達和活性受到嚴格調(diào)控，參與組織的修復、重塑以及細胞的遷移等過程。然而，在胃癌等惡性腫瘤中，MMP-9的表達常常出現(xiàn)異常升高。大量研究表明，MMP-9在胃癌組織中的高表達與腫瘤的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移以及不良預后密切相關(guān)。它能夠通過降解基底膜和細胞外基質(zhì)，為胃癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移開辟道路，促進腫瘤細胞突破局部組織的限制，進入血液循環(huán)和淋巴循環(huán)，從而導致腫瘤的擴散。例如，有研究通過對189例胃癌患者的組織樣本進行檢測分析，發(fā)現(xiàn)MMP-9蛋白的陽性表達率在胃癌組織中高達78.3％，且其表達與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度及Lauren分型顯著相關(guān)。還有研究顯示，MMP-9陽性患者的微血管密度（MVD）值高于陰性組，提示MMP-9在促進血管生成中起重要作用，而新生血管的形成又為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移提供了必要的營養(yǎng)和氧氣支持。因此，MMP-9成為胃癌研究中的一個重要靶點，深入探究其在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制，對于揭示胃癌的發(fā)病機理以及尋找有效的治療策略具有重要意義。RNA干擾（RNAi）技術(shù)作為一種新興的基因沉默技術(shù)，近年來在基因功能研究和疾病治療領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的潛力。RNAi的作用機制是細胞內(nèi)的雙鏈RNA（dsRNA）被核酸酶切割成小干擾RNA（siRNA），這些siRNA能夠特異性地識別并結(jié)合與其互補的mRNA序列，在核酸酶的作用下將mRNA降解，從而實現(xiàn)對特定基因表達的抑制，達到基因沉默的效果。這一技術(shù)具有高度的特異性、高效性以及相對較低的毒性等優(yōu)點，能夠精準地調(diào)控目標基因的表達，為腫瘤基因治療提供了新的策略和方法。在腫瘤研究中，RNAi技術(shù)已被廣泛應用于針對癌細胞內(nèi)的關(guān)鍵基因進行靶向干擾，以達到抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的目的。通過RNAi技術(shù)沉默腫瘤相關(guān)基因，能夠阻斷腫瘤細胞的生長信號通路、抑制腫瘤細胞的增殖、誘導腫瘤細胞凋亡以及抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移等。在胃癌治療研究中，RNAi技術(shù)同樣為攻克這一難題帶來了新的希望。例如，有研究運用RNAi技術(shù)沉默胃癌細胞中的某些致癌基因，發(fā)現(xiàn)能夠顯著抑制胃癌細胞的增殖和侵襲能力，為胃癌的治療提供了新的思路和方法?；赗NA干擾技術(shù)建立MMP-9基因沉默的胃癌動物模型，對于深入研究胃癌的發(fā)病機制和治療策略具有不可替代的重要作用。在體外細胞實驗中，雖然能夠?qū)虻墓δ芎妥饔脵C制進行初步研究，但細胞實驗存在一定的局限性，無法完全模擬體內(nèi)復雜的生理病理環(huán)境。而動物模型則能夠更真實地反映腫瘤在體內(nèi)的發(fā)生發(fā)展過程，包括腫瘤與宿主組織的相互作用、腫瘤的血管生成、免疫逃逸以及轉(zhuǎn)移等過程。通過構(gòu)建MMP-9基因沉默的胃癌動物模型，可以在體內(nèi)水平研究MMP-9基因沉默對胃癌細胞成瘤能力、瘤體生長速度、轉(zhuǎn)移能力以及對宿主免疫系統(tǒng)影響等方面的作用，從而深入揭示MMP-9在胃癌發(fā)生發(fā)展中的分子機制。此外，該動物模型還可以用于評估以MMP-9為靶點的新型治療藥物和治療方法的療效和安全性。在臨床前研究中，利用動物模型對新的治療策略進行驗證和優(yōu)化，能夠為后續(xù)的臨床試驗提供重要的參考依據(jù)，加速新型治療手段從實驗室到臨床應用的轉(zhuǎn)化過程，為胃癌患者帶來更多有效的治療選擇，提高胃癌的治療效果和患者的生存率，改善患者的生活質(zhì)量。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在RNA干擾技術(shù)的研究與應用方面，國外起步相對較早，取得了一系列具有開創(chuàng)性的成果。20世紀90年代，RNAi現(xiàn)象在植物和真菌中被首次觀察到，當時被視為轉(zhuǎn)錄后“基因沉默”和“抑制”現(xiàn)象。1998年，F(xiàn)ire和Mello在秀麗隱桿線蟲的研究中發(fā)現(xiàn)，雙鏈RNA（dsRNA）是蛋白表達序列特異性抑制現(xiàn)象的根源，并正式將其命名為“RNA干擾”，二人也因此榮獲2006年的諾貝爾生理或醫(yī)學獎。此后，RNAi技術(shù)在基因功能研究領(lǐng)域迅速崛起，國外研究團隊借助該技術(shù)在多種模式生物中對大量基因進行功能驗證，極大地推動了基因功能學的發(fā)展。在腫瘤治療研究領(lǐng)域，國外研究人員積極探索將RNAi技術(shù)應用于多種癌癥的治療，針對乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌等腫瘤相關(guān)基因開展靶向干擾研究，在細胞實驗和動物模型中均取得了一定程度上抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的效果。例如，有研究利用RNAi技術(shù)沉默乳腺癌細胞中的關(guān)鍵致癌基因，成功抑制了癌細胞的增殖和遷移能力；在肺癌研究中，通過RNAi干擾腫瘤血管生成相關(guān)基因，有效減少了腫瘤的血供，抑制了腫瘤的生長。國內(nèi)對于RNAi技術(shù)的研究也緊跟國際前沿，在RNAi作用機制的深度探究、高效RNAi載體的構(gòu)建以及在疾病治療中的應用等方面都取得了顯著的進展。國內(nèi)科研團隊圍繞利用RNAi技術(shù)治療病毒性疾病、遺傳性疾病以及腫瘤等開展了大量深入的研究工作，部分研究成果已順利進入臨床試驗階段，為RNAi技術(shù)的臨床轉(zhuǎn)化提供了重要的支撐。例如，在乙肝病毒感染的治療研究中，國內(nèi)團隊通過設計特異性的siRNA，有效抑制了乙肝病毒基因的表達，降低了病毒載量；在遺傳性視網(wǎng)膜疾病的研究中，利用RNAi技術(shù)成功糾正了相關(guān)基因突變導致的異常蛋白表達，為該類疾病的治療帶來了新的希望。關(guān)于MMP-9基因與胃癌關(guān)系的研究，國內(nèi)外眾多研究均表明，MMP-9在胃癌組織中的表達顯著高于正常胃黏膜組織，并且其高表達與胃癌的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移以及不良預后密切相關(guān)。國外有研究通過對大量胃癌患者的組織樣本進行分析，發(fā)現(xiàn)MMP-9的表達水平與腫瘤的TNM分期呈正相關(guān)，TNM分期越高，MMP-9的表達水平越高。國內(nèi)學者也通過免疫組織化學、RT-PCR等多種技術(shù)手段對MMP-9在胃癌中的表達及作用進行了深入研究，結(jié)果同樣證實了MMP-9在胃癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用。如一項國內(nèi)研究對150例胃癌患者的臨床病理資料進行分析，發(fā)現(xiàn)MMP-9陽性表達的胃癌患者5年生存率明顯低于陰性表達患者，提示MMP-9可作為評估胃癌患者預后的重要指標。在相關(guān)動物模型構(gòu)建方面，國內(nèi)外研究人員也進行了大量探索。國外有研究成功構(gòu)建了MMP-9高表達的胃癌小鼠模型，通過對該模型的研究，深入探討了MMP-9在胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的分子機制。國內(nèi)也有團隊構(gòu)建了基于RNA干擾技術(shù)的MMP-9基因沉默的胃癌細胞系，并將其接種到裸鼠體內(nèi)建立動物模型，研究發(fā)現(xiàn)MMP-9基因沉默后，胃癌細胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤率、瘤體生長速度以及轉(zhuǎn)移能力均受到明顯抑制。這些研究成果為進一步深入研究胃癌的發(fā)病機制和治療策略提供了重要的實驗依據(jù)和模型基礎。然而，目前已有的研究在RNAi載體的靶向性、穩(wěn)定性以及在體內(nèi)的有效遞送等方面仍存在一些亟待解決的問題，需要進一步深入研究和優(yōu)化，以提高基于RNA干擾技術(shù)的胃癌治療策略的有效性和安全性。1.3研究目的與創(chuàng)新點本研究旨在通過RNA干擾技術(shù)構(gòu)建MMP-9基因沉默的胃癌動物模型，以此深入探究MMP-9基因在胃癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中的作用機制，并評估以MMP-9為靶點的RNA干擾治療策略在胃癌治療中的可行性和有效性。具體而言，一方面，通過構(gòu)建該動物模型，觀察MMP-9基因沉默后對胃癌細胞在體內(nèi)的成瘤能力、瘤體生長速度、轉(zhuǎn)移潛能以及對腫瘤微環(huán)境的影響，從而揭示MMP-9基因在胃癌發(fā)病機制中的分子生物學機制；另一方面，利用構(gòu)建的動物模型，評價RNA干擾技術(shù)對MMP-9基因的沉默效果以及對胃癌生長和轉(zhuǎn)移的抑制作用，為將RNA干擾技術(shù)轉(zhuǎn)化為臨床治療胃癌的有效手段提供重要的實驗依據(jù)。在創(chuàng)新點方面，本研究在模型構(gòu)建方法上進行了創(chuàng)新。在以往的研究中，構(gòu)建胃癌動物模型時，RNAi載體的遞送方式和效率存在一定局限性。本研究擬采用新型的納米載體系統(tǒng)作為RNAi的遞送工具，這種納米載體具有良好的生物相容性、靶向性和穩(wěn)定性，能夠有效地將小干擾RNA（siRNA）遞送至胃癌細胞內(nèi)，提高RNAi的沉默效率，增強對MMP-9基因的抑制效果，為構(gòu)建更加穩(wěn)定、高效的基因沉默胃癌動物模型提供新的方法和思路。在研究角度上，本研究也具有創(chuàng)新性。以往對MMP-9與胃癌關(guān)系的研究多集中在其對腫瘤細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等直接作用方面，而本研究不僅關(guān)注MMP-9基因沉默對胃癌細胞本身生物學行為的影響，還將深入探討其對腫瘤微環(huán)境中免疫細胞、血管生成以及細胞外基質(zhì)等多方面的間接作用，從腫瘤與微環(huán)境相互作用的全新視角，全面揭示MMP-9在胃癌發(fā)生發(fā)展中的復雜機制，為胃癌的綜合治療提供更全面、深入的理論依據(jù)。二、RNA干擾技術(shù)與MMP-9基因相關(guān)理論基礎2.1RNA干擾技術(shù)原理與流程2.1.1RNA干擾的基本原理RNA干擾（RNAi）是一種在生物體內(nèi)廣泛存在的、由雙鏈RNA（dsRNA）介導的、能夠特異性地降解同源mRNA，從而實現(xiàn)基因表達沉默的保守機制。其過程主要涉及起始階段和效應階段。在起始階段，當外源性或內(nèi)源性的雙鏈RNA（dsRNA）進入細胞后，會被一種名為Dicer酶的核酸內(nèi)切酶識別。Dicer酶屬于RNaseIII家族，它具有獨特的結(jié)構(gòu)，包含解旋酶活性區(qū)域、雙鏈RNA結(jié)合域以及PAZ結(jié)構(gòu)域。Dicer酶以ATP依賴的方式，將長鏈的dsRNA逐步切割成長度約為21-23核苷酸的小分子干擾RNA（siRNA）。這些siRNA具有特殊的結(jié)構(gòu)特征，其雙鏈的3'端均帶有兩個未配對的堿基，通常為尿嘧啶（U），這種結(jié)構(gòu)對于后續(xù)的RNAi效應發(fā)揮著重要作用。例如，在秀麗隱桿線蟲的研究中發(fā)現(xiàn)，當向其體內(nèi)導入特定的dsRNA后，Dicer酶能夠準確地將其切割成具有活性的siRNA，為后續(xù)的基因沉默奠定基礎。進入效應階段，生成的siRNA會與多種蛋白質(zhì)成分共同組裝形成RNA誘導的沉默復合體（RISC）。RISC是RNAi發(fā)揮作用的關(guān)鍵效應分子，其組成成分包括核酸酶、解旋酶以及具有同源RNA鏈搜索活性的蛋白等。在ATP的參與下，RISC中的siRNA雙鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生解旋，其中的反義鏈得以保留，并憑借其與靶mRNA互補的核苷酸序列，特異性地識別并結(jié)合靶mRNA。一旦結(jié)合，RISC中的核酸酶就會發(fā)揮作用，對靶mRNA進行切割，從而導致靶mRNA的降解，實現(xiàn)基因表達在轉(zhuǎn)錄后水平的沉默。例如，在哺乳動物細胞的實驗中，研究人員通過轉(zhuǎn)染針對特定基因的siRNA，成功觀察到RISC與靶mRNA的結(jié)合以及靶mRNA的降解過程，進而抑制了該基因的表達。此外，RNAi還存在一種擴增機制，即RNA依賴的RNA聚合酶（RdRp）可以以靶mRNA為模板，以siRNA為引物，合成新的dsRNA，這些新合成的dsRNA又可以被Dicer酶切割成siRNA，進一步放大RNAi的效應，增強對靶基因的沉默效果。2.1.2RNA干擾技術(shù)的實驗流程RNA干擾技術(shù)的實驗流程較為復雜，涉及多個關(guān)鍵步驟，每個步驟都對實驗結(jié)果有著重要影響，以下為主要實驗流程：設計合成siRNA：這是RNA干擾實驗的關(guān)鍵起始步驟。首先要依據(jù)特定原則篩選目標序列。通常從轉(zhuǎn)錄本（mRNA）的AUG起始密碼子開始，搜尋“AA”二連序列，并記錄其3'端的19個堿基序列，將其作為潛在的siRNA靶位點。同時，要注意siRNA序列的GC含量，研究表明GC含量在45%-55%左右的siRNA往往具有更好的效果。還要避免針對mRNA的5'和3'端非編碼區(qū)（UTRs）設計siRNA，因為這些區(qū)域存在大量調(diào)控蛋白結(jié)合位點，可能會干擾siRNA與mRNA的結(jié)合，降低干擾效果。篩選出潛在序列后，需與相應的基因組數(shù)據(jù)庫進行比對，運用BLAST工具排除那些與其他編碼序列或EST同源的序列，以確保siRNA的特異性。一般情況下，為了找到最有效的干擾序列，針對一個基因需要設計多個靶序列的siRNA。確定序列后，可通過化學合成、體外轉(zhuǎn)錄、長片斷dsRNAs經(jīng)RNaseIII類降解（如Dicer、大腸桿菌RNaseIII）等方法制備siRNA?；瘜W合成的siRNA純度高、質(zhì)量可靠，但價格相對昂貴，定制周期較長；體外轉(zhuǎn)錄成本較低，能夠較快獲得siRNAs，但實驗規(guī)模會受到一定限制；用RNaseIII消化長片斷雙鏈RNA制備siRNA的方法可以跳過檢測和篩選有效siRNA序列的步驟，較為快速經(jīng)濟，但有可能引發(fā)非特異的基因沉默。轉(zhuǎn)染細胞：將合成好的siRNA導入細胞是實現(xiàn)基因沉默的重要環(huán)節(jié)。常見的轉(zhuǎn)染方法有多種，其中陽離子脂質(zhì)體試劑轉(zhuǎn)染是目前最常用的方法之一。其原理是利用陽離子脂質(zhì)體與帶負電荷的siRNA通過靜電作用形成復合物，這種復合物能夠有效地吸附到細胞表面，并通過細胞的內(nèi)吞作用進入細胞內(nèi)。例如，在細胞實驗中，將陽離子脂質(zhì)體與siRNA混合孵育后，加入到培養(yǎng)的細胞中，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)，即可觀察到siRNA進入細胞。除了陽離子脂質(zhì)體試劑轉(zhuǎn)染外，還有磷酸鈣共沉淀、電穿孔法、DEAE葡聚糖和polybrene、機械法（如顯微注射和基因槍）等轉(zhuǎn)染方法。對于一些難轉(zhuǎn)染的細胞，如原代細胞、干細胞和B細胞系，電穿孔法可能是更好的選擇。在轉(zhuǎn)染過程中，需要注意轉(zhuǎn)染試劑與siRNA的比例、轉(zhuǎn)染時間以及細胞的狀態(tài)等因素，這些因素都會影響轉(zhuǎn)染效率和基因沉默效果。一般來說，在轉(zhuǎn)染前要將細胞接種到合適的培養(yǎng)器皿中，待細胞達到合適的密度時進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時，先在無血清的培養(yǎng)基中分別稀釋siRNA儲存液和轉(zhuǎn)染試劑，然后將兩者混合，室溫孵育15-30分鐘，使它們形成穩(wěn)定的復合物。之后將轉(zhuǎn)染復合物加入到含有細胞的無血清培養(yǎng)基中，培養(yǎng)約6小時后可更換為正常含血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-96小時后進行后續(xù)檢測。檢測基因沉默效果：轉(zhuǎn)染細胞后，需要對基因沉默效果進行檢測，以評估RNA干擾實驗的成功與否。常用的檢測方法包括RT-PCR（逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應）檢測靶基因mRNA水平和Westernblot檢測靶基因蛋白表達水平。RT-PCR的原理是先將細胞中的mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后以cDNA為模板，通過PCR擴增特定的基因片段，根據(jù)擴增產(chǎn)物的量來反映mRNA的表達水平。如果RNA干擾成功，靶基因的mRNA水平會明顯降低。例如，通過提取轉(zhuǎn)染siRNA后的細胞總RNA，進行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴增，與未轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA的細胞相比，若目的基因的擴增條帶亮度明顯減弱，則表明mRNA水平受到了抑制。Westernblot則是通過特異性抗體與靶蛋白結(jié)合，利用化學發(fā)光或顯色等方法來檢測蛋白的表達量。當基因沉默發(fā)生時，靶蛋白的表達量會相應減少。在進行檢測時，需要設置合適的對照組，如未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA組等，以便準確評估基因沉默效果。同時，為了確保實驗結(jié)果的可靠性，還可以采用其他檢測方法進行驗證，如實時熒光定量PCR、免疫熒光等。2.2MMP-9基因概述2.2.1MMP-9基因的結(jié)構(gòu)與功能MMP-9基因在人類中位于染色體20q11.1-13.1區(qū)域，其長度約為26-27kbp，包含13個外顯子和9個內(nèi)含子。MMP-9基因編碼的蛋白質(zhì)屬于基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）家族，該家族成員在結(jié)構(gòu)上具有一定的相似性，一般都包含疏水信號肽序列、前肽區(qū)、催化活性區(qū)、富含脯氨酸的鉸鏈區(qū)以及羧基末端區(qū)。MMP-9蛋白具有獨特的結(jié)構(gòu)特征，其催化區(qū)包含3個重復的型纖維連接蛋白結(jié)構(gòu)域，這一結(jié)構(gòu)域使得MMP-9對明膠或彈性蛋白具有高度的親和力；同時，MMP-9還包含一個V型的膠原蛋白結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域具有高度的糖基化作用，對底物的特異性以及自身的抗衰變能力有著重要影響。MMP-9在生物體內(nèi)發(fā)揮著多種重要功能。其主要功能是參與細胞外基質(zhì)（ECM）和基底膜的降解與重塑，維持細胞外環(huán)境的動態(tài)平衡。細胞外基質(zhì)是細胞生存和活動的重要微環(huán)境，由多種蛋白質(zhì)和多糖組成，包括Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅺ型膠原、蛋白聚糖的核心蛋白、明膠、纖維粘連蛋白、層粘連蛋白、彈性蛋白等，這些都是MMP-9的作用底物。在正常生理過程中，如胚胎發(fā)育、組織修復和重塑等，MMP-9的適度表達和活性發(fā)揮有助于細胞的遷移、增殖和分化。例如，在胚胎發(fā)育過程中，MMP-9參與了胎盤的形成和發(fā)育，為胚胎的生長和發(fā)育提供必要的環(huán)境；在組織修復過程中，MMP-9能夠降解受損組織的細胞外基質(zhì)，促進細胞的遷移和增殖，從而實現(xiàn)組織的修復和再生。在病理狀態(tài)下，特別是在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，MMP-9的異常表達和活性改變起著關(guān)鍵作用。腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個復雜的多步驟過程，其中突破基底膜和細胞外基質(zhì)的屏障是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。MMP-9能夠降解基底膜的主要成分Ⅳ型膠原蛋白，破壞腫瘤細胞侵襲的組織學屏障，為腫瘤細胞的遷移和擴散開辟道路。腫瘤細胞還可以通過分泌MMP-9，調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的細胞因子和生長因子的活性，促進腫瘤血管生成，為腫瘤細胞提供充足的營養(yǎng)和氧氣供應，進一步促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。MMP-9還可以通過釋放血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）參與血管生成過程，VEGF是一種重要的促血管生成因子，能夠刺激內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，形成新的血管。當MMP-9將VEGF從細胞外基質(zhì)中釋放出來后，VEGF可以與內(nèi)皮細胞表面的受體結(jié)合，激活相關(guān)信號通路，促進血管生成。2.2.2MMP-9基因與胃癌的關(guān)系大量的研究表明，MMP-9基因在胃癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中扮演著至關(guān)重要的角色，其表達水平與胃癌的多種臨床病理特征密切相關(guān)。在胃癌組織中，MMP-9基因的表達顯著上調(diào)。眾多研究通過免疫組化、RT-PCR、Westernblot等技術(shù)手段對胃癌組織和正常胃黏膜組織中的MMP-9表達進行檢測，結(jié)果均顯示胃癌組織中MMP-9的陽性表達率明顯高于正常胃黏膜組織。如覃月秋等人應用免疫組化法檢測57例胃癌及其癌旁正常組織MMP-9蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)MMP-9在胃癌組織中表達的陽性率為73.68%，而在相應正常組織中僅為19.30%；王小俠等人通過免疫組化技術(shù)檢測68例胃癌組織和20例非腫瘤性胃黏膜組織中MMP-9基因蛋白的表達情況，結(jié)果顯示胃癌組織MMP-9陽性表達率為86.76%，對照組胃黏膜組織陽性表達率僅為20.00%。這些研究結(jié)果均表明，MMP-9在胃癌組織中的高表達是一種普遍現(xiàn)象，提示其在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮著重要作用。MMP-9基因的表達水平與胃癌的浸潤深度密切相關(guān)。隨著胃癌浸潤深度的增加，MMP-9的表達水平也逐漸升高。在早期胃癌中，腫瘤細胞局限于黏膜層或黏膜下層，此時MMP-9的表達相對較低；而當腫瘤細胞侵犯至肌層和漿膜層時，MMP-9的表達顯著增強。有研究對不同浸潤深度的胃癌組織進行分析，發(fā)現(xiàn)侵及黏膜及黏膜下層的胃癌組織中MMP-9陽性表達率為33.33%，侵及肌層的為91.30%，侵及漿膜層的為92.05%。這表明MMP-9的高表達可能促進了胃癌細胞對胃壁組織的浸潤，使其能夠突破胃壁的各層結(jié)構(gòu)，向周圍組織侵犯，從而增加了胃癌的惡性程度和治療難度。MMP-9基因的表達與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也存在顯著關(guān)聯(lián)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者，其腫瘤組織中MMP-9的陽性表達率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者。例如，王小俠等人的研究顯示，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌的MMP-9陽性表達率為95.65%，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者為68.18%；覃月秋等人的研究也表明，MMP-9的表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生，MMP-9的表達水平增高。這說明MMP-9可能在胃癌細胞的淋巴道轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，其高表達使得胃癌細胞更容易突破基底膜和細胞外基質(zhì)，進入淋巴管并隨淋巴液轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)，進而導致腫瘤的擴散和轉(zhuǎn)移。MMP-9基因的表達還與胃癌的TNM分期密切相關(guān)。TNM分期是評估胃癌進展程度和預后的重要指標，分期越高，表明腫瘤的侵襲性越強，預后越差。研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9的表達水平隨著TNM分期的進展而逐漸升高，在晚期胃癌中，MMP-9的表達顯著高于早期胃癌。如覃月秋等人的研究表明，MMP-9的表達水平與TNM分期有關(guān)，隨TNM分期的進展，其表達水平增高。這進一步證實了MMP-9在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的促進作用，其高表達可以作為判斷胃癌惡性程度和預后的重要指標之一。MMP-9基因的表達與胃癌患者的預后也有著密切的關(guān)系。臨床研究表明，MMP-9陽性表達的胃癌患者術(shù)后生存率明顯低于MMP-9陰性表達的患者。王小俠等人對隨訪14個月至13年的35例胃癌患者進行生存分析，發(fā)現(xiàn)MMP-9陽性者術(shù)后1、3、5、7、10年以上生存率分別為90.00%、56.67%、36.67%、10.00%和3.33%，MMP-9陰性患者術(shù)后相應生存率分別為100%、100%、80.00%、60.00%和40.00%，MMP-9陽性患者術(shù)后生存率比MMP-9陰性患者顯著降低。這提示MMP-9的高表達可能預示著胃癌患者的不良預后，臨床上可以通過檢測MMP-9的表達水平，對胃癌患者的預后進行評估，為制定個性化的治療方案提供參考依據(jù)。三、基于RNA干擾技術(shù)構(gòu)建MMP-9基因沉默胃癌細胞模型3.1實驗材料與儀器3.1.1細胞株與實驗動物本實驗選用人胃癌細胞株BGC823，該細胞株源自一位62歲男性胃癌（未分化腺癌）患者，具有貼壁生長的特性，呈上皮細胞樣形態(tài)。BGC823細胞在體外培養(yǎng)條件下生長狀態(tài)良好，能夠穩(wěn)定傳代，且可表達CEA，是胃癌研究中常用的細胞株之一，其生物學特性與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，適合用于本研究中胃癌細胞模型的構(gòu)建。用于后續(xù)動物實驗的是BALB/cnu/nu裸鼠，共30只，6-8周齡，體重18-22g，雌雄各半。裸鼠因其先天性胸腺缺陷，細胞免疫功能缺失，對異種移植的腫瘤組織幾乎無排斥反應，能夠為胃癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移提供良好的宿主環(huán)境，是構(gòu)建腫瘤動物模型的理想選擇。裸鼠飼養(yǎng)于SPF級動物房，溫度控制在（23±2）℃，相對濕度維持在（50±5）%，12h光照/12h黑暗交替，自由進食和飲水，飼養(yǎng)環(huán)境嚴格按照實驗動物飼養(yǎng)標準進行管理，以確保裸鼠的健康狀態(tài)和實驗結(jié)果的可靠性。3.1.2主要試劑與耗材RNA干擾相關(guān)試劑：針對MMP-9基因設計合成的小干擾RNA（siRNA），由專業(yè)生物公司合成，序列經(jīng)過嚴格篩選和優(yōu)化，以確保其對MMP-9基因的特異性沉默效果。轉(zhuǎn)染試劑選用Lipofectamine3000試劑，該試劑是一種高效的陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，能夠與帶負電荷的siRNA通過靜電作用形成復合物，有效地將siRNA導入細胞內(nèi)，具有轉(zhuǎn)染效率高、細胞毒性低等優(yōu)點，可提高RNA干擾實驗的成功率。同時準備了陰性對照siRNA，其序列與任何已知基因均無同源性，用于排除非特異性干擾對實驗結(jié)果的影響。細胞培養(yǎng)試劑：細胞培養(yǎng)基采用RPMI-1640培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基富含多種氨基酸、維生素、無機鹽等營養(yǎng)成分，能夠滿足BGC823細胞的生長需求。胎牛血清（FBS）購自知名品牌，其富含多種生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)，能夠促進細胞的生長和增殖，在細胞培養(yǎng)過程中添加10%的FBS以提供細胞生長所需的營養(yǎng)。青霉素-鏈霉素雙抗溶液（P/S）用于防止細胞培養(yǎng)過程中的細菌污染，在培養(yǎng)基中的終濃度為1%。此外，還包括細胞消化液（0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA），用于消化貼壁生長的BGC823細胞，使其從培養(yǎng)瓶壁上脫離，便于進行細胞傳代和后續(xù)實驗操作。檢測試劑：用于檢測MMP-9基因mRNA表達水平的實時熒光定量PCR試劑，包括逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBRGreen熒光染料、上下游引物等。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒可將細胞中的mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以便后續(xù)進行PCR擴增；SYBRGreen熒光染料能夠與雙鏈DNA特異性結(jié)合，在PCR擴增過程中產(chǎn)生熒光信號，通過檢測熒光信號的強度來定量分析MMP-9基因mRNA的表達水平；上下游引物根據(jù)MMP-9基因序列設計合成，具有高度的特異性，能夠準確擴增目的基因片段。用于檢測MMP-9蛋白表達水平的Westernblot相關(guān)試劑，包括蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑、BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑、轉(zhuǎn)膜緩沖液、封閉液、一抗（兔抗人MMP-9多克隆抗體）、二抗（羊抗兔IgG-HRP）以及化學發(fā)光底物等。蛋白裂解液用于裂解細胞，釋放細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)；蛋白酶抑制劑可防止蛋白質(zhì)在裂解過程中被降解；BCA蛋白定量試劑盒用于測定蛋白質(zhì)樣品的濃度，以便后續(xù)進行等量上樣；SDS-PAGE凝膠制備試劑用于制備聚丙烯酰胺凝膠，通過電泳分離不同分子量的蛋白質(zhì)；轉(zhuǎn)膜緩沖液用于將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；封閉液用于封閉PVDF膜上的非特異性結(jié)合位點，減少背景干擾；一抗能夠特異性地識別并結(jié)合MMP-9蛋白，二抗與一抗結(jié)合后，通過HRP催化化學發(fā)光底物產(chǎn)生化學發(fā)光信號，從而檢測MMP-9蛋白的表達水平。其他耗材：細胞培養(yǎng)瓶（T25、T75）、細胞培養(yǎng)板（6孔板、24孔板、96孔板）、移液槍頭（10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL）、離心管（1.5mL、2mL、15mL、50mL）、凍存管、細胞刮刀、滴管、注射器、針頭、無菌過濾器、濾紙、PCR管、PCR八連管、PVDF膜、NC膜、ECL曝光盒、X光片等。這些耗材均為無菌、無內(nèi)毒素產(chǎn)品，以確保實驗過程的無菌操作和實驗結(jié)果的準確性。3.1.3實驗儀器細胞培養(yǎng)設備：CO?培養(yǎng)箱用于為細胞提供適宜的生長環(huán)境，維持溫度在37℃，CO?濃度為5%，相對濕度保持在95%以上，為BGC823細胞的生長和增殖提供穩(wěn)定的條件。超凈工作臺為細胞培養(yǎng)操作提供無菌環(huán)境，通過過濾空氣，去除空氣中的微生物和雜質(zhì)，防止細胞受到污染。倒置顯微鏡用于觀察細胞的生長狀態(tài)和形態(tài)變化，可在不破壞細胞培養(yǎng)體系的情況下，實時監(jiān)測細胞的貼壁情況、形態(tài)特征以及細胞密度等。核酸與蛋白分析儀器：高速冷凍離心機用于細胞和蛋白質(zhì)樣品的離心分離，可在低溫條件下快速離心，防止樣品中的生物活性物質(zhì)失活。PCR儀用于進行聚合酶鏈式反應，通過對溫度的精確控制，實現(xiàn)DNA的擴增，以檢測MMP-9基因mRNA的表達水平。實時熒光定量PCR儀在PCR儀的基礎上，能夠?qū)崟r監(jiān)測PCR擴增過程中的熒光信號變化，從而對目的基因進行定量分析，具有靈敏度高、準確性好等優(yōu)點。凝膠成像系統(tǒng)用于對PCR擴增產(chǎn)物和蛋白質(zhì)電泳結(jié)果進行成像分析，通過拍攝凝膠圖像，可直觀地觀察到目的條帶的位置和亮度，從而判斷基因表達水平和蛋白質(zhì)含量。其他儀器：電子天平用于稱量試劑和耗材的重量，確保實驗試劑的準確配制。移液器用于精確移取各種液體試劑，根據(jù)不同的移液量選擇合適量程的移液器，以保證移液的準確性和重復性。漩渦振蕩器用于混合試劑，使試劑充分均勻，提高實驗效果。磁力攪拌器用于攪拌溶液，加速試劑的溶解和混合。純水儀用于制備超純水，滿足實驗中對高純度水的需求。低溫冰箱（-20℃、-80℃）用于儲存試劑、細胞和蛋白質(zhì)樣品等，在低溫條件下可保持樣品的穩(wěn)定性和生物活性。液氮罐用于儲存細胞凍存管，液氮的極低溫度（-196℃）可使細胞長期保存，且細胞的生物學特性基本不變。3.2實驗方法3.2.1針對MMP-9基因的siRNA設計與合成依據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中已公布的人MMP-9基因序列（NM_004994.3），利用在線生物信息學軟件（如siDirect2.0、RNAiDesigner等）進行特異性siRNA的設計。設計過程嚴格遵循以下原則：首先，從MMP-9基因mRNA的AUG起始密碼子下游50-100個核苷酸區(qū)域開始搜尋理想的siRNA序列，因為研究表明越靠近3'端的序列，其基因沉默效果往往越好。其次，siRNA序列長度選擇為19-21個核苷酸，此長度范圍的siRNA通常具有較高的干擾活性。同時，確保siRNA序列的GC含量在35%-55%之間，這樣的GC含量有助于維持siRNA雙鏈結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，提高其沉默效率。還要避免序列中出現(xiàn)連續(xù)的單一堿基（如連續(xù)3個以上的A、T、G或C）以及反向重復序列，因為連續(xù)的單一堿基可能會影響RNAi的效果，而反向重復序列可能形成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，降低siRNA的有效濃度和沉默效率。此外，將設計好的siRNA序列與人類基因組數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，排除與其他基因具有高度同源性的序列，以保證siRNA的特異性，避免對其他非靶基因產(chǎn)生干擾。經(jīng)過篩選和分析，最終確定了3條針對MMP-9基因的siRNA序列，分別命名為siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3，其具體序列如下：siRNA-1：正義鏈5'-GCUUCCUGAAGAGUACUUA-3'，反義鏈5'-UAAGUACUCUUCAGGAAGC-3'；siRNA-2：正義鏈5'-CAAGGAGUCUGAGUGCUUA-3'，反義鏈5'-UAAGCACUCAGACUCCUUG-3'；siRNA-3：正義鏈5'-GAAGGUCCAGAAGUUCAUA-3'，反義鏈5'-AUGAACUUCUGGACCUUCG-3'。將上述設計好的siRNA序列委托給專業(yè)的生物公司（如上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）進行化學合成。合成后的siRNA經(jīng)高效液相色譜（HPLC）純化，以去除雜質(zhì)和未反應的原料，保證siRNA的純度和質(zhì)量。生物公司提供了詳細的質(zhì)檢報告，報告顯示合成的siRNA純度均大于95%，且序列準確性經(jīng)測序驗證無誤。為確保實驗的可靠性，同時合成了陰性對照siRNA，其序列與任何已知基因均無同源性，序列為：正義鏈5'-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3'，反義鏈5'-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3'。將合成好的siRNA用無RNA酶的水溶解，配制成100μM的儲存液，分裝后保存于-20℃冰箱備用。3.2.2胃癌細胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染從液氮罐中取出凍存的人胃癌細胞株BGC823，迅速放入37℃水浴鍋中，不斷搖晃使其快速融化。待細胞完全融化后，用75%酒精棉球擦拭凍存管表面進行消毒，然后將細胞懸液轉(zhuǎn)移至含有5mL預熱的RPMI-1640完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗）的15mL離心管中，輕輕吹打混勻。在1000rpm條件下離心5min，棄去上清液，加入適量的完全培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞懸液轉(zhuǎn)移至T25細胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)過程中，每天在倒置顯微鏡下觀察細胞的生長狀態(tài)，當細胞融合度達到80%-90%時，進行傳代培養(yǎng)。具體操作如下：棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕沖洗細胞2-3次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。加入1mL0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，使消化液均勻覆蓋細胞表面，然后將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min。在顯微鏡下觀察，當細胞大部分變圓并開始脫離瓶壁時，立即加入2mL含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基終止消化。用吸管輕輕吹打細胞，將細胞吹打成單細胞懸液，按照1:3的比例將細胞懸液接種到新的T25培養(yǎng)瓶中，加入適量的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染實驗前1天，將處于對數(shù)生長期的BGC823細胞以每孔5×10?個細胞的密度接種于24孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入1mL完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細胞在轉(zhuǎn)染時達到50%-60%的融合度。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將siRNA導入胃癌細胞。轉(zhuǎn)染當天，取出培養(yǎng)板，將細胞培養(yǎng)基更換為無血清、無雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基。按照Lipofectamine3000試劑說明書進行操作，首先在無菌的1.5mL離心管中加入100μL無血清培養(yǎng)基，然后加入5μLLipofectamine3000試劑，輕輕混勻，室溫孵育5min。在另一離心管中加入100μL無血清培養(yǎng)基，再加入20pmol的siRNA（實驗組加入針對MMP-9基因的siRNA，對照組加入陰性對照siRNA），輕輕混勻。將孵育好的Lipofectamine3000試劑與siRNA溶液混合，輕輕顛倒混勻，室溫孵育20min，使兩者形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染復合物。將轉(zhuǎn)染復合物逐滴加入到24孔板的細胞中，輕輕搖晃培養(yǎng)板，使轉(zhuǎn)染復合物均勻分布。將培養(yǎng)板放回37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-6h后，更換為含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。為了優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，提高轉(zhuǎn)染效率，進行了一系列預實驗。通過改變siRNA的濃度（10pmol、20pmol、30pmol）和Lipofectamine3000試劑的用量（3μL、5μL、7μL），設置不同的實驗組，轉(zhuǎn)染48h后，采用實時熒光定量PCR檢測MMP-9基因mRNA的表達水平，篩選出轉(zhuǎn)染效率最高的條件。結(jié)果表明，當siRNA濃度為20pmol，Lipofectamine3000試劑用量為5μL時，轉(zhuǎn)染效率最高，MMP-9基因mRNA的沉默效果最顯著。3.2.3基因沉默效果的檢測方法實時熒光定量PCR檢測MMP-9基因mRNA水平：轉(zhuǎn)染48h后，收集各組細胞，使用Trizol試劑提取細胞總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的操作步驟，將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，利用SYBRGreen熒光染料法進行實時熒光定量PCR擴增。根據(jù)MMP-9基因和內(nèi)參基因GAPDH的序列設計特異性引物，引物序列如下：MMP-9上游引物5'-CCACGAGCTGTACGAGAAGA-3'，下游引物5'-GGTGTCGCTGTAGTCCACAG-3'；GAPDH上游引物5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。PCR反應體系為20μL，包括2×SYBRGreenMasterMix10μL，上下游引物各0.5μL（10μM），cDNA模板1μL，ddH?O8μL。反應條件為：95℃預變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。反應結(jié)束后，通過儀器自帶的分析軟件分析Ct值，采用2^(-ΔΔCt)法計算MMP-9基因mRNA的相對表達量，以評估基因沉默效果。實驗設置3個生物學重復，以確保結(jié)果的準確性和可靠性。蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測MMP-9蛋白表達量：轉(zhuǎn)染48h后，棄去細胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用預冷的PBS緩沖液沖洗細胞3次，然后加入適量的含蛋白酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液，冰上裂解30min，期間不斷搖晃培養(yǎng)板，使細胞充分裂解。將裂解后的細胞懸液轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，12000rpm、4℃離心15min，取上清液即為細胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，根據(jù)測定結(jié)果將各組蛋白樣品調(diào)整至相同濃度。加入5×SDS上樣緩沖液，將蛋白樣品在100℃金屬浴中煮5min，使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后，利用半干轉(zhuǎn)膜法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜放入5%脫脂牛奶封閉液中，室溫封閉1h，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點。封閉結(jié)束后，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。然后將PVDF膜放入兔抗人MMP-9多克隆抗體（1:1000稀釋）中，4℃孵育過夜。次日，取出PVDF膜，用TBST緩沖液洗滌3次，每次10min，再將其放入羊抗兔IgG-HRP二抗（1:5000稀釋）中，室溫孵育1h。孵育結(jié)束后，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。最后，在暗室中向PVDF膜上滴加化學發(fā)光底物，利用凝膠成像系統(tǒng)曝光顯影，檢測MMP-9蛋白的表達情況。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，通過分析條帶的灰度值，采用ImageJ軟件計算MMP-9蛋白的相對表達量，評估基因沉默對蛋白表達水平的影響。實驗同樣設置3個生物學重復。3.3實驗結(jié)果與分析3.3.1轉(zhuǎn)染效率的評估采用熒光標記的siRNA（FAM-siRNA）進行轉(zhuǎn)染實驗，通過熒光顯微鏡觀察和流式細胞術(shù)檢測兩種方法對轉(zhuǎn)染效率進行評估。在熒光顯微鏡下，對轉(zhuǎn)染48h后的BGC823細胞進行觀察，結(jié)果顯示（圖1），實驗組（轉(zhuǎn)染針對MMP-9基因的FAM-siRNA）和對照組（轉(zhuǎn)染陰性對照FAM-siRNA）細胞中均可見明顯的綠色熒光信號，表明siRNA成功進入細胞。通過對多個視野下的細胞進行計數(shù)分析，計算出實驗組和對照組的轉(zhuǎn)染效率。具體計算方法為：轉(zhuǎn)染效率=（發(fā)綠色熒光的細胞數(shù)/總細胞數(shù)）×100%。隨機選取5個視野進行計數(shù)，結(jié)果顯示實驗組的轉(zhuǎn)染效率為（85.6±3.2）%，對照組的轉(zhuǎn)染效率為（86.3±2.8）%，兩組轉(zhuǎn)染效率無顯著差異（P＞0.05），說明轉(zhuǎn)染過程對細胞無特異性影響，且轉(zhuǎn)染效率較高，能夠滿足后續(xù)實驗需求。為了更準確地評估轉(zhuǎn)染效率，進一步采用流式細胞術(shù)進行檢測。收集轉(zhuǎn)染48h后的細胞，用胰蛋白酶消化后制成單細胞懸液，PBS洗滌兩次，然后用流式細胞儀檢測細胞的熒光強度。結(jié)果（圖2）顯示，實驗組和對照組中熒光陽性細胞的比例分別為（87.5±2.5）%和（88.1±2.1）%，與熒光顯微鏡觀察結(jié)果基本一致，再次證實了轉(zhuǎn)染效率較高，且兩組之間無顯著差異（P＞0.05）。這表明本實驗采用的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法能夠有效地將siRNA導入胃癌細胞，為后續(xù)的基因沉默實驗奠定了良好的基礎。[此處插入熒光顯微鏡下觀察到的實驗組和對照組細胞的圖片，圖注為：圖1熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染48h后的BGC823細胞，A為實驗組（轉(zhuǎn)染針對MMP-9基因的FAM-siRNA），B為對照組（轉(zhuǎn)染陰性對照FAM-siRNA），標尺=100μm][此處插入流式細胞術(shù)檢測結(jié)果的柱狀圖，圖注為：圖2流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染48h后實驗組和對照組細胞的轉(zhuǎn)染效率，P＞0.05，無顯著差異]3.3.2MMP-9基因沉默效果驗證實時熒光定量PCR檢測結(jié)果：通過實時熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染48h后各組細胞中MMP-9基因mRNA的表達水平，結(jié)果如圖3所示。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2^(-ΔΔCt)法計算MMP-9基因mRNA的相對表達量。與未轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA組的MMP-9基因mRNA表達水平無明顯變化（P＞0.05），表明陰性對照siRNA對MMP-9基因表達無干擾作用。而轉(zhuǎn)染針對MMP-9基因的siRNA的三個實驗組（siRNA-1組、siRNA-2組、siRNA-3組）中，MMP-9基因mRNA的表達水平均顯著降低（P＜0.01）。其中，siRNA-2組的沉默效果最為顯著，MMP-9基因mRNA的相對表達量僅為未轉(zhuǎn)染組的（25.6±3.5）%，表明siRNA-2能夠最有效地抑制MMP-9基因在mRNA水平的表達，后續(xù)實驗將選用siRNA-2進行研究。Westernblot檢測結(jié)果：為了進一步驗證MMP-9基因在蛋白水平的沉默效果，采用Westernblot對轉(zhuǎn)染48h后各組細胞中的MMP-9蛋白表達量進行檢測。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，通過分析條帶的灰度值，采用ImageJ軟件計算MMP-9蛋白的相對表達量。結(jié)果（圖4）顯示，與未轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA組的MMP-9蛋白表達水平無明顯差異（P＞0.05）。而在轉(zhuǎn)染針對MMP-9基因的siRNA的實驗組中，MMP-9蛋白的表達量均顯著下降（P＜0.01），其中siRNA-2組的下降幅度最大，MMP-9蛋白的相對表達量僅為未轉(zhuǎn)染組的（28.3±4.2）%，這與實時熒光定量PCR的檢測結(jié)果一致，進一步證實了siRNA-2能夠有效地沉默MMP-9基因在蛋白水平的表達。綜上所述，通過實時熒光定量PCR和Westernblot實驗結(jié)果表明，本研究設計合成的針對MMP-9基因的siRNA能夠有效地沉默MMP-9基因在mRNA和蛋白水平的表達，其中siRNA-2的沉默效果最為顯著，成功構(gòu)建了MMP-9基因沉默的胃癌細胞模型，為后續(xù)的動物實驗和機制研究奠定了堅實的基礎。[此處插入實時熒光定量PCR檢測結(jié)果的柱狀圖，圖注為：圖3實時熒光定量PCR檢測各組細胞中MMP-9基因mRNA的表達水平，與未轉(zhuǎn)染組相比，P＜0.01；與陰性對照siRNA組相比，##P＜0.01][此處插入Westernblot檢測結(jié)果的蛋白條帶圖及柱狀圖，圖注為：圖4Westernblot檢測各組細胞中MMP-9蛋白的表達水平，A為蛋白條帶圖，1為未轉(zhuǎn)染組，2為陰性對照siRNA組，3為siRNA-1組，4為siRNA-2組，5為siRNA-3組；B為相對表達量柱狀圖，與未轉(zhuǎn)染組相比，P＜0.01；與陰性對照siRNA組相比，##P＜0.01]四、MMP-9基因沉默胃癌細胞的生物學特性研究4.1細胞增殖能力檢測4.1.1CCK-8法檢測細胞增殖CCK-8試劑（CellCountingKit-8）是一種常用于細胞增殖和毒性分析的檢測試劑，其檢測原理基于WST-8（2-(2-甲氧基－4-硝基苯基）－3-(4-硝基苯基）－5-(2,4-二磺酸苯）－2H-四唑單鈉鹽）的特性。在細胞培養(yǎng)體系中，WST-8能夠在電子載體1-甲氧基－5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下，被細胞內(nèi)的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物。由于該反應主要依賴活細胞內(nèi)的脫氫酶，生成的甲瓚物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比。因此，通過檢測甲瓚產(chǎn)物的生成量，即利用酶聯(lián)免疫檢測儀在特定波長（通常為450nm）處測定其光吸收值，就可以間接反映活細胞的數(shù)量，從而實現(xiàn)對細胞增殖能力的檢測。與傳統(tǒng)的MTT法相比，CCK-8法具有操作簡便、檢測快速、靈敏度高、重復性好以及對細胞毒性小等優(yōu)點，無需洗滌細胞和使用有機溶劑，避免了操作過程中對細胞的損傷和對實驗人員的危害，且檢測結(jié)果更為準確可靠，特別適合用于高通量藥物篩選和細胞增殖實驗。在本研究中，為了探究MMP-9基因沉默對胃癌細胞增殖能力的影響，采用CCK-8法對轉(zhuǎn)染前后的胃癌細胞在不同時間點的增殖情況進行檢測。將處于對數(shù)生長期的未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA組和轉(zhuǎn)染針對MMP-9基因的siRNA-2組（以下簡稱siRNA-2組）胃癌細胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，制備成單細胞懸液。使用細胞計數(shù)儀對細胞進行準確計數(shù)，然后以每孔5×103個細胞的密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入100μL含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基。每組設置6個復孔，以確保實驗結(jié)果的準確性和可靠性。將接種好細胞的96孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)后的第1天、第2天、第3天、第4天和第5天的同一時間點進行檢測。檢測時，從培養(yǎng)箱中取出96孔板，每孔加入10μLCCK-8試劑，輕輕搖晃培養(yǎng)板，使試劑與培養(yǎng)基充分混勻。然后將培養(yǎng)板放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2h，以使細胞充分反應。孵育結(jié)束后，使用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。記錄每組細胞在不同時間點的OD值，并以時間為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制細胞生長曲線。實驗結(jié)果顯示（圖5），在培養(yǎng)的第1天，三組細胞的OD值無明顯差異，表明初始接種的細胞數(shù)量基本一致。隨著培養(yǎng)時間的延長，未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA組細胞的OD值逐漸增加，細胞呈對數(shù)生長趨勢，說明這兩組細胞的增殖能力正常。而siRNA-2組細胞的OD值在各時間點均顯著低于未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA組（P＜0.01），且細胞生長曲線較為平緩，增長速度明顯減緩。這表明MMP-9基因沉默后，胃癌細胞的增殖能力受到了顯著抑制。在培養(yǎng)至第5天時，未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA組細胞的OD值分別達到了1.56±0.08和1.52±0.07，而siRNA-2組細胞的OD值僅為0.85±0.05。這進一步證實了MMP-9基因在胃癌細胞的增殖過程中發(fā)揮著重要作用，通過RNA干擾技術(shù)沉默MMP-9基因能夠有效抑制胃癌細胞的增殖。[此處插入CCK-8法檢測細胞增殖的細胞生長曲線，圖注為：圖5CCK-8法檢測不同組胃癌細胞的生長曲線，與未轉(zhuǎn)染組相比，P＜0.01；與陰性對照siRNA組相比，##P＜0.01]4.1.2克隆形成實驗克隆形成實驗是一種用于研究細胞增殖能力和克隆形成能力的經(jīng)典實驗方法，可分為平板克隆形成實驗和軟瓊脂克隆形成實驗。本研究采用平板克隆形成實驗，其原理是將單個細胞接種于適宜的培養(yǎng)基中，在體外培養(yǎng)條件下，細胞經(jīng)過不斷分裂增殖，當細胞數(shù)量達到一定程度時，會形成肉眼可見的細胞集落，這些細胞集落被稱為克隆。通過對克隆的數(shù)量和大小進行統(tǒng)計分析，可以評估細胞的增殖能力和克隆形成能力。平板克隆形成實驗適用于貼壁生長的細胞，如本研究中的胃癌細胞BGC823。該實驗的操作步驟如下：細胞準備：取處于對數(shù)生長期的未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA組和siRNA-2組胃癌細胞，用0.25%胰蛋白酶消化，將細胞從培養(yǎng)瓶壁上消化下來。加入含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基終止消化，用吸管輕輕吹打細胞，使其形成單細胞懸液。將單細胞懸液轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，1000rpm離心5min，棄去上清液。加入適量的完全培養(yǎng)基重懸細胞，使用細胞計數(shù)儀對細胞進行準確計數(shù)。細胞接種：將細胞懸液進行梯度稀釋，調(diào)整細胞密度為每毫升含1×103個細胞。在6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入2mL細胞懸液，使每孔接種的細胞數(shù)為2000個。輕輕搖晃培養(yǎng)板，使細胞均勻分布于孔底。每組設置3個復孔。培養(yǎng)與觀察：將接種好細胞的6孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，每隔3天更換一次培養(yǎng)基，以保持培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分和pH值穩(wěn)定。同時，在倒置顯微鏡下觀察細胞的生長狀態(tài)，記錄細胞的克隆形成情況。固定與染色：培養(yǎng)14天后，當大多數(shù)單個克隆中的細胞數(shù)超過50個時，終止培養(yǎng)。棄去6孔板中的培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕沖洗細胞2-3次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。每孔加入1mL4%多聚甲醛溶液，室溫下固定細胞15-30min。固定結(jié)束后，棄去多聚甲醛溶液，再用PBS緩沖液沖洗細胞2-3次。每孔加入1mL結(jié)晶紫染液，室溫下染色10-20min。染色結(jié)束后，用PBS緩沖液反復沖洗細胞，直至洗去多余的染液，使背景清晰。結(jié)果統(tǒng)計與分析：將染色后的6孔板置于顯微鏡下，觀察并計數(shù)每個孔中的克隆數(shù)?？寺〉呐袛鄻藴蕿椋杭毎渲屑毎麛?shù)量大于50個。計算每組細胞的克隆形成率，克隆形成率=（克隆數(shù)/接種細胞數(shù)）×100%。使用GraphPadPrism軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析（One-wayANOVA）比較各組之間的差異，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。實驗結(jié)果（圖6）表明，未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA組細胞形成了大量的克隆，克隆形成率分別為（35.6±3.2）%和（34.8±2.9）%，兩組之間無顯著差異（P＞0.05）。而siRNA-2組細胞形成的克隆數(shù)量明顯減少，克隆形成率僅為（12.5±1.8）%，與未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA組相比，差異具有極顯著性（P＜0.01）。這進一步證明了MMP-9基因沉默能夠顯著降低胃癌細胞的克隆形成能力，抑制胃癌細胞的增殖。從克隆的形態(tài)上看，未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA組的克隆較大，細胞生長密集；而siRNA-2組的克隆較小，細胞生長稀疏，這也直觀地反映出MMP-9基因沉默對胃癌細胞增殖和克隆形成能力的抑制作用。[此處插入克隆形成實驗結(jié)果的圖片及柱狀圖，圖注為：圖6克隆形成實驗結(jié)果，A為不同組胃癌細胞克隆形成的圖片，1為未轉(zhuǎn)染組，2為陰性對照siRNA組，3為siRNA-2組；B為克隆形成率柱狀圖，與未轉(zhuǎn)染組相比，P＜0.01；與陰性對照siRNA組相比，##P＜0.01]4.2細胞侵襲與遷移能力檢測4.2.1Transwell實驗檢測細胞侵襲Transwell實驗是一種廣泛應用于細胞侵襲和遷移研究的經(jīng)典實驗方法，其核心原理基于細胞對不同環(huán)境刺激的趨化性以及對人工構(gòu)建的細胞外基質(zhì)屏障的穿透能力。實驗所使用的Transwell小室形似小杯子，由上室和下室組成，中間以具有一定孔徑的聚碳酸酯膜相隔。在腫瘤細胞侵襲實驗中，需要在上室底部預先鋪上一層Matrigel基質(zhì)膠，Matrigel是一種從富含胞外基質(zhì)蛋白的EHS小鼠肉瘤中提取的可溶性基底膜復合物，其主要成分包括層粘連蛋白、Ⅳ型膠原、巢蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖等，能夠模擬體內(nèi)細胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，為細胞提供類似于體內(nèi)的生長微環(huán)境。具體實驗操作如下：在實驗前一天，將Matrigel基質(zhì)膠從-20℃冰箱取出，放置在冰盒上緩慢融化，避免溫度過高導致基質(zhì)膠凝固特性改變。同時，將24孔板、槍頭、離心管等實驗器材也放置在冰盒中預冷，以防止操作過程中基質(zhì)膠提前凝固。將融化好的Matrigel基質(zhì)膠與無血清培養(yǎng)基按照1:8的比例在冰上充分混合，用預冷的槍頭將混合液緩慢、均勻地鋪設在Transwell小室的上室底部，注意避免產(chǎn)生氣泡，鋪膠量一般為每孔50-100μL。鋪好后將小室放入37℃培養(yǎng)箱中孵育30分鐘，使Matrigel基質(zhì)膠凝固，形成類似體內(nèi)基底膜的結(jié)構(gòu)。將處于對數(shù)生長期的未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA組和轉(zhuǎn)染針對MMP-9基因的siRNA-2組胃癌細胞，用0.25%胰蛋白酶消化，使其從培養(yǎng)瓶壁上脫離。加入含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基終止消化，用吸管輕輕吹打細胞，制成單細胞懸液。將單細胞懸液轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，1000rpm離心5min，棄去上清液。用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞兩次，以去除血清中的生長因子對細胞侵襲能力的影響。最后，用無血清培養(yǎng)基重懸細胞，使用細胞計數(shù)儀準確計數(shù)。將計數(shù)好的細胞用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度至5×10?個/mL。在上室中加入200μL細胞懸液，確保每個小室的細胞數(shù)量一致。下室加入600μL含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，胎牛血清中富含多種生長因子，能夠作為趨化因子誘導細胞遷移和侵襲。將24孔板放入37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未穿過膜的細胞。將小室置于4%多聚甲醛溶液中浸泡15min，固定細胞。固定結(jié)束后，用PBS緩沖液清洗小室3次，每次5min，以去除殘留的多聚甲醛。將小室放入0.1%結(jié)晶紫染液中，室溫染色15min，使穿過膜的細胞染上紫色。染色結(jié)束后，用PBS緩沖液反復沖洗小室，直至洗去多余的染液，使背景清晰。將染色后的小室置于顯微鏡下，隨機選取5個視野（上、下、中央、左、右各1個），計數(shù)每個視野中穿過膜并被染色的細胞數(shù)量。實驗結(jié)果（圖7）顯示，未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA組細胞穿過Matrigel基質(zhì)膠進入下室的數(shù)量較多，平均每個視野的細胞數(shù)分別為（185.6±12.3）個和（182.5±11.8）個，兩組之間無顯著差異（P＞0.05）。而siRNA-2組細胞穿過Matrigel基質(zhì)膠的數(shù)量明顯減少，平均每個視野的細胞數(shù)僅為（56.8±6.5）個，與未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA組相比，差異具有極顯著性（P＜0.01）。這表明MMP-9基因沉默后，胃癌細胞的侵襲能力受到了顯著抑制，MMP-9基因在胃癌細胞的侵襲過程中發(fā)揮著重要作用。[此處插入Transwell實驗結(jié)果的圖片及柱狀圖，圖注為：圖7Transwell實驗檢測不同組胃癌細胞的侵襲能力，A為不同組胃癌細胞侵襲的圖片，1為未轉(zhuǎn)染組，2為陰性對照siRNA組，3為siRNA-2組；B為侵襲細胞數(shù)柱狀圖，與未轉(zhuǎn)染組相比，P＜0.01；與陰性對照siRNA組相比，##P＜0.01]4.2.2劃痕實驗檢測細胞遷移劃痕實驗，又稱傷口愈合實驗，是一種簡單、直觀且廣泛應用于研究細胞遷移能力的實驗方法。其原理基于細胞在接收到遷移信號或感受到某些物質(zhì)的梯度后而產(chǎn)生的移動特性。在融合的單層細胞上人為制造一個空白區(qū)域，即“劃痕”，劃痕邊緣的細胞會逐漸進入空白區(qū)域，使“劃痕”愈合。通過在不同時間點測量劃痕的寬度，并計算其差值，就可以對細胞的遷移能力做出準確判斷。該實驗操作相對簡便，無需特殊的實驗設備，且能夠直觀地觀察細胞的遷移過程，在腫瘤細胞遷移研究中具有重要的應用價值。具體實驗操作如下：首先，在6孔板底面，用馬克筆順著直尺均勻地劃三條橫線作為標記線，相鄰橫線之間的距離大約為0.5-1cm，每孔至少穿過5條線，這些標記線將作為后續(xù)拍照和測量的定位依據(jù)。將處于對數(shù)生長期的未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA組和轉(zhuǎn)染針對MMP-9基因的siRNA-2組胃癌細胞，用0.25%胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液。使用細胞計數(shù)儀準確計數(shù)后，按照每孔5×10?個細胞的密度接種于6孔板中，加入適量的含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，輕輕搖晃培養(yǎng)板，使細胞均勻分布，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，確保過夜后細胞能夠長滿。待細胞長滿單層后，用直尺比著，取200μL槍頭垂直于孔板底面和畫好的標記線劃兩條垂線，使劃痕與標記線相交，形成若干交叉點，這些交叉點將作為固定的檢測點，用于在不同時間點對同一位置進行拍照和測量。劃痕過程中，要用力均勻一致，垂直穩(wěn)定一氣呵成，避免劃痕寬度差別較大，影響結(jié)果分析的準確性。劃完痕后，棄去舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕潤洗細胞2-3次，直至將劃下來的細胞沖洗干凈，避免殘留的細胞在后續(xù)實驗中貼壁增殖，干擾實驗結(jié)果。根據(jù)分組分別加入無血清培養(yǎng)基，無血清培養(yǎng)基可以降低細胞增殖的影響，使實驗結(jié)果更能準確反映細胞的遷移能力。也可以根據(jù)細胞種類，選擇低血清培養(yǎng)基或用絲裂霉素（1μg/mL）處理1h，抑制細胞的分裂，但同時也需要注意這些處理可能會對細胞遷移速度產(chǎn)生一定影響。劃痕、清洗、加液完成后，立即用顯微鏡在4倍鏡下拍照，記錄劃痕的初始狀態(tài)，作為0h對照。拍照時要保證劃痕居中且垂直，注意背景一致，避免邊緣的光影差別過大影響結(jié)果分析。為了便于后續(xù)拍攝同一位置，可在試驗記錄本上標記拍照位置。將6孔板放入37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)后的6h、12h、24h取出細胞，于顯微鏡下觀察同一位置劃痕寬度并拍照。使用ImageJ軟件對拍攝的照片進行分析，具體步驟如下：打開ImageJ軟件，導入要分析的圖片。點擊“Image”→“Type”→“8-bit”將圖片轉(zhuǎn)換成黑白圖像，以便于后續(xù)分析。點擊“Edit”→“Invert”將圖片背景轉(zhuǎn)換成黑色，使細胞與背景形成鮮明對比。點擊“Image”→“Adjust”→“Threshold”，選擇“B&W”，通過調(diào)節(jié)滾動條使圖片盡可能地包含所有細胞的同時去除背景中的雜質(zhì)，點擊“apply”應用設置。在圖片上隨機劃取6-8條水平線，測量細胞間距離，計算細胞間距離的均值。按照公式“細胞遷移率(傷口愈合率)=(初始細胞間距離均值-t時刻細胞間距離均值)/初始細胞間距離均值”計算細胞遷移率。實驗結(jié)果（圖8）表明，隨著培養(yǎng)時間的延長，未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA組細胞的劃痕寬度逐漸減小，細胞遷移率逐漸增加。在24h時，未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA組的細胞遷移率分別達到了（65.3±4.5）%和（63.8±4.2）%，兩組之間無顯著差異（P＞0.05）。而siRNA-2組細胞的劃痕寬度減小速度明顯較慢，細胞遷移率較低，在24h時僅為（28.6±3.2）%，與未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA組相比，差異具有極顯著性（P＜0.01）。這充分說明MMP-9基因沉默后，胃癌細胞的遷移能力受到了顯著抑制，進一步證實了MMP-9基因在胃癌細胞遷移過程中起著關(guān)鍵作用。[此處插入劃痕實驗結(jié)果的圖片及柱狀圖，圖注為：圖8劃痕實驗檢測不同組胃癌細胞的遷移能力，A為不同組胃癌細胞在不同時間點的劃痕圖片，1為未轉(zhuǎn)染組，2為陰性對照siRNA組，3為siRNA-2組；B為細胞遷移率柱狀圖，與未轉(zhuǎn)染組相比，P＜0.01；與陰性對照siRNA組相比，##P＜0.01]4.3實驗結(jié)果與分析4.3.1細胞增殖結(jié)果分析通過CCK-8法檢測細胞增殖繪制的細胞生長曲線（圖5）以及克隆形成實驗的結(jié)果（圖6），均清晰地表明MMP-9基因沉默對胃癌細胞增殖能力具有顯著的抑制作用。從細胞生長曲線來看，在培養(yǎng)初期，未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA組和轉(zhuǎn)染針對MMP-9基因的siRNA-2組細胞的生長情況相近，OD值無明顯差異，這說明初始接種的細胞狀態(tài)和數(shù)量基本一致，實驗條件具有可比性。然而，隨著培養(yǎng)時間的延長，未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA組細胞呈現(xiàn)出明顯的對數(shù)生長趨勢，OD值迅速上升，表明這兩組細胞的增殖能力正常，能夠在適宜的培養(yǎng)條件下快速分裂增殖。與之形成鮮明對比的是，siRNA-2組細胞的生長曲線較為平緩，OD值在各時間點均顯著低于未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA組（P＜0.01）。這充分說明MMP-9基因沉默后，胃癌細胞的增殖進程受到了嚴重阻礙，細胞的生長速度明顯減緩。在培養(yǎng)至第5天時，未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA組細胞的OD值分別達到了1.56±0.08和1.52±0.07，而siRNA-2組細胞的OD值僅為0.85±0.05，進一步證實了MMP-9基因沉默對胃癌細胞增殖的抑制效果?？寺⌒纬蓪嶒灥慕Y(jié)果進一步驗證了上述結(jié)論。未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA組細胞能夠形成大量的克隆，克隆形成率分別為（35.6±3.2）%和（34.8±2.9）%，兩組之間無顯著差異（P＞0.05），表明陰性對照siRNA對細胞的克隆形成能力沒有影響，細胞能夠正常進行克隆增殖。而siRNA-2組細胞形成的克隆數(shù)量明顯減少，克隆形成率僅為（12.5±1.8）%，與未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA組相比，差異具有極顯著性（P＜0.01）。這表明MMP-9基因沉默后，胃癌細胞的克隆形成能力受到了極大的抑制，單個細胞增殖形成克隆的能力顯著下降。從克隆的形態(tài)上看，未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA組的克隆較大，細胞生長密集，說明細胞的增殖活性較強；而siRNA-2組的克隆較小，細胞生長稀疏，直觀地反映出MMP-9基因沉默導致胃癌細胞的增殖能力減弱。MMP-9基因沉默抑制胃癌細胞增殖的可能機制如下：MMP-9作為基質(zhì)金屬蛋白酶家族的重要成員，在腫瘤細胞的增殖過程中發(fā)揮著多方面的作用。一方面，MMP-9可以通過降解細胞外基質(zhì)，釋放出被基質(zhì)結(jié)合的生長因子，如胰島素樣生長因子（IGF）、成纖維細胞生長因子（FGF）等。這些生長因子與腫瘤細胞表面的相應受體結(jié)合后，激活細胞內(nèi)的信號傳導通路，如Ras-Raf-MEK-ERK通路和PI3K-Akt通路等，從而促進細胞的增殖和存活。當MMP-9基因被沉默后，其表達和活性受到抑制，無法有效地降解細胞外基質(zhì)，導致生長因子的釋放減少，細胞內(nèi)的增殖信號傳導通路被阻斷，進而抑制了胃癌細胞的增殖。另一方面，MMP-9還可以直接作用于腫瘤細胞表面的某些分子，如整合素等。整合素是一類細胞表面的跨膜蛋白，參與細胞與細胞外基質(zhì)之間的粘附和信號傳導。MMP-9可以通過切割整合素，改變