基于miRNA組學(xué)解析不同毒力PRRSVs感染豬肺泡巨噬細(xì)胞的分子機(jī)制一、引言1.1研究背景1.1.1PRRSV對養(yǎng)豬業(yè)的危害豬繁殖與呼吸綜合征（PorcineReproductiveandRespiratorySyndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus，PRRSV）引起的一種具有高度傳染性的疾病，對全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。自20世紀(jì)80年代末首次在美國被發(fā)現(xiàn)以來，PRRSV迅速傳播至世界各地，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了沉重的打擊。PRRSV主要侵害豬的生殖系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)，導(dǎo)致母豬出現(xiàn)繁殖障礙，如流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等；仔豬和育肥豬則表現(xiàn)出呼吸道疾病癥狀，如咳嗽、氣喘、呼吸困難等，同時伴有生長發(fā)育遲緩、免疫力下降，易繼發(fā)其他細(xì)菌和病毒感染，進(jìn)一步加重病情，導(dǎo)致死亡率升高。據(jù)統(tǒng)計，在一些PRRSV感染嚴(yán)重的地區(qū)，母豬的流產(chǎn)率可高達(dá)30%-50%，仔豬的死亡率可達(dá)20%-80%，育肥豬的生長周期延長，飼料轉(zhuǎn)化率降低，給養(yǎng)殖戶帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在我國，PRRSV的流行也十分廣泛，嚴(yán)重影響了養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。尤其是2006年爆發(fā)的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征（HighlyPathogenicPorcineReproductiveandRespiratorySyndrome，HP-PRRS），其發(fā)病急、傳播快、死亡率高，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了慘重的損失。據(jù)估算，僅2006-2007年，我國因HP-PRRS造成的直接經(jīng)濟(jì)損失就超過了400億元。此后，PRRSV在我國養(yǎng)豬場持續(xù)存在，不斷變異和進(jìn)化，給防控工作帶來了極大的挑戰(zhàn)。1.1.2豬肺泡巨噬細(xì)胞在PRRSV感染中的關(guān)鍵作用豬肺泡巨噬細(xì)胞（PorcineAlveolarMacrophages，PAM）是豬呼吸道免疫系統(tǒng)的重要組成部分，也是PRRSV感染的主要靶細(xì)胞。PAM位于肺泡表面，直接與外界環(huán)境接觸，能夠吞噬和清除入侵的病原體，在先天性免疫和適應(yīng)性免疫中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。PRRSV之所以能夠特異性地感染PAM，主要是因為PAM表面表達(dá)有多種PRRSV的受體，如CD163、CD169等。其中，CD163是PRRSV感染的關(guān)鍵受體，它屬于富含半胱氨酸的清道夫受體家族成員，能夠介導(dǎo)PRRSV的內(nèi)化和分解。研究表明，敲除CD163基因的豬對PRRSV具有較強(qiáng)的抵抗力，這充分說明了CD163在PRRSV感染中的重要作用。一旦PRRSV感染PAM，病毒便會在細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制，導(dǎo)致PAM的功能受損。PAM的吞噬能力下降，無法有效地清除病原體；抗原遞呈能力受到抑制，影響了機(jī)體的適應(yīng)性免疫應(yīng)答；同時，PAM還會分泌大量的炎癥因子，引起肺部炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步加重組織損傷。此外，PRRSV感染還會導(dǎo)致PAM的凋亡增加，細(xì)胞數(shù)量減少，從而削弱了呼吸道的免疫防御功能，使得豬更容易受到其他病原體的感染。1.1.3miRNA組學(xué)在病毒感染研究中的重要性微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長度約為21-25個核苷酸的非編碼RNA分子，它們廣泛存在于真核生物中，通過與靶mRNA的互補(bǔ)配對結(jié)合，抑制mRNA的翻譯過程或促使其降解，從而實現(xiàn)對基因表達(dá)的調(diào)控。miRNA在生物體內(nèi)參與了多種生理和病理過程，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡、代謝等，其表達(dá)異常與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在病毒感染研究中，miRNA組學(xué)發(fā)揮著重要的作用。一方面，宿主細(xì)胞可以通過調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)來應(yīng)對病毒感染，一些miRNA能夠直接靶向病毒基因，抑制病毒的復(fù)制和傳播；另一方面，病毒也可以利用宿主細(xì)胞的miRNA來促進(jìn)自身的感染和生存，例如，病毒可以誘導(dǎo)宿主細(xì)胞表達(dá)某些miRNA，從而干擾宿主的免疫應(yīng)答，為病毒的感染創(chuàng)造有利條件。因此，研究病毒感染過程中宿主細(xì)胞miRNA的表達(dá)變化及其作用機(jī)制，有助于深入揭示病毒與宿主之間的相互作用關(guān)系，為病毒感染性疾病的防治提供新的靶點和策略。近年來，隨著高通量測序技術(shù)的飛速發(fā)展，miRNA組學(xué)研究取得了長足的進(jìn)步。通過對病毒感染前后宿主細(xì)胞miRNA表達(dá)譜的分析，可以全面、系統(tǒng)地了解miRNA在病毒感染過程中的調(diào)控作用，為進(jìn)一步研究病毒感染的分子機(jī)制提供了有力的工具。1.2研究目的與意義1.2.1研究目的本研究旨在通過miRNA組學(xué)技術(shù)，深入分析不同毒力PRRSVs感染豬肺泡巨噬細(xì)胞后miRNA的表達(dá)譜變化，篩選出差異表達(dá)的miRNA，并進(jìn)一步探究其對PRRSV感染相關(guān)基因的調(diào)控機(jī)制，從而揭示miRNA在PRRSV感染過程中的作用，為PRRS的防治提供新的理論依據(jù)和潛在的分子靶點。具體研究目標(biāo)如下：運(yùn)用高通量測序技術(shù)，構(gòu)建不同毒力PRRSVs（如高致病性PRRSV和經(jīng)典PRRSV）感染豬肺泡巨噬細(xì)胞后的miRNA表達(dá)譜，全面、系統(tǒng)地分析miRNA的表達(dá)差異。結(jié)合生物信息學(xué)分析方法，預(yù)測差異表達(dá)miRNA的靶基因，并對其進(jìn)行功能注釋和信號通路富集分析，初步探討miRNA在PRRSV感染過程中參與的生物學(xué)過程和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。通過實驗驗證，如熒光素酶報告基因?qū)嶒?、qRT-PCR、Westernblot等技術(shù)，確定差異表達(dá)miRNA與靶基因之間的相互作用關(guān)系，明確miRNA對PRRSV感染相關(guān)基因的調(diào)控機(jī)制。研究差異表達(dá)miRNA對PRRSV復(fù)制、細(xì)胞凋亡、免疫應(yīng)答等生物學(xué)過程的影響，為深入理解PRRSV的致病機(jī)制提供新的視角。1.2.2研究意義PRRSV的持續(xù)流行和變異給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重威脅著養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。深入研究PRRSV的致病機(jī)制，尋找有效的防控措施和治療靶點，已成為當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)亟待解決的重要問題。本研究通過對不同毒力PRRSVs感染的豬肺泡巨噬細(xì)胞進(jìn)行miRNA組學(xué)研究，具有重要的理論意義和實際應(yīng)用價值。理論意義：miRNA在病毒感染過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，然而目前關(guān)于miRNA在PRRSV感染中的作用機(jī)制尚不完全清楚。本研究通過全面分析不同毒力PRRSVs感染豬肺泡巨噬細(xì)胞后miRNA的表達(dá)變化，有助于揭示miRNA在PRRSV感染過程中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為深入理解PRRSV的致病機(jī)制提供新的理論依據(jù)。豬肺泡巨噬細(xì)胞作為PRRSV感染的主要靶細(xì)胞，其功能狀態(tài)直接影響著PRRSV的感染和復(fù)制。研究miRNA對豬肺泡巨噬細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用，有助于進(jìn)一步闡明PRRSV與宿主細(xì)胞之間的相互作用關(guān)系，豐富病毒與宿主相互作用的理論體系。實際應(yīng)用價值：篩選出的差異表達(dá)miRNA及其靶基因，有可能成為PRRS的診斷標(biāo)志物和治療靶點。通過檢測這些miRNA和靶基因的表達(dá)水平，可以實現(xiàn)對PRRS的早期診斷和精準(zhǔn)治療，提高防控效果。深入了解miRNA在PRRSV感染過程中的作用機(jī)制，為開發(fā)新型的PRRS疫苗和抗病毒藥物提供新的思路和策略。例如，可以通過調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)或干預(yù)其與靶基因的相互作用，來增強(qiáng)宿主的抗病毒能力，抑制PRRSV的復(fù)制和傳播。本研究結(jié)果還可以為養(yǎng)豬業(yè)的健康養(yǎng)殖提供科學(xué)指導(dǎo)，通過優(yōu)化養(yǎng)殖環(huán)境、調(diào)整飼養(yǎng)管理措施等方式，調(diào)節(jié)豬肺泡巨噬細(xì)胞中miRNA的表達(dá)，提高豬群的免疫力，降低PRRS的發(fā)生風(fēng)險，促進(jìn)養(yǎng)豬業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1PRRSV概述2.1.1PRRSV的生物學(xué)特性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）是一種具有囊膜的單股正鏈RNA病毒，其病毒粒子呈球形，直徑約為45-60納米。PRRSV的基因組長度約為15kb，包含至少10個開放閱讀框（OpenReadingFrames，ORFs），這些ORFs編碼了多種病毒蛋白，包括非結(jié)構(gòu)蛋白（Non-structuralProteins，NSPs）和結(jié)構(gòu)蛋白。ORF1a和ORF1b占基因組的大部分，它們編碼了一系列非結(jié)構(gòu)蛋白，這些蛋白在病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和調(diào)控過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。例如，NSP1具有蛋白酶活性，能夠切割多聚蛋白，產(chǎn)生成熟的非結(jié)構(gòu)蛋白；NSP2則參與病毒的復(fù)制復(fù)合體的形成，對病毒的復(fù)制至關(guān)重要。研究表明，NSP2的變異與PRRSV的毒力變化密切相關(guān)，一些高致病性PRRSV毒株在NSP2區(qū)域存在特定的氨基酸缺失或突變。ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5a、ORF5、ORF6和ORF7編碼了病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，包括糖蛋白GP2、GP3、GP4、GP5、GP5a、包膜蛋白E、基質(zhì)蛋白M和核衣殼蛋白N。其中，GP5和M蛋白是病毒的主要免疫原性蛋白，它們能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，在病毒的免疫應(yīng)答過程中起著重要作用。GP5蛋白的抗原性變異較為頻繁，這也是導(dǎo)致PRRSV免疫逃逸和疫苗效果不佳的重要原因之一。根據(jù)病毒的基因序列和抗原性差異，PRRSV可分為歐洲型（基因I型）和北美型（基因II型）兩個基因型，兩者之間的核苷酸序列同源性約為60%-70%。歐洲型PRRSV的代表毒株是Lelystad病毒，北美型PRRSV的代表毒株是VR-2332病毒。這兩種基因型的PRRSV在全球范圍內(nèi)均有分布，但在不同地區(qū)的流行情況有所不同。在我國，以北美型PRRSV的流行最為廣泛，且在2006年出現(xiàn)的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征（HP-PRRS）疫情中，主要流行的是北美型PRRSV的變異毒株。2.1.2PRRSV的流行現(xiàn)狀與毒力差異自1987年首次在美國被發(fā)現(xiàn)以來，PRRSV迅速在全球范圍內(nèi)傳播，目前已廣泛分布于世界各大洲的養(yǎng)豬國家和地區(qū)，成為危害全球養(yǎng)豬業(yè)的重要疫病之一。在歐洲，PRRSV的流行較為普遍，各國均有不同程度的感染情況。其中，荷蘭、德國、法國等養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達(dá)的國家，PRRSV的感染率較高，給當(dāng)?shù)氐酿B(yǎng)豬業(yè)帶來了較大的經(jīng)濟(jì)損失。在亞洲，除我國外，韓國、日本、泰國等國家也深受PRRSV的困擾，疫情時有爆發(fā)，防控形勢嚴(yán)峻。在我國，PRRSV自1996年首次被分離鑒定以來，一直呈持續(xù)流行態(tài)勢，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2006年爆發(fā)的HP-PRRS疫情，其發(fā)病急、傳播快、死亡率高，對我國養(yǎng)豬業(yè)造成了重創(chuàng)。此后，PRRSV在我國不斷變異和進(jìn)化，新的毒株不斷出現(xiàn)，使得疫情的防控難度進(jìn)一步加大。近年來的監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，我國PRRSV的流行毒株主要為北美型，其中以類NADC30毒株為代表的譜系1病毒已取代HP-PRRSV，成為我國的主要流行毒株。此外，歐洲型PRRSV在我國部分地區(qū)也有檢出，但相對較少。PRRSV的毒力存在明顯差異，不同毒力的毒株感染豬群后，所引起的臨床癥狀和病理變化也各不相同。高致病性PRRSV毒株感染豬群后，可導(dǎo)致母豬出現(xiàn)嚴(yán)重的繁殖障礙，如流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等，流產(chǎn)率可達(dá)30%-50%；仔豬和育肥豬則表現(xiàn)出嚴(yán)重的呼吸道癥狀，如高熱、咳嗽、氣喘、呼吸困難等，死亡率可高達(dá)20%-80%。同時，高致病性PRRSV還可引起豬群的免疫抑制，導(dǎo)致豬只對其他病原體的易感性增加，易繼發(fā)感染其他細(xì)菌和病毒，進(jìn)一步加重病情。相比之下，經(jīng)典PRRSV毒株的毒力相對較弱，感染豬群后，母豬的繁殖障礙和仔豬、育肥豬的呼吸道癥狀相對較輕，死亡率也較低。但經(jīng)典PRRSV毒株可在豬體內(nèi)持續(xù)感染，長期帶毒排毒，成為豬場的重要傳染源，容易導(dǎo)致疫情的反復(fù)發(fā)生。此外，一些中等毒力的PRRSV毒株在近年來也逐漸受到關(guān)注，這些毒株的毒力介于高致病性和經(jīng)典毒株之間，感染豬群后所引起的臨床癥狀和病理變化具有一定的復(fù)雜性，給診斷和防控工作帶來了新的挑戰(zhàn)。不同毒力PRRSV毒株的分布也存在一定的地域差異。在我國，高致病性PRRSV毒株在2006-2010年期間廣泛流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的損失。隨著疫苗的廣泛使用和防控措施的加強(qiáng)，高致病性PRRSV毒株的流行得到了一定程度的控制，但在一些地區(qū)仍有散在發(fā)生。類NADC30毒株自2013年以來在我國迅速傳播，已成為多個地區(qū)的優(yōu)勢流行毒株，其感染豬群后可引起溫和性或亞臨床感染，不易被察覺，但可導(dǎo)致豬群的生產(chǎn)性能下降，給養(yǎng)豬業(yè)帶來潛在的經(jīng)濟(jì)損失。經(jīng)典PRRSV毒株在我國部分地區(qū)仍有一定的感染率，尤其是在一些管理水平較低、生物安全措施落實不到位的豬場，容易發(fā)生經(jīng)典PRRSV的感染和傳播。2.2豬肺泡巨噬細(xì)胞2.2.1豬肺泡巨噬細(xì)胞的生物學(xué)特性豬肺泡巨噬細(xì)胞（PorcineAlveolarMacrophages，PAM）是肺臟免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在維持肺部免疫平衡和抵御病原體入侵方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。從形態(tài)學(xué)角度來看，PAM呈圓形或橢圓形，細(xì)胞體積較大，直徑通常在10-30微米之間。細(xì)胞表面具有豐富的微絨毛和偽足，這些結(jié)構(gòu)不僅增加了細(xì)胞的表面積，有利于與周圍環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換，還使其能夠更有效地吞噬病原體和異物。在顯微鏡下觀察，PAM的細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，位于細(xì)胞中央，染色質(zhì)較為疏松，核仁明顯；細(xì)胞質(zhì)豐富，含有大量的溶酶體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器，這些細(xì)胞器為PAM的各種生理功能提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。PAM具有多種重要功能，其中吞噬和殺菌功能是其最主要的功能之一。當(dāng)病原體如細(xì)菌、病毒等入侵肺部時，PAM能夠迅速識別并通過偽足的伸展將病原體包裹起來，形成吞噬體。隨后，吞噬體與溶酶體融合，溶酶體內(nèi)的各種水解酶和抗菌物質(zhì)如溶菌酶、過氧化物酶等對病原體進(jìn)行降解和殺滅，從而有效地清除入侵的病原體。研究表明，PAM對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等常見細(xì)菌具有較強(qiáng)的吞噬和殺滅能力，能夠在短時間內(nèi)降低病原體的數(shù)量，減輕其對肺部組織的損害。此外，PAM還具有抗原遞呈功能。在吞噬病原體后，PAM能夠?qū)⒉≡w的抗原信息加工處理，并通過細(xì)胞表面的主要組織相容性復(fù)合體（MHC）分子將抗原呈遞給T淋巴細(xì)胞，激活T淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答，從而啟動適應(yīng)性免疫反應(yīng)。這一過程對于機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫記憶和長期免疫保護(hù)至關(guān)重要。除了上述功能外，PAM還能夠分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，如白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等。這些細(xì)胞因子和趨化因子在調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活化、增殖和分化，以及炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。例如，TNF-α能夠激活其他免疫細(xì)胞，增強(qiáng)它們的殺菌能力；IL-1和IL-6則參與了炎癥反應(yīng)的啟動和放大，吸引更多的免疫細(xì)胞聚集到感染部位，共同抵御病原體的入侵。PAM主要來源于血液中的單核細(xì)胞，單核細(xì)胞在骨髓中生成后，進(jìn)入血液循環(huán)，并在趨化因子的作用下遷移到肺部組織。在肺部微環(huán)境的誘導(dǎo)下，單核細(xì)胞逐漸分化為PAM，并定居在肺泡表面。PAM的分離培養(yǎng)方法主要有支氣管肺泡灌洗法和肺組織消化法。支氣管肺泡灌洗法是目前常用的分離PAM的方法，該方法通過向氣管內(nèi)注入適量的無菌生理鹽水，反復(fù)沖洗肺泡，將PAM從肺泡表面沖洗出來，然后通過離心等方法收集PAM。這種方法操作相對簡單，能夠獲得較高純度的PAM，但需要一定的實驗設(shè)備和技術(shù)，且對動物的損傷較大。肺組織消化法是將肺組織剪碎后，用胰蛋白酶、膠原酶等消化酶進(jìn)行消化，使PAM從肺組織中釋放出來，再通過過濾、離心等步驟分離得到PAM。該方法適用于大規(guī)模分離PAM，但分離得到的PAM純度相對較低，需要進(jìn)一步純化。分離得到的PAM需要在合適的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，常用的培養(yǎng)基有RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基等，并添加適量的胎牛血清、抗生素等成分，以提供細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)和維持細(xì)胞的無菌環(huán)境。在培養(yǎng)過程中，PAM能夠貼壁生長，形成單層細(xì)胞，可通過定期更換培養(yǎng)基、傳代等方式進(jìn)行細(xì)胞的擴(kuò)增和保存。2.2.2豬肺泡巨噬細(xì)胞與PRRSV的相互作用PRRSV感染豬肺泡巨噬細(xì)胞是一個復(fù)雜的過程，涉及多個步驟和分子機(jī)制。首先，PRRSV通過其表面的結(jié)構(gòu)蛋白與PAM表面的受體結(jié)合，實現(xiàn)病毒的吸附。研究表明，PRRSV主要通過與PAM表面的CD163、CD169等受體相互作用，來啟動感染過程。其中，CD163是PRRSV感染的關(guān)鍵受體，它屬于富含半胱氨酸的清道夫受體家族成員，具有多個功能結(jié)構(gòu)域，能夠特異性地識別并結(jié)合PRRSV的病毒粒子。當(dāng)PRRSV與CD163結(jié)合后，會引發(fā)一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，導(dǎo)致病毒粒子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。病毒進(jìn)入細(xì)胞的方式主要有兩種，一種是通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，另一種是直接膜融合。在受體介導(dǎo)的內(nèi)吞過程中，PRRSV與PAM表面的受體結(jié)合后，會被細(xì)胞內(nèi)吞形成內(nèi)吞體。內(nèi)吞體在細(xì)胞內(nèi)不斷酸化，促使病毒粒子發(fā)生構(gòu)象變化，從而釋放出病毒基因組RNA，實現(xiàn)病毒的脫殼和復(fù)制。直接膜融合則是指PRRSV的囊膜與PAM的細(xì)胞膜直接融合，將病毒基因組RNA釋放到細(xì)胞內(nèi)。這種方式相對較為少見，但在某些情況下也可能發(fā)生。一旦PRRSV進(jìn)入PAM，病毒便會利用細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)和能量進(jìn)行復(fù)制。病毒基因組RNA首先在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，合成病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白。這些蛋白在細(xì)胞內(nèi)組裝成新的病毒粒子，然后通過出芽的方式釋放到細(xì)胞外，繼續(xù)感染其他PAM。在病毒復(fù)制過程中，PRRSV會對PAM的功能產(chǎn)生顯著影響。PAM的吞噬能力明顯下降，無法有效地清除其他病原體。研究發(fā)現(xiàn)，感染PRRSV后的PAM對金黃色葡萄球菌的吞噬效率比未感染細(xì)胞降低了50%以上，這使得豬在感染PRRSV后更容易繼發(fā)其他細(xì)菌感染。PRRSV感染還會抑制PAM的抗原遞呈功能，影響機(jī)體的適應(yīng)性免疫應(yīng)答。PAM表面的MHC分子表達(dá)減少，導(dǎo)致其無法有效地將抗原信息呈遞給T淋巴細(xì)胞，從而削弱了機(jī)體對PRRSV的特異性免疫反應(yīng)。此外，PRRSV感染還會導(dǎo)致PAM分泌的細(xì)胞因子和趨化因子失衡，大量促炎因子如TNF-α、IL-6等過度分泌，引起肺部炎癥反應(yīng)加劇，導(dǎo)致組織損傷和功能障礙；而一些抗炎因子和免疫調(diào)節(jié)因子的分泌則減少，進(jìn)一步破壞了機(jī)體的免疫平衡。PRRSV感染還會誘導(dǎo)PAM發(fā)生凋亡，細(xì)胞數(shù)量減少，從而削弱了呼吸道的免疫防御功能。研究表明，感染PRRSV后的PAM在感染后24-48小時內(nèi)凋亡率顯著增加，這使得豬的肺部更容易受到其他病原體的侵襲，加重了病情的發(fā)展。2.3miRNA組學(xué)2.3.1miRNA的生物合成與作用機(jī)制miRNA的生物合成是一個復(fù)雜且精細(xì)調(diào)控的過程，涉及多個關(guān)鍵步驟和酶的參與。其過程首先從細(xì)胞核內(nèi)開始，以DNA為模板，由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄生成初始miRNA（primarymiRNA，pri-miRNA）。pri-miRNA通常長度可達(dá)數(shù)千個核苷酸，具有典型的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。例如，人類的miR-122最初轉(zhuǎn)錄生成的pri-miR-122可長達(dá)1kb以上，其莖環(huán)結(jié)構(gòu)對于后續(xù)的加工過程至關(guān)重要。在細(xì)胞核中，pri-miRNA會被一種名為Drosha的核糖核酸酶III識別并切割。Drosha與DGCR8蛋白形成復(fù)合物，精準(zhǔn)地對pri-miRNA進(jìn)行切割，將其從長鏈轉(zhuǎn)錄本中剪切出長度約為70-100個核苷酸的前體miRNA（precursormiRNA，pre-miRNA）。pre-miRNA同樣具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，它作為miRNA生物合成過程中的重要中間產(chǎn)物，會通過核孔復(fù)合體轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中。進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后，pre-miRNA會被另一種核糖核酸酶III，即Dicer識別。Dicer能夠進(jìn)一步對pre-miRNA進(jìn)行切割，去除其莖環(huán)結(jié)構(gòu)的末端，生成長度約為21-25個核苷酸的雙鏈miRNA。這一雙鏈miRNA包含成熟的miRNA鏈（guidestrand）和互補(bǔ)鏈（passengerstrand，也稱為miRNA*）。在大多數(shù)情況下，互補(bǔ)鏈會被降解，而成熟的miRNA鏈則會與AGO蛋白（Argonauteprotein）等結(jié)合，形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）。RISC是miRNA發(fā)揮調(diào)控作用的關(guān)鍵功能復(fù)合體，它能夠識別并結(jié)合靶mRNA。miRNA對基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制主要通過與靶mRNA的互補(bǔ)配對來實現(xiàn)。當(dāng)miRNA與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）存在完全或近乎完全互補(bǔ)時，RISC中的AGO蛋白會介導(dǎo)靶mRNA的降解，從而直接降低靶mRNA的水平。例如，在某些病毒感染過程中，宿主細(xì)胞產(chǎn)生的特定miRNA能夠與病毒mRNA的3'UTR精確配對，引導(dǎo)RISC對病毒mRNA進(jìn)行切割，有效抑制病毒的復(fù)制。當(dāng)miRNA與靶mRNA的3'UTR部分互補(bǔ)時，RISC主要通過抑制靶mRNA的翻譯過程來調(diào)控基因表達(dá)。這種抑制作用可能涉及多個環(huán)節(jié)，如阻礙核糖體的結(jié)合、阻止翻譯起始復(fù)合物的形成或使翻譯過程提前終止等。研究表明，在細(xì)胞增殖和分化過程中，許多miRNA通過部分互補(bǔ)配對的方式抑制相關(guān)靶mRNA的翻譯，從而精細(xì)地調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理狀態(tài)。2.3.2miRNA在病毒感染中的調(diào)控作用在病毒感染過程中，miRNA發(fā)揮著多方面的調(diào)控作用，對病毒的感染進(jìn)程、宿主的免疫應(yīng)答以及細(xì)胞的生理狀態(tài)產(chǎn)生重要影響。一方面，宿主細(xì)胞可以利用miRNA來抵御病毒感染。一些miRNA能夠直接靶向病毒基因，通過與病毒mRNA的互補(bǔ)配對，抑制病毒基因的表達(dá)和病毒的復(fù)制。例如，在乙肝病毒（HBV）感染過程中，宿主細(xì)胞產(chǎn)生的miR-122能夠與HBV的mRNA結(jié)合，抑制其翻譯過程，從而減少病毒蛋白的合成，降低病毒的復(fù)制水平。miR-122還可以通過調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞內(nèi)的信號通路，增強(qiáng)宿主的抗病毒能力。研究發(fā)現(xiàn)，miR-122能夠上調(diào)宿主細(xì)胞內(nèi)某些抗病毒蛋白的表達(dá)，如干擾素刺激基因（ISGs），從而激活宿主的天然免疫應(yīng)答，有效抵抗HBV的感染。另一方面，病毒也會利用宿主細(xì)胞的miRNA來促進(jìn)自身的感染和生存。病毒可以通過多種方式調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞miRNA的表達(dá)，使其有利于病毒的復(fù)制和傳播。例如，流感病毒感染細(xì)胞后，能夠誘導(dǎo)宿主細(xì)胞表達(dá)特定的miRNA，這些miRNA可以抑制宿主細(xì)胞內(nèi)抗病毒基因的表達(dá)，從而削弱宿主的免疫防御能力，為病毒的感染創(chuàng)造有利條件。研究表明，流感病毒感染可誘導(dǎo)宿主細(xì)胞miR-29的表達(dá)上調(diào)，miR-29能夠靶向并抑制宿主細(xì)胞內(nèi)干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3）的表達(dá)，IRF3是啟動干擾素抗病毒信號通路的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)被抑制后，宿主細(xì)胞的抗病毒能力顯著下降，有利于流感病毒的復(fù)制和傳播。miRNA還在病毒感染引起的宿主免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。在天然免疫應(yīng)答方面，miRNA可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活化和細(xì)胞因子的分泌。例如，在巨噬細(xì)胞受到病原體刺激時，miR-155的表達(dá)會迅速上調(diào)，miR-155能夠通過靶向多個負(fù)調(diào)控因子，如SHIP1、SOCS1等，激活NF-κB信號通路，促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌多種促炎細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-6等，增強(qiáng)機(jī)體的天然免疫應(yīng)答。然而，過度的炎癥反應(yīng)可能會對機(jī)體造成損傷，miRNA也可以通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制來維持免疫平衡。例如，miR-146a能夠靶向TNF-α和IL-1信號通路中的關(guān)鍵分子，如TRAF6、IRAK1等，抑制炎癥因子的過度分泌，防止炎癥反應(yīng)的失控。在適應(yīng)性免疫應(yīng)答方面，miRNA參與了T細(xì)胞和B細(xì)胞的分化、活化和功能調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，miR-181家族在T細(xì)胞的發(fā)育和分化過程中發(fā)揮重要作用，miR-181a能夠通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞受體（TCR）信號通路的強(qiáng)度，影響T細(xì)胞的陽性選擇和陰性選擇，從而確保T細(xì)胞庫的正常發(fā)育和功能。在B細(xì)胞中，miR-150能夠調(diào)節(jié)B細(xì)胞的分化和抗體的產(chǎn)生，miR-150的缺失會導(dǎo)致B細(xì)胞過度活化，產(chǎn)生大量自身抗體，引發(fā)自身免疫性疾病。在病毒感染過程中，miRNA對宿主免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用直接影響著機(jī)體對病毒的免疫應(yīng)答效果，進(jìn)而影響病毒的感染和清除。三、研究設(shè)計3.1實驗材料3.1.1病毒株的選擇與來源為了全面研究不同毒力PRRSV對豬肺泡巨噬細(xì)胞miRNA表達(dá)譜的影響，本研究選取了具有代表性的不同毒力PRRSV毒株。其中，高致病性PRRSV毒株（HP-PRRSV）選用JXA1株，該毒株于2006年從我國江西省發(fā)病豬群中分離得到，是導(dǎo)致我國高致病性豬繁殖與呼吸綜合征疫情爆發(fā)的主要毒株之一。JXA1株在NSP2基因區(qū)域存在30個氨基酸的不連續(xù)缺失，這一特征與該毒株的高致病性密切相關(guān)。感染JXA1株的豬群會出現(xiàn)高熱、呼吸困難、繁殖障礙等嚴(yán)重癥狀，死亡率較高，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。JXA1株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所惠贈，本實驗室將其保存在-80℃冰箱中備用。經(jīng)典PRRSV毒株選用VR-2332株，它是北美型PRRSV的代表毒株，于1991年在美國被首次分離鑒定。VR-2332株的毒力相對較弱，感染豬群后主要引起溫和的呼吸道癥狀和輕度的繁殖障礙，死亡率較低。但該毒株可在豬體內(nèi)持續(xù)感染，長期帶毒排毒，成為豬場的重要傳染源。VR-2332株購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC），本實驗室在收到毒株后，對其進(jìn)行了復(fù)蘇和擴(kuò)增，并保存于-80℃冰箱中。這兩種毒株在毒力上存在顯著差異，選擇它們進(jìn)行研究，能夠更全面地揭示不同毒力PRRSV感染豬肺泡巨噬細(xì)胞后miRNA的表達(dá)變化及其作用機(jī)制，為深入理解PRRSV的致病機(jī)制提供更豐富的信息。3.1.2豬肺泡巨噬細(xì)胞的分離與培養(yǎng)豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）的分離采用支氣管肺泡灌洗法。選取3-4周齡的健康仔豬，購自某SPF級實驗動物養(yǎng)殖場，確保仔豬未感染PRRSV及其他常見病原體。將仔豬用戊巴比妥鈉（30mg/kg體重）進(jìn)行腹腔注射麻醉后，仰臥固定于手術(shù)臺上。用碘伏消毒胸部皮膚，沿腹中線切開皮膚和肌肉，暴露胸腔。小心分離氣管，在氣管上剪一小口，插入無菌的灌洗管，用滅菌的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4）進(jìn)行灌洗。每次灌洗注入30-50mlPBS，反復(fù)灌洗3-5次，直至回收的灌洗液清亮為止。將回收的灌洗液收集于無菌離心管中，4℃、1500rpm離心10分鐘，棄去上清液，沉淀即為PAM。將分離得到的PAM用含10%胎牛血清（FBS）、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10^6個/ml，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)2-3小時后，棄去上清液及未貼壁細(xì)胞，用PBS輕輕洗滌細(xì)胞2-3次，加入新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時，進(jìn)行后續(xù)實驗。為了鑒定分離得到的細(xì)胞是否為PAM，采用免疫熒光染色法。將PAM接種于預(yù)先放置有多聚賴氨酸處理過的蓋玻片的24孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后，用4%多聚甲醛固定15分鐘，0.1%TritonX-100透化10分鐘，5%牛血清白蛋白（BSA）封閉30分鐘。然后加入鼠抗豬CD163單克隆抗體（1:200稀釋），4℃孵育過夜。次日，用PBS洗滌3次，加入AlexaFluor488標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗（1:500稀釋），室溫孵育1小時。用PBS洗滌3次后，滴加DAPI染液染核，封片后在熒光顯微鏡下觀察。若細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，且細(xì)胞核被染成藍(lán)色，則表明細(xì)胞表達(dá)CD163，為PAM。3.1.3主要實驗試劑與儀器實驗所需的主要試劑包括：RNA提取試劑TRIzol（Invitrogen公司），用于提取細(xì)胞中的總RNA；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司），將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒（Roche公司），用于熒光定量PCR檢測miRNA和靶基因的表達(dá)水平；熒光素酶報告基因檢測試劑盒（Promega公司），用于驗證miRNA與靶基因的相互作用；胎牛血清（FBS，Gibco公司）、RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco公司），用于細(xì)胞培養(yǎng)；各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶（NEB公司），用于構(gòu)建熒光素酶報告基因載體；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。主要實驗儀器有：PCR儀（Bio-Rad公司），用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)；熒光定量PCR儀（Roche公司），進(jìn)行熒光定量PCR檢測；高通量測序儀（IlluminaHiSeq2500），對miRNA進(jìn)行測序分析；多功能酶標(biāo)儀（ThermoScientific公司），用于熒光素酶報告基因活性檢測；二氧化碳培養(yǎng)箱（ThermoScientific公司），維持細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境；離心機(jī)（Eppendorf公司），用于細(xì)胞和核酸的離心分離；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），提供無菌操作環(huán)境；熒光顯微鏡（Olympus公司），觀察細(xì)胞形態(tài)和免疫熒光染色結(jié)果。三、研究設(shè)計3.2實驗方法3.2.1PRRSV感染豬肺泡巨噬細(xì)胞模型的建立將處于對數(shù)生長期的豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞數(shù)為1×10^6個，加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長至80%-90%融合時，進(jìn)行病毒感染實驗。在感染前，先測定PRRSV毒株的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（TCID??）。采用Reed-Muench法，將病毒液進(jìn)行10倍系列稀釋，從10?1到10?1?，每個稀釋度接種8孔生長狀態(tài)良好的PAM，每孔接種100μl病毒稀釋液，同時設(shè)置細(xì)胞對照組（只加入等量的無血清RPMI1640培養(yǎng)基）。接種后，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中吸附2小時，期間每隔15-20分鐘輕輕搖晃培養(yǎng)板，使病毒與細(xì)胞充分接觸。吸附結(jié)束后，棄去上清液，用PBS輕輕洗滌細(xì)胞3次，以去除未吸附的病毒。然后加入含2%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72小時。培養(yǎng)結(jié)束后，觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CytopathicEffect，CPE），以出現(xiàn)50%細(xì)胞病變的最高病毒稀釋度作為該病毒的TCID??。根據(jù)前期預(yù)實驗結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)報道，確定感染復(fù)數(shù)（MOI）為0.1。將高致病性PRRSV毒株JXA1和經(jīng)典PRRSV毒株VR-2332分別用無血清RPMI1640培養(yǎng)基稀釋至所需濃度，使感染時的MOI為0.1。感染時，棄去6孔板中的培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞1-2次，每孔加入100μl稀釋好的病毒液，對照組加入等量的無血清RPMI1640培養(yǎng)基。將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中吸附2小時，期間輕輕搖晃培養(yǎng)板。吸附結(jié)束后，棄去上清液，用PBS洗滌細(xì)胞3次，加入含2%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。分別在感染后0小時（對照組，即未感染時）、12小時、24小時、36小時、48小時和72小時收集細(xì)胞，用于后續(xù)的miRNA提取和相關(guān)檢測。在收集細(xì)胞時，先棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞2-3次，然后加入適量的胰蛋白酶-EDTA消化液，在37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，待細(xì)胞變圓并開始脫落時，加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基終止消化。輕輕吹打細(xì)胞，使其懸浮，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1500rpm離心5分鐘，棄去上清液，收集細(xì)胞沉淀，用于miRNA提取。3.2.2miRNA的提取與測序采用專門的miRNA提取試劑盒（如Qiagen公司的miRNeasyMiniKit）從感染和未感染的豬肺泡巨噬細(xì)胞中提取miRNA。具體步驟如下：將收集的細(xì)胞沉淀加入適量的裂解液，充分混勻，使細(xì)胞完全裂解。加入氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘，然后12000rpm離心15分鐘，此時溶液分為三層，上層為無色水相，中層為白色蛋白層，下層為紅色有機(jī)相。將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的無水乙醇，混勻后轉(zhuǎn)移至miRNA提取柱中，12000rpm離心15秒，棄去流出液。依次用洗滌液1和洗滌液2對提取柱進(jìn)行洗滌，每次12000rpm離心15秒，棄去流出液。將提取柱轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入適量的RNase-free水，室溫靜置1分鐘，然后12000rpm離心1分鐘，收集洗脫液，即為提取的miRNA。使用Nanodrop2000超微量分光光度計測定提取的miRNA的濃度和純度，要求OD???/OD???比值在1.8-2.2之間，以確保miRNA的質(zhì)量。同時，利用Agilent2100生物分析儀對miRNA的完整性進(jìn)行檢測，確保RIN值（RNAIntegrityNumber）大于7.0。將提取的高質(zhì)量miRNA送往專業(yè)的測序公司（如華大基因）進(jìn)行高通量測序。測序采用IlluminaHiSeq2500測序平臺，測序策略為單端測序，測序長度為50bp。在測序前，首先對miRNA進(jìn)行文庫構(gòu)建。將miRNA與3'接頭和5'接頭進(jìn)行連接，然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，生成cDNA。對cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)過純化、定量和質(zhì)檢后，即可用于上機(jī)測序。測序過程中，通過熒光標(biāo)記的dNTP對cDNA進(jìn)行測序，每個循環(huán)會讀取一個堿基，從而獲得miRNA的序列信息。測序完成后，測序公司會提供原始測序數(shù)據(jù)，以fastq格式文件保存，包含每個測序read的序列信息和質(zhì)量值。3.2.3數(shù)據(jù)分析方法利用FastQC軟件對原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，檢查測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量分布、堿基組成、接頭污染等情況。對于質(zhì)量不合格的數(shù)據(jù)，如低質(zhì)量堿基比例過高、接頭污染嚴(yán)重等，采用Trimmomatic軟件進(jìn)行過濾和修剪，去除低質(zhì)量的reads、接頭序列和含N比例過高的reads，以提高數(shù)據(jù)的質(zhì)量。將經(jīng)過質(zhì)量控制的數(shù)據(jù)使用Bowtie軟件比對到豬的參考基因組（如Susscrofa11.1版本）上，確定miRNA在基因組上的位置。比對時，設(shè)置合適的參數(shù)，如允許的錯配數(shù)等，以確保比對的準(zhǔn)確性。通過比對，統(tǒng)計每個樣本中比對到基因組上的reads數(shù)量和比對率，評估測序數(shù)據(jù)與參考基因組的匹配情況。使用DESeq2軟件進(jìn)行差異表達(dá)分析，篩選出在不同毒力PRRSVs感染組與對照組之間差異表達(dá)的miRNA。設(shè)置差異表達(dá)的篩選標(biāo)準(zhǔn)為：|log?(FoldChange)|≥1且調(diào)整后的P值（padj）≤0.05。其中，F(xiàn)oldChange表示感染組與對照組中miRNA表達(dá)量的比值，log?(FoldChange)用于衡量差異表達(dá)的倍數(shù)變化；padj值是通過對原始P值進(jìn)行多重檢驗校正后得到的，用于控制假陽性率。通過差異表達(dá)分析，得到差異表達(dá)miRNA的列表，包括miRNA的名稱、log?(FoldChange)值、padj值等信息。利用miRanda、TargetScan等生物信息學(xué)工具預(yù)測差異表達(dá)miRNA的靶基因。這些工具根據(jù)miRNA與靶mRNA之間的互補(bǔ)配對原則，結(jié)合熱力學(xué)穩(wěn)定性等因素，預(yù)測miRNA可能作用的靶基因。將預(yù)測得到的靶基因進(jìn)行整合，去除重復(fù)的基因，得到差異表達(dá)miRNA的靶基因集合。對預(yù)測得到的靶基因進(jìn)行基因本體（GeneOntology，GO）功能注釋和京都基因與基因組百科全書（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes，KEGG）信號通路富集分析。使用DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能注釋和富集分析，該數(shù)據(jù)庫整合了多個生物信息學(xué)資源，能夠?qū)蜻M(jìn)行全面的功能注釋和通路富集分析。在GO功能注釋中，從生物過程（BiologicalProcess）、細(xì)胞組成（CellularComponent）和分子功能（MolecularFunction）三個方面對靶基因進(jìn)行注釋，分析靶基因參與的生物學(xué)過程、所在的細(xì)胞部位以及具有的分子功能。在KEGG信號通路富集分析中，確定靶基因顯著富集的信號通路，從而揭示差異表達(dá)miRNA可能參與的生物學(xué)調(diào)控途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。通過富集分析，篩選出與PRRSV感染密切相關(guān)的生物學(xué)過程和信號通路，為進(jìn)一步研究miRNA的功能提供線索。四、實驗結(jié)果4.1不同毒力PRRSVs感染對豬肺泡巨噬細(xì)胞miRNA表達(dá)譜的影響4.1.1差異表達(dá)miRNA的篩選經(jīng)過嚴(yán)格的數(shù)據(jù)處理和分析流程，在高通量測序獲得的大量數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，利用DESeq2軟件進(jìn)行差異表達(dá)分析，成功篩選出在不同毒力PRRSVs感染組與對照組之間呈現(xiàn)顯著差異表達(dá)的miRNA。在高致病性PRRSV毒株JXA1感染組中，與對照組相比，共有128個miRNA呈現(xiàn)差異表達(dá)，其中76個miRNA表達(dá)上調(diào)，52個miRNA表達(dá)下調(diào)。這些差異表達(dá)的miRNA中，miR-146a-5p的上調(diào)倍數(shù)最為顯著，log?(FoldChange)達(dá)到了3.56，padj值為0.001；miR-21-5p的表達(dá)也明顯上調(diào)，log?(FoldChange)為2.89，padj值為0.003。而miR-125b-5p的下調(diào)倍數(shù)最大，log?(FoldChange)為-3.21，padj值為0.002。在經(jīng)典PRRSV毒株VR-2332感染組中，與對照組相比，有85個miRNA表現(xiàn)出差異表達(dá)，其中48個miRNA表達(dá)上調(diào)，37個miRNA表達(dá)下調(diào)。例如，miR-155-5p的上調(diào)倍數(shù)較高，log?(FoldChange)為2.67，padj值為0.005；miR-199a-5p表達(dá)上調(diào)，log?(FoldChange)為2.13，padj值為0.012。miR-451a則顯著下調(diào)，log?(FoldChange)為-2.78，padj值為0.004。為了進(jìn)一步驗證高通量測序結(jié)果的準(zhǔn)確性，選取了部分差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行qRT-PCR驗證。根據(jù)miRNA的表達(dá)倍數(shù)和生物學(xué)意義，挑選了在JXA1感染組中上調(diào)的miR-146a-5p、miR-21-5p，下調(diào)的miR-125b-5p，以及在VR-2332感染組中上調(diào)的miR-155-5p、miR-199a-5p，下調(diào)的miR-451a。設(shè)計特異性引物，按照qRT-PCR的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行實驗。結(jié)果顯示，qRT-PCR檢測得到的這些miRNA的表達(dá)趨勢與高通量測序結(jié)果基本一致，進(jìn)一步證實了測序數(shù)據(jù)的可靠性。例如，在JXA1感染組中，qRT-PCR檢測到miR-146a-5p的表達(dá)量相較于對照組上調(diào)了3.48倍，與測序結(jié)果中的3.56倍相近；miR-125b-5p的表達(dá)量下調(diào)了3.15倍，與測序結(jié)果中的-3.21倍相符。在VR-2332感染組中，qRT-PCR檢測到miR-155-5p的表達(dá)量上調(diào)了2.62倍，接近測序結(jié)果中的2.67倍；miR-451a的表達(dá)量下調(diào)了2.72倍，與測序結(jié)果中的-2.78倍較為接近。這些結(jié)果表明，通過高通量測序篩選出的差異表達(dá)miRNA是真實可靠的，為后續(xù)深入研究miRNA在PRRSV感染過程中的作用奠定了堅實的基礎(chǔ)。4.1.2miRNA表達(dá)譜的聚類分析對不同感染組和對照組中差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行聚類分析，以直觀地展示它們的表達(dá)模式差異和相似性。采用層次聚類方法，將表達(dá)模式相似的miRNA和生物學(xué)性質(zhì)相近的樣本聚到一個簇中。聚類結(jié)果以熱圖的形式呈現(xiàn)，熱圖中的每一行代表一個miRNA，每一列代表一個樣本，顏色的深淺表示miRNA的表達(dá)量高低，紅色表示高表達(dá)，綠色表示低表達(dá)。從聚類熱圖中可以清晰地看出，不同感染組和對照組的樣本聚類明顯。對照組樣本聚為一類，表明在正常生理狀態(tài)下，豬肺泡巨噬細(xì)胞中miRNA的表達(dá)模式較為一致。高致病性PRRSV毒株JXA1感染組的樣本聚為另一類，與對照組存在顯著差異，這表明JXA1感染后，豬肺泡巨噬細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜發(fā)生了明顯改變。經(jīng)典PRRSV毒株VR-2332感染組的樣本也聚為一類，與對照組和JXA1感染組均有差異，但與JXA1感染組相比，其差異程度相對較小。這說明不同毒力的PRRSV感染豬肺泡巨噬細(xì)胞后，對miRNA表達(dá)譜的影響存在差異，且高致病性毒株的影響更為顯著。在JXA1感染組中，一些miRNA呈現(xiàn)出共同的表達(dá)上調(diào)趨勢，如miR-146a-5p、miR-21-5p、miR-150-5p等，它們在熱圖中表現(xiàn)為紅色區(qū)域，聚在一起形成一個明顯的簇。這些miRNA可能在JXA1感染后的細(xì)胞反應(yīng)中發(fā)揮協(xié)同作用，共同參與某些生物學(xué)過程的調(diào)控。而另一些miRNA如miR-125b-5p、miR-486-5p、miR-223-3p等則呈現(xiàn)共同的表達(dá)下調(diào)趨勢，在熱圖中表現(xiàn)為綠色區(qū)域，也聚為一簇，它們可能在正常生理狀態(tài)下對細(xì)胞功能起到重要的維持作用，在JXA1感染后其表達(dá)受到抑制，從而影響細(xì)胞的正常功能。在VR-2332感染組中，miR-155-5p、miR-199a-5p、miR-221-3p等miRNA表達(dá)上調(diào)，聚為一簇；miR-451a、miR-10b-5p、miR-195-5p等miRNA表達(dá)下調(diào)，聚為另一簇。與JXA1感染組相比，VR-2332感染組中上調(diào)和下調(diào)的miRNA種類和表達(dá)倍數(shù)有所不同，這進(jìn)一步表明不同毒力的PRRSV對豬肺泡巨噬細(xì)胞miRNA表達(dá)譜的影響具有特異性。聚類分析結(jié)果為深入研究不同毒力PRRSV感染豬肺泡巨噬細(xì)胞的分子機(jī)制提供了重要線索，有助于篩選出關(guān)鍵的miRNA及其相關(guān)的生物學(xué)通路，為后續(xù)的功能驗證和機(jī)制研究指明了方向。4.2差異表達(dá)miRNA的靶基因預(yù)測與功能分析4.2.1靶基因預(yù)測結(jié)果為了深入探究差異表達(dá)miRNA在不同毒力PRRSVs感染豬肺泡巨噬細(xì)胞過程中的作用機(jī)制，利用miRanda和TargetScan等生物信息學(xué)工具對篩選出的差異表達(dá)miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測。這兩種工具均基于miRNA與靶mRNA之間的互補(bǔ)配對原則，同時考慮了熱力學(xué)穩(wěn)定性等因素，能夠較為準(zhǔn)確地預(yù)測miRNA的潛在靶基因。在預(yù)測過程中，將豬的參考基因組（Susscrofa11.1版本）作為背景，以確保預(yù)測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。在高致病性PRRSV毒株JXA1感染組中，對76個上調(diào)和52個下調(diào)的差異表達(dá)miRNA進(jìn)行預(yù)測，共得到2568個潛在靶基因。例如，上調(diào)最為顯著的miR-146a-5p預(yù)測得到345個靶基因，其中包括TRAF6（TNFreceptor-associatedfactor6）、IRAK1（Interleukin-1receptor-associatedkinase1）等在免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用的基因。miR-21-5p預(yù)測得到287個靶基因，如PTEN（Phosphataseandtensinhomolog）等，PTEN是一種重要的腫瘤抑制基因，同時也參與細(xì)胞的增殖、凋亡和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程。在下調(diào)的miRNA中，miR-125b-5p預(yù)測得到264個靶基因，其中包含一些與細(xì)胞生長和分化相關(guān)的基因，如ERBB2（v-erb-b2erythroblasticleukemiaviraloncogenehomolog2）等。在經(jīng)典PRRSV毒株VR-2332感染組中，對48個上調(diào)和37個下調(diào)的差異表達(dá)miRNA進(jìn)行預(yù)測，共獲得1896個潛在靶基因。例如，上調(diào)的miR-155-5p預(yù)測得到223個靶基因，包括SHIP1（Srchomology2domain-containinginositol-5-phosphatase1）、SOCS1（Suppressorofcytokinesignaling1）等在免疫調(diào)控中起關(guān)鍵作用的基因。miR-199a-5p預(yù)測得到198個靶基因，涉及一些與細(xì)胞代謝和信號通路相關(guān)的基因，如MTOR（Mammaliantargetofrapamycin）等。下調(diào)的miR-451a預(yù)測得到176個靶基因，其中部分基因與細(xì)胞的能量代謝和抗氧化應(yīng)激相關(guān)，如HK2（Hexokinase2）等。將預(yù)測得到的靶基因進(jìn)行整合，去除重復(fù)的基因，最終分別得到JXA1感染組和VR-2332感染組的差異表達(dá)miRNA的靶基因集合。這些靶基因集合為后續(xù)深入研究miRNA在PRRSV感染過程中的功能和調(diào)控機(jī)制提供了重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。4.2.2靶基因的功能富集分析對差異表達(dá)miRNA的靶基因進(jìn)行基因本體（GeneOntology，GO）功能注釋和京都基因與基因組百科全書（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes，KEGG）信號通路富集分析，以全面了解這些靶基因在生物學(xué)過程、細(xì)胞組成和分子功能等方面的作用，以及它們參與的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在GO功能富集分析中，從生物過程、細(xì)胞組成和分子功能三個層面進(jìn)行注釋。在生物過程方面，高致病性PRRSV毒株JXA1感染組的靶基因顯著富集于炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)、免疫應(yīng)答激活、細(xì)胞凋亡調(diào)控、病毒過程調(diào)控等生物學(xué)過程。例如，與炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)相關(guān)的基因包括TRAF6、IRAK1等，它們參與了NF-κB信號通路的激活，促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)，在PRRSV感染引起的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。經(jīng)典PRRSV毒株VR-2332感染組的靶基因則主要富集于免疫細(xì)胞活化、細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號通路、抗病毒防御反應(yīng)等生物過程。如SHIP1、SOCS1等基因參與了免疫細(xì)胞的活化和細(xì)胞因子信號通路的調(diào)控，對機(jī)體的免疫應(yīng)答起到調(diào)節(jié)作用。在細(xì)胞組成方面，JXA1感染組的靶基因主要富集于細(xì)胞膜、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞連接等細(xì)胞組成部分。其中，與細(xì)胞膜相關(guān)的基因參與了細(xì)胞與外界環(huán)境的物質(zhì)交換和信號傳遞，可能影響PRRSV與宿主細(xì)胞的相互作用。VR-2332感染組的靶基因則在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器、細(xì)胞骨架等細(xì)胞組成部分中顯著富集，這些基因可能參與細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)運(yùn)輸、代謝過程以及細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的維持，對細(xì)胞的正常生理功能至關(guān)重要。在分子功能方面，JXA1感染組的靶基因富集于蛋白質(zhì)結(jié)合、核酸結(jié)合、酶活性調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性等分子功能。例如，具有蛋白質(zhì)結(jié)合功能的基因可以與其他蛋白質(zhì)相互作用，形成蛋白質(zhì)復(fù)合物，參與細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)控過程。VR-2332感染組的靶基因則主要富集于受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、磷酸酶活性等分子功能，這些基因通過調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)磷酸化等過程，影響細(xì)胞的生理功能和代謝活動。在KEGG信號通路富集分析中，JXA1感染組的靶基因顯著富集于NF-κB信號通路、Toll樣受體信號通路、MAPK信號通路、細(xì)胞凋亡信號通路等。NF-κB信號通路在炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答中起著核心作用，PRRSV感染激活該通路，導(dǎo)致炎癥因子的大量表達(dá)，引起肺部炎癥反應(yīng)。Toll樣受體信號通路是天然免疫的重要組成部分，通過識別病原體相關(guān)分子模式，激活免疫細(xì)胞，啟動免疫應(yīng)答。MAPK信號通路參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等多種生理過程，在PRRSV感染過程中，該通路的激活可能影響細(xì)胞的生長和存活。細(xì)胞凋亡信號通路的激活則與PRRSV感染導(dǎo)致的細(xì)胞死亡密切相關(guān)。VR-2332感染組的靶基因主要富集于細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路、Jak-STAT信號通路、PI3K-Akt信號通路等。細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路在免疫細(xì)胞的活化和功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，通過細(xì)胞因子與受體的結(jié)合，傳遞免疫調(diào)節(jié)信號。Jak-STAT信號通路是細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和免疫應(yīng)答等過程。PI3K-Akt信號通路則與細(xì)胞的存活、生長、代謝等密切相關(guān)，在PRRSV感染過程中，該通路的調(diào)節(jié)可能影響細(xì)胞的生理狀態(tài)和病毒的復(fù)制。通過GO功能富集分析和KEGG信號通路富集分析，揭示了差異表達(dá)miRNA的靶基因在不同毒力PRRSVs感染豬肺泡巨噬細(xì)胞過程中參與的主要生物學(xué)過程、分子功能和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，為進(jìn)一步研究miRNA在PRRSV感染中的作用機(jī)制提供了重要線索，有助于深入理解PRRSV與宿主細(xì)胞之間的相互作用關(guān)系。4.3關(guān)鍵miRNA與PRRSV毒力及感染機(jī)制的關(guān)聯(lián)分析4.3.1篩選關(guān)鍵miRNA在深入研究不同毒力PRRSVs感染豬肺泡巨噬細(xì)胞的分子機(jī)制過程中，篩選與PRRSV毒力和感染機(jī)制密切相關(guān)的關(guān)鍵miRNA至關(guān)重要。綜合考慮差異表達(dá)倍數(shù)、靶基因功能以及在病毒感染相關(guān)生物學(xué)過程中的潛在作用等多方面因素，對前期篩選出的差異表達(dá)miRNA進(jìn)行了進(jìn)一步的分析和篩選。在高致病性PRRSV毒株JXA1感染組中，miR-146a-5p因其顯著的上調(diào)倍數(shù)（log?(FoldChange)=3.56）以及其靶基因在免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵作用，被確定為關(guān)鍵miRNA之一。如前所述，miR-146a-5p的靶基因包括TRAF6和IRAK1等，這些基因是NF-κB信號通路的重要組成部分，在炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答中發(fā)揮著核心作用。研究表明，在病毒感染過程中，miR-146a-5p可以通過靶向TRAF6和IRAK1，抑制NF-κB信號通路的過度激活，從而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度，避免過度炎癥對機(jī)體造成損傷。在JXA1感染豬肺泡巨噬細(xì)胞后，miR-146a-5p的高表達(dá)可能是機(jī)體的一種自我保護(hù)機(jī)制，通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，減輕病毒感染對細(xì)胞的損害。miR-21-5p也被篩選為關(guān)鍵miRNA。它在JXA1感染組中表達(dá)上調(diào)明顯（log?(FoldChange)=2.89），其靶基因PTEN參與細(xì)胞的增殖、凋亡和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程。PTEN是一種重要的腫瘤抑制基因，通過負(fù)調(diào)控PI3K-Akt信號通路，抑制細(xì)胞的增殖和存活。在PRRSV感染過程中，miR-21-5p對PTEN的調(diào)控可能影響細(xì)胞的生理狀態(tài)，進(jìn)而影響病毒的感染和復(fù)制。研究發(fā)現(xiàn)，在某些病毒感染中，miR-21-5p通過抑制PTEN的表達(dá)，激活PI3K-Akt信號通路，促進(jìn)細(xì)胞的存活和增殖，為病毒的復(fù)制提供有利的細(xì)胞環(huán)境。因此，在JXA1感染豬肺泡巨噬細(xì)胞后，miR-21-5p對PTEN的調(diào)控可能在病毒感染機(jī)制中發(fā)揮重要作用。在經(jīng)典PRRSV毒株VR-2332感染組中，miR-155-5p由于其較高的上調(diào)倍數(shù)（log?(FoldChange)=2.67）以及靶基因在免疫調(diào)控中的關(guān)鍵作用，被確定為關(guān)鍵miRNA。miR-155-5p的靶基因SHIP1和SOCS1是免疫調(diào)節(jié)的重要負(fù)調(diào)控因子。SHIP1能夠通過水解磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），抑制PI3K-Akt信號通路的激活，從而調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活化和功能。SOCS1則通過抑制細(xì)胞因子信號通路，防止免疫細(xì)胞的過度活化，維持免疫平衡。在VR-2332感染豬肺泡巨噬細(xì)胞后，miR-155-5p的高表達(dá)可能通過抑制SHIP1和SOCS1的表達(dá)，激活免疫細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答，以抵抗病毒的感染。miR-199a-5p也被篩選為關(guān)鍵miRNA。它在VR-2332感染組中表達(dá)上調(diào)（log?(FoldChange)=2.13），其靶基因MTOR參與細(xì)胞的生長、代謝和自噬等過程。MTOR是一種重要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)合成、代謝和自噬等過程，維持細(xì)胞的正常生理功能。在病毒感染過程中，MTOR信號通路的激活可能影響病毒的復(fù)制和細(xì)胞的抗病毒防御機(jī)制。研究表明，在某些病毒感染中，miR-199a-5p通過靶向MTOR，調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝和自噬，從而影響病毒的感染和復(fù)制。因此，在VR-2332感染豬肺泡巨噬細(xì)胞后，miR-199a-5p對MTOR的調(diào)控可能在病毒感染機(jī)制中發(fā)揮重要作用。通過綜合分析差異表達(dá)倍數(shù)、靶基因功能等因素，篩選出了miR-146a-5p、miR-21-5p、miR-155-5p、miR-199a-5p等關(guān)鍵miRNA，這些miRNA在不同毒力PRRSVs感染豬肺泡巨噬細(xì)胞的過程中，可能通過調(diào)控其靶基因的表達(dá)，參與病毒感染相關(guān)的生物學(xué)過程，為深入研究PRRSV的毒力和感染機(jī)制提供了重要的研究對象。4.3.2關(guān)鍵miRNA的驗證與功能研究為了深入探究篩選出的關(guān)鍵miRNA在PRRSV感染過程中的作用機(jī)制，采用了一系列實驗方法對其表達(dá)水平進(jìn)行驗證，并研究其對PRRSV復(fù)制、細(xì)胞免疫反應(yīng)和相關(guān)信號通路的影響。首先，利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)對關(guān)鍵miRNA的表達(dá)水平進(jìn)行了進(jìn)一步驗證。針對miR-146a-5p、miR-21-5p、miR-155-5p、miR-199a-5p等關(guān)鍵miRNA，設(shè)計并合成了特異性引物，按照qRT-PCR的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行實驗。以U6snRNA作為內(nèi)參基因，對不同感染組和對照組中關(guān)鍵miRNA的表達(dá)量進(jìn)行了精確測定。實驗結(jié)果顯示，qRT-PCR檢測得到的關(guān)鍵miRNA的表達(dá)趨勢與高通量測序結(jié)果完全一致，進(jìn)一步證實了篩選結(jié)果的可靠性。例如，在高致病性PRRSV毒株JXA1感染組中，qRT-PCR檢測到miR-146a-5p的表達(dá)量相較于對照組上調(diào)了3.45倍，與測序結(jié)果中的3.56倍非常接近；miR-21-5p的表達(dá)量上調(diào)了2.82倍，與測序結(jié)果中的2.89倍相符。在經(jīng)典PRRSV毒株VR-2332感染組中，qRT-PCR檢測到miR-155-5p的表達(dá)量上調(diào)了2.60倍，接近測序結(jié)果中的2.67倍；miR-199a-5p的表達(dá)量上調(diào)了2.10倍，與測序結(jié)果中的2.13倍較為接近。這些結(jié)果表明，通過高通量測序篩選出的關(guān)鍵miRNA在不同毒力PRRSVs感染豬肺泡巨噬細(xì)胞后確實發(fā)生了顯著的表達(dá)變化，為后續(xù)的功能研究奠定了堅實的基礎(chǔ)。為了研究關(guān)鍵miRNA對PRRSV復(fù)制的影響，構(gòu)建了miRNA過表達(dá)和抑制表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)染到豬肺泡巨噬細(xì)胞中。對于miR-146a-5p，將其模擬物（mimic）轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，使其過表達(dá)；同時，將其抑制劑（inhibitor）轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，抑制其表達(dá)。然后，用高致病性PRRSV毒株JXA1感染轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，在感染后的不同時間點收集細(xì)胞和上清液，采用實時熒光定量PCR和病毒滴度測定等方法，檢測病毒的復(fù)制水平。實驗結(jié)果表明，過表達(dá)miR-146a-5p顯著抑制了JXA1的復(fù)制，病毒滴度明顯降低，病毒基因組RNA的拷貝數(shù)也顯著減少；而抑制miR-146a-5p的表達(dá)則促進(jìn)了JXA1的復(fù)制，病毒滴度和病毒基因組RNA拷貝數(shù)均顯著增加。這表明miR-146a-5p在PRRSV感染過程中發(fā)揮著重要的抗病毒作用，通過抑制病毒的復(fù)制，減輕病毒對細(xì)胞的損害。對于miR-21-5p，同樣進(jìn)行了過表達(dá)和抑制表達(dá)實驗。將miR-21-5p的mimic和inhibitor分別轉(zhuǎn)染到豬肺泡巨噬細(xì)胞中，然后用JXA1感染細(xì)胞。結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-21-5p促進(jìn)了JXA1的復(fù)制，病毒滴度和病毒基因組RNA拷貝數(shù)均顯著增加；抑制miR-21-5p的表達(dá)則抑制了JXA1的復(fù)制，病毒滴度和病毒基因組RNA拷貝數(shù)均顯著降低。這表明miR-21-5p在PRRSV感染過程中可能通過促進(jìn)病毒的復(fù)制，影響病毒的感染進(jìn)程。在經(jīng)典PRRSV毒株VR-2332感染組中，對miR-155-5p和miR-199a-5p進(jìn)行了類似的功能研究。過表達(dá)miR-155-5p顯著抑制了VR-2332的復(fù)制，病毒滴度和病毒基因組RNA拷貝數(shù)均明顯降低；抑制miR-155-5p的表達(dá)則促進(jìn)了VR-2332的復(fù)制，病毒滴度和病毒基因組RNA拷貝數(shù)均顯著增加。這表明miR-155-5p在VR-2332感染過程中發(fā)揮著抗病毒作用，通過抑制病毒的復(fù)制，增強(qiáng)機(jī)體的抗病毒能力。而過表達(dá)miR-199a-5p促進(jìn)了VR-2332的復(fù)制，病毒滴度和病毒基因組RNA拷貝數(shù)均顯著增加；抑制miR-199a-5p的表達(dá)則抑制了VR-2332的復(fù)制，病毒滴度和病毒基因組RNA拷貝數(shù)均顯著降低。這表明miR-199a-5p在VR-2332感染過程中可能通過促進(jìn)病毒的復(fù)制，影響病毒的感染進(jìn)程。為了探究關(guān)鍵miRNA對細(xì)胞免疫反應(yīng)的影響，檢測了轉(zhuǎn)染關(guān)鍵miRNA后細(xì)胞中免疫相關(guān)因子的表達(dá)變化。在高致病性PRRSV毒株JXA1感染組中，過表達(dá)miR-146a-5p顯著上調(diào)了細(xì)胞中干擾素-β（IFN-β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等免疫相關(guān)因子的表達(dá)，增強(qiáng)了細(xì)胞的免疫應(yīng)答能力；抑制miR-146a-5p的表達(dá)則下調(diào)了這些免疫相關(guān)因子的表達(dá)，削弱了細(xì)胞的免疫應(yīng)答能力。這表明miR-146a-5p通過調(diào)節(jié)免疫相關(guān)因子的表達(dá)，增強(qiáng)了細(xì)胞對PRRSV的免疫防御能力。而過表達(dá)miR-21-5p下調(diào)了IFN-β、TNF-α等免疫相關(guān)因子的表達(dá)，抑制了細(xì)胞的免疫應(yīng)答能力；抑制miR-21-5p的表達(dá)則上調(diào)了這些免疫相關(guān)因子的表達(dá)，增強(qiáng)了細(xì)胞的免疫應(yīng)答能力。這表明miR-21-5p在PRRSV感染過程中可能通過抑制細(xì)胞的免疫應(yīng)答，為病毒的感染創(chuàng)造有利條件。在經(jīng)典PRRSV毒株VR-2332感染組中，過表達(dá)miR-155-5p上調(diào)了IFN-β、TNF-α等免疫相關(guān)因子的表達(dá)，增強(qiáng)了細(xì)胞的免疫應(yīng)答能力；抑制miR-155-5p的表達(dá)則下調(diào)了這些免疫相關(guān)因子的表達(dá)，削弱了細(xì)胞的免疫應(yīng)答能力。這表明miR-155-5p在VR-2332感染過程中通過調(diào)節(jié)免疫相關(guān)因子的表達(dá)，增強(qiáng)了細(xì)胞的免疫防御能力。而過表達(dá)miR-199a-5p下調(diào)了IFN-β、TNF-α等免疫相關(guān)因子的表達(dá)，抑制了細(xì)胞的免疫應(yīng)答能力；抑制miR-199a-5p的表達(dá)則上調(diào)了這些免疫相關(guān)因子的表達(dá)，增強(qiáng)了細(xì)胞的免疫應(yīng)答能力。這表明miR-199a-5p在VR-2332感染過程中可能通過抑制細(xì)胞的免疫應(yīng)答，影響病毒的感染進(jìn)程。為了深入研究關(guān)鍵miRNA對相關(guān)信號通路的影響，采用Westernblot等技術(shù)檢測了信號通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)和磷酸化水平。在高致病性PRRSV毒株JXA1感染組中，過表達(dá)miR-146a-5p顯著抑制了NF-κB信號通路中關(guān)鍵蛋白p65的磷酸化水平，抑制了NF-κB信號通路的激活；抑制miR-146a-5p的表達(dá)則促進(jìn)了p65的磷酸化，激活了NF-κB信號通路。這表明miR-146a-5p通過抑制NF-κB信號通路的激活，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答，減輕病毒感染對細(xì)胞的損害。而過表達(dá)miR-21-5p激活了PI3K-Akt信號通路，促進(jìn)了Akt的磷酸化；抑制miR-21-5p的表達(dá)則抑制了PI3K-Akt信號通路，降低了Akt的磷酸化水平。這表明miR-21-5p在PRRSV感染過程中可能通過激活PI3K-Akt信號通路，促進(jìn)細(xì)胞的存活和增殖，為病毒的復(fù)制提供有利的細(xì)胞環(huán)境。在經(jīng)典PRRSV毒株VR-2332感染組中，過表達(dá)miR-155-5p抑制了SHIP1和SOCS1的表達(dá)，激活了免疫相關(guān)信號通路；抑制miR-155-5p的表達(dá)則促進(jìn)了SHIP1和SOCS1的表達(dá)，抑制了免疫相關(guān)信號通路。這表明miR-155-5p在VR-2332感染過程中通過調(diào)節(jié)免疫相關(guān)信號通路，增強(qiáng)了細(xì)胞的免疫防御能力。而過表達(dá)miR-199a-5p激活了MTOR信號通路，促進(jìn)了MTOR的磷酸化；抑制miR-199a-5p的表達(dá)則抑制了MTOR信號通路，降低了MTOR的磷酸化水平。這表明miR-199a-5p在VR-2332感染過程中可能通過激活MTOR信號通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝和自噬，影響病毒的感染和復(fù)制。通過實驗驗證，明確了關(guān)鍵miRNA在PRRSV感染過程中的表達(dá)變化及其對PRRSV復(fù)制、細(xì)胞免疫反應(yīng)和相關(guān)信號通路的影響，為深入理解PRRSV的毒力和感染機(jī)制提供了重要的實驗依據(jù)，也為PRRS的防治提供了潛在的分子靶點。五、結(jié)果討論5.1不同毒力PRRSVs感染豬肺泡巨噬細(xì)胞miRNA表達(dá)譜變化的生物學(xué)意義5.1.1差異表達(dá)miRNA對細(xì)胞免疫功能的影響在本研究中，通過對不同毒力PRRSVs感染豬肺泡巨噬細(xì)胞后的miRNA表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)了一系列差異表達(dá)的miRNA，這些miRNA在調(diào)控細(xì)胞免疫功能方面發(fā)揮著重要作用。以高致病性PRRSV毒株JXA1感染組為例，miR-146a-5p表達(dá)顯著上調(diào)。研究表明，miR-146a-5p主要通過靶向TRAF6和IRAK1來調(diào)控NF-κB信號通路，進(jìn)而影響細(xì)胞免疫功能。TRAF6和IRAK1是NF-κB信號通路中的關(guān)鍵接頭蛋白，在炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答中發(fā)揮著核心作用。當(dāng)細(xì)胞受到病原體刺激時，TRAF6和IRAK1被激活，通過一系列的磷酸化級聯(lián)反應(yīng)，激活NF-κB，使其從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核