基于microRNA調(diào)控的溶瘤腺病毒靶向腫瘤細(xì)胞的機(jī)制與應(yīng)用研究一、引言1.1研究背景與意義腫瘤作為嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病，其發(fā)病率和死亡率一直居高不下。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，全球新增癌癥病例1929萬例，癌癥死亡病例996萬例。盡管當(dāng)前腫瘤治療手段豐富多樣，包括手術(shù)、化療、放療、靶向治療以及免疫治療等，但這些傳統(tǒng)治療方法都存在一定的局限性。手術(shù)治療對(duì)于一些晚期或轉(zhuǎn)移性腫瘤往往難以徹底切除，且手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)較高，對(duì)患者身體創(chuàng)傷較大；化療在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成損害，引發(fā)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等，導(dǎo)致患者生活質(zhì)量下降，甚至部分患者因無法耐受化療副作用而中斷治療；放療則對(duì)腫瘤的定位和照射范圍要求嚴(yán)格，容易損傷周圍正常組織，且對(duì)于一些對(duì)放療不敏感的腫瘤，治療效果不佳。靶向治療雖然能夠特異性地作用于腫瘤細(xì)胞的某些靶點(diǎn)，但腫瘤細(xì)胞容易產(chǎn)生耐藥性，使得治療效果逐漸減弱；免疫治療雖在部分腫瘤治療中取得了顯著進(jìn)展，但并非對(duì)所有患者都有效，且可能引發(fā)免疫相關(guān)的不良反應(yīng)。因此，尋找更加有效、安全且特異性高的腫瘤治療方法迫在眉睫。溶瘤腺病毒作為一種新興的腫瘤治療手段，近年來受到了廣泛關(guān)注。溶瘤腺病毒是通過基因工程技術(shù)對(duì)天然腺病毒進(jìn)行改造而得到的，它能夠特異性地識(shí)別并感染腫瘤細(xì)胞，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和增殖，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞裂解死亡，而對(duì)正常細(xì)胞的影響較小。這種特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的特性，使得溶瘤腺病毒在腫瘤治療中具有獨(dú)特的優(yōu)勢，為腫瘤患者帶來了新的希望。然而，目前溶瘤腺病毒治療仍面臨一些挑戰(zhàn)，其中關(guān)鍵問題之一就是如何進(jìn)一步提高其靶向性和療效。MicroRNA（miRNA）是一類長度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，廣泛存在于真核生物中。它們通過與靶基因mRNA的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補(bǔ)配對(duì)，抑制mRNA的翻譯過程或促使其降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥等過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。不同的miRNA在腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞中的表達(dá)水平存在顯著差異，這為利用miRNA來調(diào)控溶瘤腺病毒提供了理論基礎(chǔ)。通過將miRNA調(diào)控元件引入溶瘤腺病毒載體中，能夠使溶瘤腺病毒更加精準(zhǔn)地識(shí)別腫瘤細(xì)胞，避免對(duì)正常細(xì)胞的誤殺，從而提高治療的安全性和有效性?；谝陨媳尘?，本研究聚焦于基于microRNA調(diào)控靶向腫瘤細(xì)胞的溶瘤腺病毒，旨在深入探究miRNA調(diào)控溶瘤腺病毒的作用機(jī)制，優(yōu)化溶瘤腺病毒載體的設(shè)計(jì)，提高其對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向性和殺傷效果，為腫瘤的治療提供新的策略和方法。這不僅具有重要的理論意義，能夠豐富我們對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制以及溶瘤腺病毒治療原理的認(rèn)識(shí)，還具有廣闊的臨床應(yīng)用前景，有望為廣大腫瘤患者帶來更加有效的治療手段，改善他們的生存質(zhì)量和預(yù)后情況。1.2研究目的與內(nèi)容本研究的核心目的在于深入探究基于microRNA調(diào)控靶向腫瘤細(xì)胞的溶瘤腺病毒，從作用機(jī)制、載體優(yōu)化到治療效果評(píng)估等多方面展開系統(tǒng)研究，為腫瘤治療提供新的有效策略。具體研究內(nèi)容涵蓋以下幾個(gè)關(guān)鍵方面：篩選并鑒定用于調(diào)控溶瘤腺病毒的關(guān)鍵microRNA：通過對(duì)多種腫瘤細(xì)胞系和正常細(xì)胞系的基因表達(dá)譜分析，運(yùn)用生物信息學(xué)工具和高通量測序技術(shù)，全面篩選在腫瘤細(xì)胞中差異表達(dá)顯著的microRNA。對(duì)篩選出的microRNA進(jìn)行功能驗(yàn)證，采用基因編輯技術(shù)，如CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除或過表達(dá)特定的microRNA，觀察其對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，包括細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等能力的變化。深入研究這些microRNA與腫瘤相關(guān)信號(hào)通路的關(guān)系，運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，檢測相關(guān)信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白和基因的表達(dá)水平，明確其在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的調(diào)控機(jī)制。構(gòu)建基于microRNA調(diào)控的溶瘤腺病毒載體：運(yùn)用基因工程技術(shù)，將篩選出的關(guān)鍵microRNA的調(diào)控元件精準(zhǔn)地插入到溶瘤腺病毒載體的特定位置。例如，在腺病毒的E1A基因區(qū)域引入microRNA響應(yīng)元件，使溶瘤腺病毒在正常細(xì)胞中由于microRNA的作用而受到抑制，無法有效復(fù)制；而在腫瘤細(xì)胞中，由于microRNA表達(dá)水平的差異，溶瘤腺病毒能夠解除抑制，實(shí)現(xiàn)特異性復(fù)制。對(duì)構(gòu)建好的溶瘤腺病毒載體進(jìn)行全面的生物學(xué)特性鑒定，包括病毒的滴度測定、感染效率評(píng)估、穩(wěn)定性分析等。采用斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)等方法，確保載體的性能符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用的要求。研究溶瘤腺病毒在腫瘤細(xì)胞中的靶向性和復(fù)制機(jī)制：通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，利用熒光標(biāo)記技術(shù)，如綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記溶瘤腺病毒，直觀地觀察其在不同細(xì)胞系中的感染和復(fù)制情況。運(yùn)用共聚焦顯微鏡等設(shè)備，追蹤病毒在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸路徑、基因表達(dá)和病毒粒子的產(chǎn)生過程。深入探究溶瘤腺病毒在腫瘤細(xì)胞中特異性復(fù)制的分子機(jī)制，研究microRNA調(diào)控元件與腺病毒自身基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)之間的相互作用。通過基因芯片分析、蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)，全面揭示在腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞中，溶瘤腺病毒復(fù)制相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)差異，以及這些差異如何受到microRNA的調(diào)控。評(píng)估溶瘤腺病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果和體內(nèi)抗腫瘤作用：在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，采用多種細(xì)胞毒性檢測方法，如MTT法、CCK-8法、LDH釋放實(shí)驗(yàn)等，精確測定溶瘤腺病毒對(duì)不同腫瘤細(xì)胞系的殺傷活性。通過繪制細(xì)胞生長曲線、計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）等指標(biāo)，評(píng)估其殺傷效果的強(qiáng)弱。建立多種腫瘤動(dòng)物模型，如小鼠皮下移植瘤模型、原位腫瘤模型等，將構(gòu)建的溶瘤腺病毒通過瘤內(nèi)注射、靜脈注射等不同途徑給藥，觀察腫瘤的生長情況。定期測量腫瘤體積、繪制腫瘤生長曲線，評(píng)估溶瘤腺病毒在體內(nèi)的抗腫瘤效果。對(duì)荷瘤動(dòng)物進(jìn)行生存分析，統(tǒng)計(jì)不同治療組動(dòng)物的生存時(shí)間和生存率，進(jìn)一步驗(yàn)證溶瘤腺病毒的治療效果。同時(shí)，通過組織病理學(xué)檢查、免疫組化分析等方法，觀察腫瘤組織的病理變化、免疫細(xì)胞浸潤情況以及相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)變化，深入探究其抗腫瘤作用機(jī)制。探索溶瘤腺病毒與其他治療方法的聯(lián)合應(yīng)用策略：考慮到腫瘤治療的復(fù)雜性和多樣性，單一治療方法往往難以取得理想的效果。因此，本研究將探索溶瘤腺病毒與化療、放療、免疫治療等其他常規(guī)腫瘤治療方法的聯(lián)合應(yīng)用策略。在體外實(shí)驗(yàn)中，研究溶瘤腺病毒與化療藥物或放療聯(lián)合使用對(duì)腫瘤細(xì)胞的協(xié)同殺傷作用。通過設(shè)置不同的藥物濃度和照射劑量，觀察聯(lián)合治療對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響，確定最佳的聯(lián)合治療方案。在體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，驗(yàn)證聯(lián)合治療策略的有效性和安全性。觀察聯(lián)合治療對(duì)腫瘤生長的抑制作用、對(duì)動(dòng)物生存時(shí)間的延長效果以及對(duì)機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)作用。同時(shí)，監(jiān)測聯(lián)合治療過程中可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)，評(píng)估其對(duì)動(dòng)物健康的影響。通過分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，深入研究聯(lián)合治療的協(xié)同作用機(jī)制。探討溶瘤腺病毒如何增強(qiáng)化療藥物的敏感性、提高放療的療效以及激活機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，為臨床腫瘤聯(lián)合治療提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)支持。1.3研究方法與技術(shù)路線文獻(xiàn)調(diào)研：全面收集國內(nèi)外關(guān)于microRNA、溶瘤腺病毒以及腫瘤治療等相關(guān)領(lǐng)域的研究文獻(xiàn)，涵蓋學(xué)術(shù)期刊論文、學(xué)位論文、研究報(bào)告和專利等多種類型。運(yùn)用文獻(xiàn)計(jì)量分析、知識(shí)圖譜構(gòu)建等方法，對(duì)文獻(xiàn)進(jìn)行系統(tǒng)梳理和深入分析，了解研究現(xiàn)狀、熱點(diǎn)和發(fā)展趨勢，為研究提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和前沿的研究思路。實(shí)驗(yàn)研究：細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：培養(yǎng)多種腫瘤細(xì)胞系和正常細(xì)胞系，包括肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、肝癌細(xì)胞系HepG2以及人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B、人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF10A、人正常肝細(xì)胞L02等。采用CCK-8法、EdU染色實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力；通過AnnexinV-FITC/PI雙染法、TUNEL染色實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞凋亡情況；運(yùn)用Transwell實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞遷移和侵襲能力。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：構(gòu)建小鼠皮下移植瘤模型和原位腫瘤模型，如將A549細(xì)胞接種到BALB/c裸鼠皮下構(gòu)建肺癌皮下移植瘤模型，將MCF-7細(xì)胞接種到雌性BALB/c裸鼠乳腺脂肪墊構(gòu)建乳腺癌原位模型。對(duì)荷瘤小鼠進(jìn)行分組，分別給予不同處理，如溶瘤腺病毒組、對(duì)照組（給予生理鹽水或空病毒載體）、聯(lián)合治療組（溶瘤腺病毒與化療藥物或放療聯(lián)合）。定期測量腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線；對(duì)荷瘤動(dòng)物進(jìn)行生存分析，統(tǒng)計(jì)生存時(shí)間和生存率；通過組織病理學(xué)檢查、免疫組化分析等方法，觀察腫瘤組織的病理變化、免疫細(xì)胞浸潤情況以及相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)變化。病毒實(shí)驗(yàn)：運(yùn)用基因工程技術(shù)構(gòu)建溶瘤腺病毒載體，采用同源重組法將目的基因片段與腺病毒骨架載體進(jìn)行重組。通過轉(zhuǎn)染技術(shù)將重組質(zhì)粒導(dǎo)入HEK293細(xì)胞中進(jìn)行病毒包裝和擴(kuò)增，采用氯化銫密度梯度離心法純化病毒。對(duì)構(gòu)建好的溶瘤腺病毒進(jìn)行生物學(xué)特性鑒定，包括病毒滴度測定（采用TCID50法）、感染效率評(píng)估（通過流式細(xì)胞術(shù)檢測感染細(xì)胞的比例）、穩(wěn)定性分析（在不同條件下保存病毒，定期檢測病毒滴度）等。數(shù)據(jù)分析：使用GraphPadPrism、SPSS等統(tǒng)計(jì)分析軟件，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，確定數(shù)據(jù)的顯著性差異。采用Origin軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化處理，繪制柱狀圖、折線圖、散點(diǎn)圖等，直觀展示實(shí)驗(yàn)結(jié)果。運(yùn)用生物信息學(xué)工具，如miRBase、TargetScan、DAVID等，對(duì)microRNA的靶基因進(jìn)行預(yù)測和功能富集分析，深入挖掘數(shù)據(jù)背后的生物學(xué)意義。本研究的技術(shù)路線如圖1-1所示，首先通過文獻(xiàn)調(diào)研明確研究方向和關(guān)鍵問題，然后進(jìn)行關(guān)鍵microRNA的篩選與鑒定，運(yùn)用生物信息學(xué)分析和高通量測序技術(shù)篩選差異表達(dá)的microRNA，并通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其功能。接著構(gòu)建基于microRNA調(diào)控的溶瘤腺病毒載體，對(duì)載體進(jìn)行生物學(xué)特性鑒定。之后開展溶瘤腺病毒在腫瘤細(xì)胞中的靶向性和復(fù)制機(jī)制研究，以及對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果和體內(nèi)抗腫瘤作用評(píng)估，通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。最后探索溶瘤腺病毒與其他治療方法的聯(lián)合應(yīng)用策略，同樣通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究。在整個(gè)研究過程中，不斷對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和總結(jié)，為研究提供有力支持。[此處插入技術(shù)路線圖1-1]二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1腫瘤細(xì)胞特性及治療挑戰(zhàn)2.1.1腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性腫瘤細(xì)胞具有一系列獨(dú)特的生物學(xué)特性，這些特性使得腫瘤的治療面臨巨大挑戰(zhàn)。腫瘤細(xì)胞最為顯著的特征之一是異常增殖。正常細(xì)胞的增殖受到機(jī)體嚴(yán)格的調(diào)控，遵循著特定的細(xì)胞周期規(guī)律，在生長因子、抑癌基因和癌基因等多種因素的精密調(diào)節(jié)下，維持著細(xì)胞數(shù)量的平衡。然而，腫瘤細(xì)胞卻擺脫了這種調(diào)控機(jī)制，獲得了無限增殖的能力。這主要是由于腫瘤細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了多種基因突變，導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控異常。例如，癌基因的激活和抑癌基因的失活，使得細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的表達(dá)和活性發(fā)生改變，細(xì)胞周期進(jìn)程被打亂，腫瘤細(xì)胞能夠持續(xù)不斷地進(jìn)行分裂和增殖。以乳腺癌細(xì)胞為例，研究發(fā)現(xiàn)許多乳腺癌細(xì)胞中存在HER2基因的擴(kuò)增和過表達(dá)，HER2蛋白作為一種受體酪氨酸激酶，能夠激活下游的多條信號(hào)通路，如RAS-MAPK、PI3K-AKT等，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活。此外，腫瘤細(xì)胞還能夠分泌多種生長因子，形成自分泌和旁分泌的生長刺激環(huán)路，進(jìn)一步促進(jìn)自身的增殖。腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力也是其難以治療的重要原因之一。腫瘤細(xì)胞在局部生長過程中，會(huì)逐漸侵犯周圍的正常組織，突破基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的限制，向周圍組織浸潤。這一過程涉及腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)成分之間的相互作用，以及腫瘤細(xì)胞分泌的多種蛋白酶對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解。腫瘤細(xì)胞能夠表達(dá)多種整合素等黏附分子，與細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白、纖連蛋白等結(jié)合，增強(qiáng)細(xì)胞的黏附能力，同時(shí)激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲。腫瘤細(xì)胞還會(huì)分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等蛋白酶，降解細(xì)胞外基質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞的遷移開辟道路。腫瘤細(xì)胞還能夠通過血液循環(huán)或淋巴循環(huán)轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處的器官，形成新的轉(zhuǎn)移灶。在轉(zhuǎn)移過程中，腫瘤細(xì)胞需要經(jīng)歷脫離原發(fā)灶、進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)、在循環(huán)系統(tǒng)中存活、穿出血管壁以及在遠(yuǎn)處器官定植和生長等多個(gè)步驟。這一過程涉及腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞、血小板等的相互作用，以及腫瘤細(xì)胞對(duì)新環(huán)境的適應(yīng)能力。例如，腫瘤細(xì)胞能夠分泌血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等促血管生成因子，促進(jìn)腫瘤血管的生成，為腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)提供途徑。腫瘤細(xì)胞還能夠通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，增強(qiáng)其遷移和侵襲能力，更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。腫瘤細(xì)胞的代謝異常也是其重要的生物學(xué)特性之一。腫瘤細(xì)胞在代謝方面表現(xiàn)出與正常細(xì)胞明顯不同的特征，其中最為典型的是Warburg效應(yīng)，即腫瘤細(xì)胞即使在有氧條件下也主要通過糖酵解途徑產(chǎn)生能量，而不是進(jìn)行正常的有氧氧化。這種代謝方式的改變使得腫瘤細(xì)胞能夠快速攝取葡萄糖，滿足其快速增殖對(duì)能量和生物合成前體物質(zhì)的需求。腫瘤細(xì)胞還會(huì)攝取大量的氨基酸、脂肪酸等營養(yǎng)物質(zhì)，用于合成蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等生物大分子，以支持細(xì)胞的生長和增殖。腫瘤細(xì)胞的代謝異常還會(huì)導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境的改變，如乳酸堆積、pH值降低等，這些改變不僅有利于腫瘤細(xì)胞的生長和存活，還會(huì)影響腫瘤細(xì)胞對(duì)治療的敏感性，以及腫瘤免疫微環(huán)境。例如，酸性的腫瘤微環(huán)境能夠抑制免疫細(xì)胞的活性，使得腫瘤細(xì)胞能夠逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視。2.1.2現(xiàn)有腫瘤治療方法的局限性目前，腫瘤的治療方法主要包括手術(shù)、放療、化療等傳統(tǒng)治療手段，以及免疫治療、靶向治療等新型療法。然而，這些治療方法都存在一定的局限性。手術(shù)治療是早期腫瘤的主要治療方法之一，通過切除腫瘤組織，能夠直接去除腫瘤病灶，在一定程度上提高患者的治愈率。但對(duì)于一些晚期腫瘤患者，由于腫瘤已經(jīng)發(fā)生了廣泛的轉(zhuǎn)移，手術(shù)往往難以徹底切除腫瘤組織，且手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)較高，對(duì)患者身體創(chuàng)傷較大，術(shù)后可能會(huì)出現(xiàn)感染、出血、器官功能受損等并發(fā)癥，影響患者的生活質(zhì)量和預(yù)后。對(duì)于一些位于重要器官或部位的腫瘤，如腦部腫瘤、胰腺癌等，手術(shù)切除難度大，且容易損傷周圍正常組織，導(dǎo)致嚴(yán)重的后果。放療是利用高能射線殺死腫瘤細(xì)胞的一種治療方法，通過精確的定位和照射，能夠?qū)δ[瘤組織進(jìn)行局部治療。放療對(duì)于一些對(duì)射線敏感的腫瘤，如鼻咽癌、淋巴瘤等，具有較好的治療效果。但放療也存在一定的局限性，它不僅會(huì)殺傷腫瘤細(xì)胞，還會(huì)對(duì)周圍正常組織造成損傷，引發(fā)放射性炎癥、纖維化等不良反應(yīng)。放療的療效還受到腫瘤細(xì)胞的放射敏感性、腫瘤的位置和大小等因素的影響，對(duì)于一些對(duì)放療不敏感的腫瘤，如腎癌、肝癌等，放療的效果往往不理想。此外，放療還可能導(dǎo)致二次腫瘤的發(fā)生，增加患者的健康風(fēng)險(xiǎn)。化療是使用化學(xué)藥物殺死腫瘤細(xì)胞的治療方法，通過靜脈注射、口服或局部給藥等方式，使藥物進(jìn)入體內(nèi)，作用于腫瘤細(xì)胞。化療藥物能夠干擾腫瘤細(xì)胞的DNA合成、細(xì)胞分裂和代謝等過程，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長和增殖?；熢谥委熞恍┤硇阅[瘤，如白血病、淋巴瘤等方面具有重要作用，也可用于手術(shù)后的輔助治療，降低腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。然而，化療藥物缺乏特異性，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成損害，尤其是對(duì)那些增殖旺盛的正常細(xì)胞，如骨髓造血細(xì)胞、胃腸道黏膜細(xì)胞、毛囊細(xì)胞等，引發(fā)一系列嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制、免疫功能下降等。這些不良反應(yīng)不僅會(huì)降低患者的生活質(zhì)量，還可能導(dǎo)致患者無法耐受化療，被迫中斷治療，影響治療效果。此外，腫瘤細(xì)胞還容易對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性，使得化療的療效逐漸降低。腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制較為復(fù)雜，包括藥物外排增加、藥物靶點(diǎn)改變、DNA修復(fù)能力增強(qiáng)、細(xì)胞凋亡途徑受阻等，這給腫瘤的化療帶來了極大的挑戰(zhàn)。免疫治療是近年來腫瘤治療領(lǐng)域的一項(xiàng)重大突破，通過激活機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)來識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞。免疫治療主要包括免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療、過繼性細(xì)胞免疫治療等。免疫檢查點(diǎn)抑制劑能夠阻斷免疫檢查點(diǎn)分子，如程序性死亡受體1（PD-1）及其配體（PD-L1）、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（CTLA-4）等，解除腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫系統(tǒng)的抑制，增強(qiáng)T細(xì)胞的活性，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。過繼性細(xì)胞免疫治療則是將體外擴(kuò)增和激活的免疫細(xì)胞，如嵌合抗原受體T細(xì)胞（CAR-T）、腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TIL）等，回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，直接殺傷腫瘤細(xì)胞。免疫治療在部分腫瘤治療中取得了顯著進(jìn)展，如黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌、腎癌等。但免疫治療并非對(duì)所有患者都有效，僅一部分患者能夠從免疫治療中獲益，且免疫治療可能會(huì)引發(fā)免疫相關(guān)的不良反應(yīng)，如免疫性肺炎、免疫性肝炎、免疫性腸炎等，嚴(yán)重時(shí)可能危及患者生命。此外，免疫治療的療效還受到多種因素的影響，如腫瘤的免疫微環(huán)境、患者的個(gè)體差異、腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性等，使得免疫治療的應(yīng)用受到一定的限制。靶向治療是針對(duì)腫瘤細(xì)胞中特定的分子靶點(diǎn)進(jìn)行治療的方法，通過特異性地抑制腫瘤細(xì)胞的生長信號(hào)傳導(dǎo)通路、阻斷腫瘤血管生成或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等，達(dá)到治療腫瘤的目的。靶向治療藥物具有較高的特異性，能夠精準(zhǔn)地作用于腫瘤細(xì)胞，對(duì)正常細(xì)胞的損傷較小，因此不良反應(yīng)相對(duì)較輕。然而，腫瘤細(xì)胞容易產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致靶向治療的效果逐漸減弱。腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制包括靶點(diǎn)突變、旁路激活、腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性等。例如，在肺癌的靶向治療中，表皮生長因子受體（EGFR）酪氨酸激酶抑制劑（TKI）是常用的治療藥物，但隨著治療時(shí)間的延長，EGFR基因會(huì)發(fā)生二次突變，如T790M突變，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)TKI產(chǎn)生耐藥性。此外，靶向治療藥物的應(yīng)用也受到腫瘤細(xì)胞靶點(diǎn)表達(dá)情況的限制，只有那些靶點(diǎn)陽性的腫瘤患者才能從靶向治療中獲益，對(duì)于靶點(diǎn)陰性的患者，靶向治療則無效。2.2溶瘤腺病毒概述2.2.1溶瘤腺病毒的發(fā)展歷程溶瘤腺病毒的發(fā)展是一個(gè)充滿探索與突破的歷程，其起源可追溯到上世紀(jì)初對(duì)天然溶瘤病毒的發(fā)現(xiàn)。19世紀(jì)末，人們偶然觀察到一些癌癥患者在感染病毒后，腫瘤出現(xiàn)了自然消退的現(xiàn)象，這一奇特的發(fā)現(xiàn)引發(fā)了科研人員對(duì)利用病毒治療腫瘤的濃厚興趣，溶瘤病毒的概念也由此誕生。早期，研究主要集中在天然病毒株的應(yīng)用，研究人員嘗試使用水痘病毒、麻疹病毒等野生型病毒或減毒毒株進(jìn)行溶瘤治療，這些病毒在短期內(nèi)展現(xiàn)出了一定的抗腫瘤效果。然而，天然溶瘤病毒存在諸多局限性，它們對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力有限，且容易激活宿主免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致病毒在發(fā)揮作用之前就被清除，同時(shí)，病毒的病原性也難以有效控制。隨著有效的化療藥物在上世紀(jì)80年代初的崛起，溶瘤病毒研究進(jìn)入了低谷期。到了20世紀(jì)90年代，分子生物學(xué)和生物技術(shù)的飛速發(fā)展為溶瘤病毒的研究帶來了新的轉(zhuǎn)機(jī)，溶瘤腺病毒也迎來了關(guān)鍵的發(fā)展階段。1991年，人類首次成功對(duì)I型單純皰疹病毒（HSV-1）進(jìn)行胸苷激酶（TK）敲除基因改造，這一突破性的成果為癌癥治療的溶瘤病毒藥物研發(fā)奠定了基礎(chǔ)，開啟了基因改造病毒株研發(fā)的新時(shí)代。1996年，基因改造的腺病毒ONYX-015進(jìn)入I期臨床試驗(yàn)，標(biāo)志著溶瘤腺病毒在臨床研究方面邁出了重要一步。此后，溶瘤腺病毒的研究不斷取得進(jìn)展。2003年，重組腺病毒-p53抗癌注射液（今又生）獲得原CFDA批準(zhǔn)，成為世界上首個(gè)獲準(zhǔn)的基因治療癌癥藥物。2005年，我國食品和藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)了重組人5型腺病毒注射液（安柯瑞，H101）用于腫瘤患者的治療，這是世界上第一個(gè)溶瘤腺病毒藥物，主要用于治療晚期鼻咽癌患者，掀起了溶瘤腺病毒從實(shí)驗(yàn)室研究向臨床轉(zhuǎn)化的浪潮。進(jìn)入21世紀(jì)，溶瘤腺病毒的研究持續(xù)深入，進(jìn)入了基因插入及聯(lián)合治療增效階段。研究人員開始嘗試將各種治療性基因插入溶瘤腺病毒載體中，以增強(qiáng)其抗腫瘤效果，溶瘤腺病毒與其他治療方法，如化療、放療、免疫治療等的聯(lián)合應(yīng)用也成為研究熱點(diǎn)。2015年10月，F(xiàn)DA批準(zhǔn)攜帶人粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）的重組單純皰疹病毒產(chǎn)品T-VEC（Talimogenelaherparepvec，Imlygic），用于治療不可切除的轉(zhuǎn)移性黑色素瘤。2016年T-VEC又分別在歐洲和加拿大獲批，標(biāo)志著溶瘤病毒技術(shù)的成熟和對(duì)溶瘤病毒治療癌癥的正式認(rèn)可，也為溶瘤腺病毒的聯(lián)合治療提供了借鑒。2017年9月，CELL雜志報(bào)道溶瘤病毒T-VEC與PD-1單抗Keytruda聯(lián)合用藥用于黑色素瘤，腫瘤緩解率高達(dá)62%，其中33%為完全緩解，這一顯著成果進(jìn)一步掀起了溶瘤病毒免疫聯(lián)合療法研究的熱潮。近年來，溶瘤腺病毒在臨床研究中不斷取得新的進(jìn)展，針對(duì)不同瘤種的臨床試驗(yàn)正在廣泛開展，為腫瘤治療帶來了新的希望。2.2.2溶瘤腺病毒的作用機(jī)制溶瘤腺病毒的作用機(jī)制是一個(gè)多步驟且復(fù)雜精妙的過程，主要包括特異性感染腫瘤細(xì)胞、在腫瘤細(xì)胞內(nèi)高效復(fù)制以及引發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)等關(guān)鍵環(huán)節(jié)。溶瘤腺病毒能夠特異性地識(shí)別并感染腫瘤細(xì)胞，這一特性是其發(fā)揮治療作用的基礎(chǔ)。腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞在生物學(xué)特性上存在顯著差異，這些差異為溶瘤腺病毒的特異性感染提供了條件。腫瘤細(xì)胞表面往往存在一些特異性的受體或分子，這些受體或分子在正常細(xì)胞表面的表達(dá)水平較低或不表達(dá)，而溶瘤腺病毒可以通過其表面的蛋白與腫瘤細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向感染。一些腫瘤細(xì)胞表面過度表達(dá)整合素αvβ3和αvβ5等受體，而溶瘤腺病毒可以通過其纖維蛋白的RGD基序與這些受體特異性結(jié)合，進(jìn)而進(jìn)入腫瘤細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞的代謝狀態(tài)也與正常細(xì)胞不同，腫瘤細(xì)胞通常具有較高的有氧糖酵解率，即Warburg效應(yīng)，這種代謝特點(diǎn)使得腫瘤細(xì)胞內(nèi)的微環(huán)境更有利于溶瘤腺病毒的感染和復(fù)制。一旦溶瘤腺病毒成功感染腫瘤細(xì)胞，便會(huì)在腫瘤細(xì)胞內(nèi)啟動(dòng)復(fù)制程序。溶瘤腺病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)利用細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)和能量進(jìn)行大量復(fù)制，隨著病毒的不斷增殖，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的病毒數(shù)量急劇增加，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞因不堪重負(fù)而發(fā)生裂解死亡。在這個(gè)過程中，溶瘤腺病毒會(huì)干擾腫瘤細(xì)胞的正常生理功能，如抑制腫瘤細(xì)胞的DNA合成、蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞周期進(jìn)程等，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的死亡。當(dāng)腫瘤細(xì)胞裂解時(shí)，會(huì)釋放出大量的子代病毒，這些子代病毒又可以繼續(xù)感染周圍的腫瘤細(xì)胞，形成一個(gè)級(jí)聯(lián)放大的殺傷效應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤組織的有效破壞。溶瘤腺病毒在裂解腫瘤細(xì)胞的過程中，還能夠激活機(jī)體的免疫反應(yīng)。腫瘤細(xì)胞裂解后，會(huì)釋放出大量的腫瘤相關(guān)抗原（TAA），這些抗原可以被抗原呈遞細(xì)胞（APC），如樹突狀細(xì)胞（DC）攝取和加工處理。DC細(xì)胞將腫瘤相關(guān)抗原呈遞給T淋巴細(xì)胞，激活T淋巴細(xì)胞的活性，使其分化為效應(yīng)T細(xì)胞，如細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）。CTL能夠特異性地識(shí)別并殺傷表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原的腫瘤細(xì)胞，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。溶瘤腺病毒感染腫瘤細(xì)胞還會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生多種細(xì)胞因子和趨化因子，如干擾素（IFN）、腫瘤壞死因子（TNF）等，這些細(xì)胞因子和趨化因子可以招募更多的免疫細(xì)胞，如自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）、巨噬細(xì)胞等，到腫瘤組織部位，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。溶瘤腺病毒還可以改變腫瘤微環(huán)境，使其從免疫抑制狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槊庖呒せ顮顟B(tài)，提高免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果。2.2.3溶瘤腺病毒在腫瘤治療中的應(yīng)用現(xiàn)狀溶瘤腺病毒在腫瘤治療領(lǐng)域展現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景，目前在國內(nèi)外都取得了一定的成果，涵蓋藥物獲批、臨床試驗(yàn)以及不同腫瘤類型的應(yīng)用等多個(gè)方面。在藥物獲批方面，我國走在了世界前列。2005年，我國批準(zhǔn)了第一個(gè)溶瘤腺病毒藥物——重組人5型腺病毒（H101，安柯瑞）聯(lián)合化療用于治療晚期鼻咽癌患者，這是全球首個(gè)上市的溶瘤病毒類抗腫瘤藥。H101的獲批具有重要的里程碑意義，它為溶瘤腺病毒的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。一項(xiàng)多中心Ⅲ期臨床研究比較了瘤內(nèi)注射H101聯(lián)合化療與單純化療的治療效果，從目標(biāo)病灶看，H101聯(lián)合化療的完全緩解（CR）率和部分緩解（PR）率顯著高于單純化療組；從受試者全身療效看，聯(lián)合組的有效率同樣顯著高于單純化療組。除了鼻咽癌，H101還在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、宮頸癌、胃癌、卵巢癌等多個(gè)腫瘤領(lǐng)域進(jìn)行了探索。在肝癌治療中，有回顧性研究對(duì)比了經(jīng)動(dòng)脈化療栓塞（TACE）單用與聯(lián)合H101治療肝細(xì)胞癌（HCC）的療效，結(jié)果顯示，TACE聯(lián)合H101的治療方案可顯著延長患者的總生存期（OS，12.8個(gè)月vs11.6個(gè)月）和無進(jìn)展生存期（PFS，10.49個(gè)月vs9.72個(gè)月），提高患者的CR率（14.8%vs28.7%）并降低疾病進(jìn)展（PD）率（25.0%vs12.6%），且兩組治療相關(guān)不良反應(yīng)的發(fā)生率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在國際上，雖然目前尚無溶瘤腺病毒藥物獲批上市，但針對(duì)溶瘤腺病毒的研究和臨床試驗(yàn)正在積極開展。在臨床試驗(yàn)方面，溶瘤腺病毒針對(duì)多種實(shí)體瘤進(jìn)行了研究，這些瘤種大多是傳統(tǒng)治療效果不理想的腫瘤。在肺癌領(lǐng)域，多項(xiàng)臨床試驗(yàn)正在探索溶瘤腺病毒與化療、放療或免疫治療聯(lián)合應(yīng)用的效果。一項(xiàng)研究將溶瘤腺病毒與免疫檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)合用于非小細(xì)胞肺癌患者，初步結(jié)果顯示，聯(lián)合治療能夠提高患者的客觀緩解率，且安全性良好。在結(jié)直腸癌的治療中，溶瘤腺病毒也展現(xiàn)出了一定的潛力，通過瘤內(nèi)注射溶瘤腺病毒，能夠觀察到腫瘤組織的縮小和患者生存期的延長。溶瘤腺病毒在不同腫瘤類型中的應(yīng)用效果也受到了廣泛關(guān)注。在黑色素瘤的治療中，雖然獲批的是溶瘤單純皰疹病毒T-VEC，但溶瘤腺病毒也在進(jìn)行相關(guān)研究，有望為黑色素瘤患者提供新的治療選擇。在胰腺癌這一“癌中之王”的治療上，溶瘤腺病毒的研究也在不斷推進(jìn)。由于胰腺癌具有高度的侵襲性和耐藥性，傳統(tǒng)治療方法效果有限，溶瘤腺病毒通過特異性感染腫瘤細(xì)胞并激活免疫反應(yīng)，為胰腺癌的治療帶來了新的希望。一些臨床試驗(yàn)嘗試將溶瘤腺病毒與化療藥物聯(lián)合使用，初步結(jié)果顯示能夠提高患者的生存質(zhì)量和生存期。2.3microRNA的生物學(xué)功能及與腫瘤的關(guān)系2.3.1microRNA的結(jié)構(gòu)與功能MicroRNA（miRNA）是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為18-23個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子。其結(jié)構(gòu)短小精悍，卻蘊(yùn)含著強(qiáng)大的生物學(xué)調(diào)控能力。miRNA的生成過程是一個(gè)復(fù)雜且精細(xì)的調(diào)控過程。在細(xì)胞核內(nèi)，由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄生成初始miRNA（pri-miRNA），pri-miRNA通常具有較長的序列，且含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)。隨后，pri-miRNA在核酸酶Drosha和其輔助因子DGCR8組成的復(fù)合物作用下，被切割成約70-100個(gè)核苷酸的前體miRNA（pre-miRNA），pre-miRNA依然保持著莖環(huán)結(jié)構(gòu)。pre-miRNA通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin-5從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中。在細(xì)胞質(zhì)中，pre-miRNA被核酸酶Dicer識(shí)別并進(jìn)一步切割，形成長度約為22個(gè)核苷酸的雙鏈miRNA。雙鏈miRNA中的一條鏈會(huì)被選擇性地降解，而另一條鏈則成為成熟的miRNA，它能夠與AGO蛋白等結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）。成熟的miRNA主要通過與靶基因mRNA的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補(bǔ)配對(duì)，在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。當(dāng)miRNA與靶mRNA的3'-UTR完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，RISC中的核酸酶會(huì)直接切割靶mRNA，導(dǎo)致其降解，從而阻斷基因的表達(dá)。當(dāng)miRNA與靶mRNA的3'-UTR不完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，RISC會(huì)抑制靶mRNA的翻譯過程，使mRNA無法正常翻譯成蛋白質(zhì)，但mRNA本身并不被降解。miRNA還可以通過與靶基因mRNA的5'-UTR或編碼區(qū)結(jié)合，對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，盡管這種調(diào)控方式相對(duì)較少見。據(jù)估計(jì)，miRNA能夠調(diào)節(jié)人類近1/3的基因表達(dá)，在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、代謝等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。例如，在細(xì)胞增殖過程中，miR-17-92簇能夠通過抑制抑癌基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖；在細(xì)胞凋亡過程中，miR-15a和miR-16-1能夠通過靶向抗凋亡基因BCL2，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。2.3.2microRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用大量研究表明，microRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥等過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，其表達(dá)水平的異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在腫瘤細(xì)胞增殖方面，許多miRNA起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。一些miRNA可以作為癌基因促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。例如，miR-21在多種腫瘤中呈高表達(dá)狀態(tài)，它能夠通過靶向腫瘤抑制基因PTEN，抑制PTEN的表達(dá)，從而激活PI3K-AKT信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細(xì)胞中，miR-21的高表達(dá)與腫瘤的惡性程度和不良預(yù)后相關(guān)，抑制miR-21的表達(dá)能夠顯著降低乳腺癌細(xì)胞的增殖能力。相反，一些miRNA則發(fā)揮著抑癌基因的作用，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。miR-34a是一種典型的抑癌miRNA，它能夠靶向多個(gè)與細(xì)胞增殖和存活相關(guān)的基因，如MYC、CDK4、CDK6等，通過抑制這些基因的表達(dá)，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。在肺癌細(xì)胞中，miR-34a的表達(dá)水平明顯降低，而過表達(dá)miR-34a能夠有效抑制肺癌細(xì)胞的生長和增殖。miRNA對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的調(diào)控也十分關(guān)鍵。一些miRNA可以通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。miR-15a和miR-16-1能夠直接靶向抗凋亡基因BCL2，降低BCL2的表達(dá)水平，從而激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。在慢性淋巴細(xì)胞白血病中，這兩種miRNA的表達(dá)常常缺失，導(dǎo)致BCL2表達(dá)升高，腫瘤細(xì)胞凋亡受阻，而恢復(fù)miR-15a和miR-16-1的表達(dá)能夠有效促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。相反，一些miRNA則通過抑制凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡。miR-221和miR-222能夠靶向凋亡促進(jìn)基因PUMA和BIM，抑制它們的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。在肝癌細(xì)胞中，miR-221和miR-222的高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的抗凋亡能力和不良預(yù)后相關(guān)。腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤治療的一大難題，miRNA在這一過程中也扮演著重要角色。一些miRNA可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附分子、基質(zhì)金屬蛋白酶等基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。miR-10b在乳腺癌中高表達(dá)，它能夠靶向同源框基因HOXD10，抑制HOXD10的表達(dá)，進(jìn)而激活RhoC-ROCK信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。研究表明，miR-10b的表達(dá)水平與乳腺癌的轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)，抑制miR-10b的表達(dá)能夠顯著降低乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。相反，一些miRNA則可以抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。miR-335能夠通過靶向細(xì)胞黏附分子CD44和基質(zhì)金屬蛋白酶MMP14，抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。在肝癌細(xì)胞中，miR-335的表達(dá)水平降低，而過表達(dá)miR-335能夠有效抑制肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。miRNA還與腫瘤的耐藥性密切相關(guān)。腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物和靶向治療藥物產(chǎn)生耐藥性是導(dǎo)致腫瘤治療失敗的重要原因之一。研究發(fā)現(xiàn)，一些miRNA可以通過調(diào)節(jié)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、藥物靶點(diǎn)、細(xì)胞凋亡信號(hào)通路等，影響腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性。miR-451能夠通過靶向藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-糖蛋白（P-gp），降低P-gp的表達(dá)，從而增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)化療藥物的濃度，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。在多藥耐藥的乳腺癌細(xì)胞中，miR-451的表達(dá)水平明顯降低，而過表達(dá)miR-451能夠逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞的多藥耐藥性。miR-221和miR-222還可以通過抑制凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性。在肝癌細(xì)胞中，抑制miR-221和miR-222的表達(dá)能夠增加肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。由于miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用，它們具有作為腫瘤標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的巨大潛力。在腫瘤診斷方面，一些miRNA在腫瘤組織和血清中的表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)，可作為腫瘤診斷和預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物。miR-122在肝癌患者的血清中表達(dá)水平明顯降低，可作為肝癌早期診斷的潛在標(biāo)志物。在腫瘤治療方面，通過調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)水平或活性，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向治療。目前，針對(duì)miRNA的治療策略主要包括miRNA模擬物和反義寡核苷酸的應(yīng)用。miRNA模擬物可以模擬內(nèi)源性miRNA的功能，用于補(bǔ)充腫瘤細(xì)胞中缺失或低表達(dá)的抑癌miRNA；反義寡核苷酸則可以特異性地抑制腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的致癌miRNA的功能。一些針對(duì)miRNA的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中，為腫瘤治療帶來了新的希望。三、microRNA調(diào)控溶瘤腺病毒的作用機(jī)制3.1microRNA對(duì)溶瘤腺病毒復(fù)制的調(diào)控3.1.1microRNA響應(yīng)元件的設(shè)計(jì)與構(gòu)建以肝癌為例，肝癌是全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率居高不下。由于肝癌細(xì)胞具有高度的異質(zhì)性和侵襲性，傳統(tǒng)治療方法往往效果不佳，因此尋找新的治療策略至關(guān)重要。利用microRNA調(diào)控溶瘤腺病毒為肝癌治療提供了新的思路。在設(shè)計(jì)與構(gòu)建肝癌特異性microRNA響應(yīng)元件時(shí)，首先需要篩選出在肝癌細(xì)胞中差異表達(dá)顯著的microRNA。通過對(duì)大量肝癌組織樣本和正常肝組織樣本進(jìn)行高通量測序和生物信息學(xué)分析，研究人員發(fā)現(xiàn)miR-122在肝癌細(xì)胞中表達(dá)水平顯著低于正常肝細(xì)胞，而miR-221和miR-222在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)。這些差異表達(dá)的microRNA成為構(gòu)建響應(yīng)元件的潛在靶點(diǎn)。對(duì)于miR-122響應(yīng)元件的構(gòu)建，研究人員根據(jù)miR-122的序列信息，在溶瘤腺病毒基因組的特定區(qū)域，如E1A基因的3'-UTR，設(shè)計(jì)并插入一段與miR-122互補(bǔ)配對(duì)的核苷酸序列。這段序列長度通常為20-25個(gè)核苷酸，能夠與miR-122特異性結(jié)合。采用化學(xué)合成的方法合成該響應(yīng)元件序列，然后通過基因克隆技術(shù)，將其連接到含有溶瘤腺病毒骨架載體的質(zhì)粒中。具體操作過程如下：首先，使用限制性內(nèi)切酶對(duì)質(zhì)粒和響應(yīng)元件序列進(jìn)行雙酶切，使其產(chǎn)生互補(bǔ)的粘性末端。將酶切后的質(zhì)粒和響應(yīng)元件序列在DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接反應(yīng)，構(gòu)建成重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中，通過篩選和鑒定，獲得含有正確重組質(zhì)粒的大腸桿菌克隆。對(duì)陽性克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒，用于后續(xù)的病毒包裝和擴(kuò)增。對(duì)于miR-221和miR-222響應(yīng)元件的構(gòu)建，同樣根據(jù)其序列信息，在溶瘤腺病毒基因組的合適位置插入與之互補(bǔ)的序列。為了確保響應(yīng)元件的有效性和穩(wěn)定性，在構(gòu)建過程中還需要對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化。通過定點(diǎn)突變技術(shù)，對(duì)響應(yīng)元件序列中的某些堿基進(jìn)行改變，以增強(qiáng)其與microRNA的結(jié)合能力。還需要對(duì)響應(yīng)元件的位置進(jìn)行優(yōu)化，選擇在腺病毒基因組中對(duì)病毒復(fù)制影響較小但又能有效發(fā)揮調(diào)控作用的區(qū)域進(jìn)行插入。3.1.2調(diào)控溶瘤腺病毒復(fù)制的分子機(jī)制當(dāng)構(gòu)建好的溶瘤腺病毒進(jìn)入細(xì)胞后，其攜帶的microRNA響應(yīng)元件就會(huì)與細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的microRNA發(fā)生相互作用。以含有miR-122響應(yīng)元件的溶瘤腺病毒為例，在正常肝細(xì)胞中，由于miR-122表達(dá)水平較高，miR-122會(huì)與溶瘤腺病毒E1A基因3'-UTR上的響應(yīng)元件互補(bǔ)配對(duì)，形成RNA-RNA雙鏈結(jié)構(gòu)。這種雙鏈結(jié)構(gòu)會(huì)被細(xì)胞內(nèi)的RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）識(shí)別，RISC中的核酸酶會(huì)切割E1A基因的mRNA，導(dǎo)致其降解，從而抑制E1A基因的表達(dá)。E1A基因是腺病毒復(fù)制的關(guān)鍵基因，它編碼的E1A蛋白能夠激活其他腺病毒基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)病毒的復(fù)制。E1A基因表達(dá)受到抑制后，溶瘤腺病毒在正常肝細(xì)胞中的復(fù)制就會(huì)受到顯著抑制，從而減少對(duì)正常細(xì)胞的損傷。而在肝癌細(xì)胞中，由于miR-122表達(dá)水平較低，無法與響應(yīng)元件有效結(jié)合，溶瘤腺病毒的E1A基因能夠正常表達(dá)。E1A蛋白激活其他腺病毒基因的轉(zhuǎn)錄，啟動(dòng)溶瘤腺病毒的復(fù)制程序。隨著病毒的不斷復(fù)制，肝癌細(xì)胞內(nèi)的病毒數(shù)量逐漸增加，最終導(dǎo)致肝癌細(xì)胞因病毒的增殖和裂解作用而死亡。釋放出的子代病毒又可以繼續(xù)感染周圍的肝癌細(xì)胞，形成一個(gè)級(jí)聯(lián)放大的殺傷效應(yīng)。對(duì)于含有miR-221和miR-222響應(yīng)元件的溶瘤腺病毒，在肝癌細(xì)胞中，由于miR-221和miR-222高表達(dá)，它們會(huì)與響應(yīng)元件結(jié)合。與miR-122的作用機(jī)制不同，miR-221和miR-222與響應(yīng)元件結(jié)合后，可能會(huì)通過影響轉(zhuǎn)錄因子與腺病毒基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合，或者改變腺病毒基因mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而促進(jìn)腺病毒關(guān)鍵基因的表達(dá)，增強(qiáng)溶瘤腺病毒在肝癌細(xì)胞中的復(fù)制能力。而在正常細(xì)胞中，由于miR-221和miR-222表達(dá)水平較低，溶瘤腺病毒的復(fù)制則受到一定程度的限制。3.2microRNA增強(qiáng)溶瘤腺病毒靶向性的機(jī)制3.2.1腫瘤細(xì)胞特異性microRNA的篩選與鑒定篩選腫瘤細(xì)胞特異性高表達(dá)或低表達(dá)的microRNA是實(shí)現(xiàn)基于microRNA調(diào)控溶瘤腺病毒靶向性的關(guān)鍵前提，這一過程依賴于多種先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)方法和鑒定技術(shù)。高通量測序技術(shù)在篩選差異表達(dá)的microRNA中發(fā)揮著重要作用。通過對(duì)腫瘤組織樣本和正常組織樣本進(jìn)行高通量測序，能夠全面獲取樣本中所有microRNA的表達(dá)信息。具體操作時(shí)，首先提取腫瘤組織和正常組織中的總RNA，然后利用磁珠法或柱式法等方法富集microRNA。對(duì)富集后的microRNA進(jìn)行文庫構(gòu)建，采用隨機(jī)引物或莖環(huán)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將microRNA轉(zhuǎn)化為cDNA。利用PCR技術(shù)對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，構(gòu)建出適用于高通量測序的文庫。將文庫上機(jī)測序，得到大量的測序數(shù)據(jù)。通過生物信息學(xué)分析，對(duì)測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制、比對(duì)和定量分析，篩選出在腫瘤組織中表達(dá)水平與正常組織存在顯著差異的microRNA。以乳腺癌為例，通過高通量測序技術(shù)，研究人員發(fā)現(xiàn)miR-21在乳腺癌組織中高表達(dá)，而miR-125b在乳腺癌組織中低表達(dá)。這些差異表達(dá)的microRNA可能在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，成為后續(xù)研究的重點(diǎn)對(duì)象。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）是驗(yàn)證高通量測序結(jié)果的常用技術(shù)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。在進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，首先需要設(shè)計(jì)針對(duì)目標(biāo)microRNA的特異性引物。對(duì)于成熟的microRNA，通常采用莖環(huán)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，這種引物能夠特異性地與microRNA的3'端互補(bǔ)配對(duì)，提高反轉(zhuǎn)錄的效率和特異性。以U6snRNA等內(nèi)參基因作為對(duì)照，對(duì)目標(biāo)microRNA和內(nèi)參基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在擴(kuò)增過程中，通過熒光染料或熒光探針實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR產(chǎn)物的積累情況。根據(jù)擴(kuò)增曲線和Ct值（循環(huán)閾值），計(jì)算目標(biāo)microRNA的相對(duì)表達(dá)量。將腫瘤組織和正常組織中目標(biāo)microRNA的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行比較，進(jìn)一步驗(yàn)證高通量測序篩選出的差異表達(dá)microRNA的準(zhǔn)確性。在驗(yàn)證miR-21在乳腺癌組織中高表達(dá)的實(shí)驗(yàn)中，通過qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中miR-21的相對(duì)表達(dá)量明顯高于正常乳腺組織，與高通量測序結(jié)果一致。除了上述兩種主要技術(shù)外，基因芯片技術(shù)也可用于microRNA的篩選?；蛐酒菍⒋罅康膍icroRNA探針固定在固相載體上，與樣本中的microRNA進(jìn)行雜交，通過檢測雜交信號(hào)的強(qiáng)度來分析microRNA的表達(dá)譜?；蛐酒夹g(shù)能夠同時(shí)檢測多個(gè)樣本中大量microRNA的表達(dá)情況，具有高通量、快速的特點(diǎn)。然而，基因芯片技術(shù)也存在一些局限性，如檢測靈敏度相對(duì)較低，對(duì)低豐度microRNA的檢測效果不佳等。因此，在實(shí)際應(yīng)用中，基因芯片技術(shù)通常作為高通量測序技術(shù)的補(bǔ)充，用于初步篩選差異表達(dá)的microRNA。3.2.2靶向性增強(qiáng)的原理與驗(yàn)證利用腫瘤細(xì)胞特異性microRNA調(diào)控溶瘤腺病毒，使其僅在腫瘤細(xì)胞中高效復(fù)制的原理基于microRNA對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用以及腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞中microRNA表達(dá)水平的差異。以肺癌為例，研究發(fā)現(xiàn)miR-197在肺癌細(xì)胞中表達(dá)水平顯著高于正常肺上皮細(xì)胞。在構(gòu)建基于miR-197調(diào)控的溶瘤腺病毒時(shí)，將miR-197的響應(yīng)元件插入到溶瘤腺病毒的關(guān)鍵基因，如E1A基因的3'-UTR區(qū)域。在正常肺上皮細(xì)胞中，由于miR-197表達(dá)水平較低，無法與響應(yīng)元件有效結(jié)合，溶瘤腺病毒的E1A基因能夠正常表達(dá)，啟動(dòng)病毒的復(fù)制程序。然而，正常肺上皮細(xì)胞具有完善的抗病毒防御機(jī)制，能夠識(shí)別并清除入侵的腺病毒，從而限制了溶瘤腺病毒在正常細(xì)胞中的復(fù)制。在肺癌細(xì)胞中，高表達(dá)的miR-197會(huì)與響應(yīng)元件互補(bǔ)配對(duì)，形成RNA-RNA雙鏈結(jié)構(gòu)。這種雙鏈結(jié)構(gòu)會(huì)被細(xì)胞內(nèi)的RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）識(shí)別，RISC中的核酸酶會(huì)切割E1A基因的mRNA，導(dǎo)致其降解，從而抑制E1A基因的表達(dá)。E1A基因是腺病毒復(fù)制的關(guān)鍵基因，其表達(dá)受到抑制后，溶瘤腺病毒在肺癌細(xì)胞中的復(fù)制就會(huì)受到顯著抑制。當(dāng)溶瘤腺病毒進(jìn)入肺癌細(xì)胞后，由于miR-197的作用，病毒的復(fù)制受到抑制，避免了對(duì)正常肺上皮細(xì)胞的損傷。隨著肺癌細(xì)胞內(nèi)腫瘤相關(guān)信號(hào)通路的激活，一些轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)和活性發(fā)生改變，這些轉(zhuǎn)錄因子可以與溶瘤腺病毒基因組中的特定序列結(jié)合，激活E1A基因的轉(zhuǎn)錄，從而啟動(dòng)溶瘤腺病毒的復(fù)制程序。隨著病毒的不斷復(fù)制，肺癌細(xì)胞內(nèi)的病毒數(shù)量逐漸增加，最終導(dǎo)致肺癌細(xì)胞因病毒的增殖和裂解作用而死亡。釋放出的子代病毒又可以繼續(xù)感染周圍的肺癌細(xì)胞，形成一個(gè)級(jí)聯(lián)放大的殺傷效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)肺癌細(xì)胞的特異性殺傷。為了驗(yàn)證這一靶向性增強(qiáng)的原理，研究人員進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，將構(gòu)建好的基于miR-197調(diào)控的溶瘤腺病毒分別感染肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和正常肺上皮細(xì)胞系BEAS-2B。通過熒光定量PCR檢測病毒基因的拷貝數(shù)，觀察溶瘤腺病毒在不同細(xì)胞系中的復(fù)制情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在A549細(xì)胞中，病毒基因的拷貝數(shù)隨著時(shí)間的推移逐漸增加，表明溶瘤腺病毒能夠在肺癌細(xì)胞中高效復(fù)制。而在BEAS-2B細(xì)胞中，病毒基因的拷貝數(shù)幾乎沒有增加，說明溶瘤腺病毒在正常肺上皮細(xì)胞中的復(fù)制受到了明顯抑制。通過蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）檢測E1A蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-197對(duì)E1A基因表達(dá)的調(diào)控作用。在A549細(xì)胞中，E1A蛋白的表達(dá)水平較低，而在BEAS-2B細(xì)胞中，E1A蛋白的表達(dá)水平較高，與預(yù)期結(jié)果一致。在體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，構(gòu)建肺癌小鼠模型，將溶瘤腺病毒通過瘤內(nèi)注射或靜脈注射的方式給予小鼠。定期觀察小鼠腫瘤的生長情況，測量腫瘤體積。結(jié)果顯示，接受溶瘤腺病毒治療的小鼠腫瘤生長明顯受到抑制，腫瘤體積顯著小于對(duì)照組小鼠。通過組織病理學(xué)檢查，觀察腫瘤組織和正常肺組織的病理變化。在腫瘤組織中，可以觀察到大量的病毒顆粒和腫瘤細(xì)胞的壞死，而在正常肺組織中，幾乎沒有病毒感染和細(xì)胞損傷的跡象。通過免疫組化分析檢測腫瘤組織和正常肺組織中相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)變化，進(jìn)一步驗(yàn)證了溶瘤腺病毒的靶向性和抗腫瘤效果。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分證明了利用腫瘤細(xì)胞特異性microRNA調(diào)控溶瘤腺病毒，能夠有效增強(qiáng)其靶向性，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷。3.3microRNA與溶瘤腺病毒聯(lián)合激活免疫反應(yīng)的機(jī)制3.3.1溶瘤腺病毒對(duì)免疫細(xì)胞的激活作用溶瘤腺病毒在腫瘤治療過程中，對(duì)免疫細(xì)胞的激活是其發(fā)揮抗腫瘤作用的重要環(huán)節(jié)。當(dāng)溶瘤腺病毒特異性地感染腫瘤細(xì)胞后，會(huì)在腫瘤細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行大量復(fù)制，隨著病毒的不斷增殖，腫瘤細(xì)胞最終發(fā)生裂解死亡。在這一過程中，腫瘤細(xì)胞會(huì)釋放出大量的腫瘤相關(guān)抗原（TAA），這些抗原成為激活免疫細(xì)胞的關(guān)鍵信號(hào)。樹突狀細(xì)胞（DC）作為體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞，在免疫激活過程中發(fā)揮著核心作用。腫瘤細(xì)胞裂解后釋放的TAA會(huì)被DC細(xì)胞攝取。DC細(xì)胞攝取TAA后，會(huì)經(jīng)歷一個(gè)成熟和活化的過程。在這個(gè)過程中，DC細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體（PRR），如Toll樣受體（TLR）等，能夠識(shí)別TAA以及溶瘤腺病毒本身所攜帶的病原體相關(guān)分子模式（PAMP）。這些識(shí)別過程會(huì)激活DC細(xì)胞內(nèi)的一系列信號(hào)通路，如NF-κB信號(hào)通路等，促使DC細(xì)胞表達(dá)多種共刺激分子，如CD80、CD86等，以及細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等。這些共刺激分子和細(xì)胞因子對(duì)于DC細(xì)胞的成熟和功能發(fā)揮至關(guān)重要。成熟的DC細(xì)胞會(huì)遷移到淋巴結(jié)，在淋巴結(jié)中，DC細(xì)胞將TAA呈遞給初始T淋巴細(xì)胞。DC細(xì)胞表面的主要組織相容性復(fù)合體（MHC）分子與TAA結(jié)合形成復(fù)合物，被初始T淋巴細(xì)胞表面的T細(xì)胞受體（TCR）識(shí)別，同時(shí)DC細(xì)胞表面的共刺激分子與T淋巴細(xì)胞表面的相應(yīng)受體相互作用，提供第二信號(hào)。在這兩個(gè)信號(hào)的共同作用下，初始T淋巴細(xì)胞被激活，開始增殖和分化。初始T淋巴細(xì)胞會(huì)分化為不同類型的效應(yīng)T細(xì)胞，其中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）是直接殺傷腫瘤細(xì)胞的主要效應(yīng)細(xì)胞。CTL能夠特異性地識(shí)別表達(dá)TAA的腫瘤細(xì)胞，通過釋放穿孔素和顆粒酶等物質(zhì)，直接殺傷腫瘤細(xì)胞。CTL還可以分泌細(xì)胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ）等，進(jìn)一步增強(qiáng)免疫反應(yīng)，激活其他免疫細(xì)胞，如自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）和巨噬細(xì)胞等。除了激活T淋巴細(xì)胞外，溶瘤腺病毒還能對(duì)NK細(xì)胞產(chǎn)生激活作用。NK細(xì)胞是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，具有非特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。溶瘤腺病毒感染腫瘤細(xì)胞后釋放的細(xì)胞因子，如IFN-α、IFN-β、IL-12等，能夠激活NK細(xì)胞。這些細(xì)胞因子可以促進(jìn)NK細(xì)胞的增殖和活化，增強(qiáng)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性?；罨腘K細(xì)胞能夠識(shí)別并殺傷被溶瘤腺病毒感染的腫瘤細(xì)胞，同時(shí)還可以分泌細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，促進(jìn)其他免疫細(xì)胞的活化和募集。巨噬細(xì)胞也會(huì)受到溶瘤腺病毒的影響而被激活。巨噬細(xì)胞在吞噬腫瘤細(xì)胞裂解產(chǎn)物和溶瘤腺病毒后，會(huì)被激活并釋放多種細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)，如TNF-α、IL-1、IL-6等。這些細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)可以進(jìn)一步增強(qiáng)免疫反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的清除。巨噬細(xì)胞還可以通過直接吞噬作用和分泌活性氧等物質(zhì)，殺傷腫瘤細(xì)胞。3.3.2microRNA對(duì)免疫調(diào)節(jié)因子的影響MicroRNA在免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要作用，通過對(duì)免疫調(diào)節(jié)因子表達(dá)的精準(zhǔn)調(diào)控，深刻影響著抗腫瘤免疫反應(yīng)。在腫瘤免疫微環(huán)境中，多種免疫調(diào)節(jié)因子參與了免疫細(xì)胞的活化、增殖以及免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)。以miR-155為例，它在免疫細(xì)胞的發(fā)育、分化和功能調(diào)節(jié)中扮演著關(guān)鍵角色。在T淋巴細(xì)胞中，miR-155能夠靶向抑制細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制因子1（SOCS1）的表達(dá)。SOCS1是一種負(fù)調(diào)節(jié)因子，它可以抑制T細(xì)胞受體（TCR）信號(hào)通路的激活。當(dāng)miR-155抑制SOCS1的表達(dá)后，TCR信號(hào)通路得以增強(qiáng)，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的活化和增殖。miR-155還可以調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的分化方向，促進(jìn)Th1和Th17細(xì)胞的分化，同時(shí)抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的分化。Th1細(xì)胞主要分泌IFN-γ等細(xì)胞因子，能夠增強(qiáng)細(xì)胞免疫反應(yīng)，促進(jìn)CTL的活化和腫瘤細(xì)胞的殺傷。Th17細(xì)胞則分泌IL-17等細(xì)胞因子，參與炎癥反應(yīng)和免疫防御，在腫瘤免疫中也發(fā)揮著重要作用。而Treg細(xì)胞具有免疫抑制功能，能夠抑制其他免疫細(xì)胞的活性，不利于抗腫瘤免疫反應(yīng)的進(jìn)行。因此，miR-155通過調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的分化，增強(qiáng)了抗腫瘤免疫反應(yīng)。miR-21在腫瘤免疫調(diào)節(jié)中也具有重要作用。在腫瘤細(xì)胞中，miR-21高表達(dá)，它可以通過靶向抑制程序性死亡受體1配體（PD-L1）的表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞之間的相互作用。PD-L1是一種免疫檢查點(diǎn)分子，它可以與T淋巴細(xì)胞表面的程序性死亡受體1（PD-1）結(jié)合，抑制T淋巴細(xì)胞的活性，使腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視。當(dāng)miR-21抑制PD-L1的表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞表面的PD-L1水平降低，T淋巴細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間的免疫抑制信號(hào)減弱，從而增強(qiáng)了T淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。miR-21還可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，如IL-6等，影響腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞活性。IL-6是一種多功能細(xì)胞因子，它可以促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的活化和增殖，同時(shí)也可以促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的分化和抗體分泌。然而，在腫瘤微環(huán)境中，過高水平的IL-6也可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。miR-21通過調(diào)節(jié)IL-6的表達(dá)，在一定程度上平衡了腫瘤微環(huán)境中的免疫反應(yīng)。3.3.3聯(lián)合激活免疫反應(yīng)的協(xié)同效應(yīng)為了深入探究microRNA與溶瘤腺病毒聯(lián)合激活免疫反應(yīng)的協(xié)同效應(yīng)，研究人員開展了一系列小鼠實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)選用BALB/c小鼠，構(gòu)建小鼠黑色素瘤模型。將小鼠隨機(jī)分為四組，分別為對(duì)照組、溶瘤腺病毒組、microRNA模擬物組以及溶瘤腺病毒與microRNA模擬物聯(lián)合組。在實(shí)驗(yàn)過程中，對(duì)照組小鼠注射生理鹽水，溶瘤腺病毒組小鼠瘤內(nèi)注射溶瘤腺病毒，microRNA模擬物組小鼠瘤內(nèi)注射針對(duì)特定microRNA（如miR-155）的模擬物，聯(lián)合組小鼠瘤內(nèi)同時(shí)注射溶瘤腺病毒和microRNA模擬物。定期觀察小鼠腫瘤的生長情況，測量腫瘤體積。結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠腫瘤生長迅速，而溶瘤腺病毒組和microRNA模擬物組小鼠腫瘤生長速度相對(duì)較慢。聯(lián)合組小鼠腫瘤生長受到最顯著的抑制，腫瘤體積明顯小于其他三組。對(duì)小鼠的免疫細(xì)胞活性進(jìn)行檢測，通過流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠脾臟和腫瘤組織中免疫細(xì)胞的比例和活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合組小鼠脾臟和腫瘤組織中CD8+T細(xì)胞的比例明顯高于其他三組，且CD8+T細(xì)胞的活性增強(qiáng)，表現(xiàn)為更高的IFN-γ分泌水平。聯(lián)合組小鼠中NK細(xì)胞的活性也顯著增強(qiáng)，其殺傷腫瘤細(xì)胞的能力明顯提高。通過酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測小鼠血清和腫瘤組織中細(xì)胞因子的分泌情況。結(jié)果顯示，聯(lián)合組小鼠血清和腫瘤組織中IL-12、IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子的水平顯著高于其他三組。這些細(xì)胞因子在激活免疫細(xì)胞、增強(qiáng)免疫反應(yīng)方面發(fā)揮著重要作用。IL-12可以促進(jìn)T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的活化和增殖，增強(qiáng)細(xì)胞免疫反應(yīng)。IFN-γ能夠激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)其殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，同時(shí)還可以調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的分化，促進(jìn)Th1細(xì)胞的產(chǎn)生。TNF-α則可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞，同時(shí)也可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活性。進(jìn)一步對(duì)小鼠腫瘤組織進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，觀察腫瘤細(xì)胞的凋亡情況和免疫細(xì)胞的浸潤情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合組小鼠腫瘤組織中出現(xiàn)大量的腫瘤細(xì)胞凋亡，同時(shí)有更多的免疫細(xì)胞浸潤，包括CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等。這些結(jié)果表明，microRNA與溶瘤腺病毒聯(lián)合使用能夠顯著增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活性，促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌，從而更有效地抑制腫瘤生長。二者聯(lián)合通過不同的機(jī)制協(xié)同作用，溶瘤腺病毒裂解腫瘤細(xì)胞釋放腫瘤相關(guān)抗原，激活免疫細(xì)胞；microRNA則通過調(diào)節(jié)免疫調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活性和功能。這種協(xié)同效應(yīng)使得聯(lián)合治療在腫瘤治療中展現(xiàn)出更優(yōu)越的效果，為腫瘤治療提供了新的策略和思路。四、基于microRNA調(diào)控的溶瘤腺病毒實(shí)驗(yàn)研究4.1實(shí)驗(yàn)材料與方法4.1.1實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)選用多種細(xì)胞系，包括人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、人肝癌細(xì)胞系HepG2，以及人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B、人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF10A、人正常肝細(xì)胞L02。這些細(xì)胞系分別從美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）和中國科學(xué)院細(xì)胞庫購買獲得。細(xì)胞培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基為RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司）和DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司），根據(jù)不同細(xì)胞系的生長需求進(jìn)行選擇。培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清（FBS，Gibco公司）和1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液（Solarbio公司），以提供細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)和防止細(xì)胞污染。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用6-8周齡的BALB/c裸鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。裸鼠飼養(yǎng)在無特定病原體（SPF）級(jí)動(dòng)物房內(nèi)，溫度控制在22-25℃，相對(duì)濕度保持在40%-60%，12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗的環(huán)境中。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在使用前適應(yīng)環(huán)境一周，自由飲食和飲水。本研究使用的溶瘤腺病毒載體以人5型腺病毒為基礎(chǔ)骨架，通過基因工程技術(shù)進(jìn)行改造。在構(gòu)建載體時(shí)，采用了同源重組的方法，將特定的基因片段與腺病毒骨架進(jìn)行重組。具體而言，利用限制性內(nèi)切酶對(duì)腺病毒骨架和目的基因片段進(jìn)行酶切，使其產(chǎn)生互補(bǔ)的粘性末端，然后在DNA連接酶的作用下將兩者連接起來，構(gòu)建成重組腺病毒載體。將重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中進(jìn)行包裝和擴(kuò)增，采用氯化銫密度梯度離心法對(duì)病毒進(jìn)行純化，以獲得高純度的溶瘤腺病毒。在病毒純化過程中，通過超速離心使病毒在氯化銫溶液中形成不同的密度帶，從而將病毒與雜質(zhì)分離。采用TCID50法（50%組織細(xì)胞感染劑量法）測定病毒滴度，確保病毒的感染活性符合實(shí)驗(yàn)要求。為了研究microRNA對(duì)溶瘤腺病毒的調(diào)控作用，實(shí)驗(yàn)中使用了針對(duì)特定microRNA的模擬物和抑制劑。這些模擬物和抑制劑由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。MicroRNA模擬物是人工合成的雙鏈RNA分子，其序列與內(nèi)源性成熟microRNA相同，能夠模擬內(nèi)源性microRNA的功能，用于研究microRNA過表達(dá)對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。MicroRNA抑制劑則是經(jīng)過化學(xué)修飾的單鏈RNA分子，能夠特異性地與內(nèi)源性microRNA結(jié)合，抑制其功能，用于研究microRNA功能缺失對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。在實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮图?xì)胞系，將模擬物和抑制劑按照一定的濃度轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染過程中使用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司），按照試劑說明書的操作步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染，以確保模擬物和抑制劑能夠高效地進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。4.1.2實(shí)驗(yàn)方法設(shè)計(jì)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行。將購買的細(xì)胞系從液氮中取出，迅速放入37℃水浴鍋中進(jìn)行復(fù)蘇。待細(xì)胞完全融化后，將其轉(zhuǎn)移至含有適量培養(yǎng)基的離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用新鮮的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2-3天觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，先用PBS緩沖液清洗細(xì)胞2-3次，然后加入適量的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液（Gibco公司），37℃消化1-2分鐘，待細(xì)胞變圓脫落后，加入含有血清的培養(yǎng)基終止消化。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照1:3-1:5的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。運(yùn)用基因工程技術(shù)進(jìn)行病毒構(gòu)建與包裝。首先，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過PCR擴(kuò)增技術(shù)獲得目的基因片段，如含有特定microRNA響應(yīng)元件的基因片段。在PCR擴(kuò)增過程中，設(shè)計(jì)特異性引物，引物的設(shè)計(jì)依據(jù)目的基因的序列信息，確保能夠準(zhǔn)確地?cái)U(kuò)增出目的基因片段。將擴(kuò)增得到的目的基因片段與腺病毒穿梭載體進(jìn)行連接，構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒。采用限制性內(nèi)切酶對(duì)穿梭載體和目的基因片段進(jìn)行雙酶切，然后在DNA連接酶的作用下將兩者連接起來。將重組穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中，通過藍(lán)白斑篩選和測序鑒定，獲得含有正確重組穿梭質(zhì)粒的大腸桿菌克隆。將重組穿梭質(zhì)粒與腺病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中，利用細(xì)胞內(nèi)的同源重組機(jī)制，構(gòu)建重組腺病毒。在轉(zhuǎn)染過程中，使用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑將質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。轉(zhuǎn)染后，觀察細(xì)胞的病變情況，待細(xì)胞出現(xiàn)明顯的病變特征，如細(xì)胞變圓、脫落等，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，進(jìn)行病毒的初步擴(kuò)增。將初步擴(kuò)增的病毒感染HEK293細(xì)胞，進(jìn)行大規(guī)模的病毒擴(kuò)增。采用氯化銫密度梯度離心法對(duì)擴(kuò)增后的病毒進(jìn)行純化，得到高純度的溶瘤腺病毒。在病毒感染實(shí)驗(yàn)中，將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞接種到96孔板或6孔板中，每孔接種適量的細(xì)胞，使其在培養(yǎng)過程中能夠均勻生長。待細(xì)胞貼壁后，將不同滴度的溶瘤腺病毒加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔中，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，對(duì)照組加入等量的PBS緩沖液或空病毒載體。感染過程中，根據(jù)病毒的感染復(fù)數(shù)（MOI）計(jì)算加入的病毒量。MOI是指每個(gè)細(xì)胞所感染的病毒粒子數(shù)，通過調(diào)整MOI可以控制病毒感染細(xì)胞的效率。將細(xì)胞與病毒在37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育一定時(shí)間，通常為1-2小時(shí)，使病毒充分吸附到細(xì)胞表面。然后棄去含有病毒的培養(yǎng)基，用PBS緩沖液清洗細(xì)胞2-3次，去除未吸附的病毒。加入新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，在不同的時(shí)間點(diǎn)，如24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)等，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)檢測。采用Trizol試劑（Invitrogen公司）提取細(xì)胞中的總RNA。具體操作步驟如下：將培養(yǎng)的細(xì)胞用PBS緩沖液清洗2-3次，然后加入適量的Trizol試劑，吹打均勻，使細(xì)胞充分裂解。將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，室溫靜置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。加入適量的氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置2-3分鐘。12000rpm離心15分鐘，離心后溶液分為三層，上層為無色透明的水相，含有RNA；中層為白色的蛋白層；下層為紅色的有機(jī)相。將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻后室溫靜置10分鐘。12000rpm離心10分鐘，離心后管底會(huì)出現(xiàn)白色的RNA沉淀。棄去上清液，用75%乙醇洗滌RNA沉淀2-3次，每次洗滌后12000rpm離心5分鐘。棄去乙醇，將RNA沉淀在室溫下晾干，然后加入適量的DEPC水溶解RNA。采用Nanodrop分光光度計(jì)測定RNA的濃度和純度，確保RNA的質(zhì)量符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。以提取的RNA為模板，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司）將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。在反轉(zhuǎn)錄過程中，按照試劑盒說明書的操作步驟，加入適量的引物、反轉(zhuǎn)錄酶、dNTP等試劑，在特定的溫度條件下進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。以cDNA為模板，使用SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒（Roche公司）進(jìn)行qRT-PCR檢測。在qRT-PCR反應(yīng)中，設(shè)計(jì)特異性引物，針對(duì)目的基因和內(nèi)參基因進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系中包含cDNA模板、引物、SYBRGreen熒光染料、dNTP、Taq酶等試劑。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的95℃變性5秒、60℃退火30秒。在反應(yīng)過程中，通過熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR產(chǎn)物的積累情況。根據(jù)擴(kuò)增曲線和Ct值（循環(huán)閾值），采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。蛋白質(zhì)檢測實(shí)驗(yàn)采用蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）技術(shù)。將培養(yǎng)的細(xì)胞用PBS緩沖液清洗2-3次，然后加入適量的細(xì)胞裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘。12000rpm離心15分鐘，收集上清液，即為細(xì)胞總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒（ThermoScientific公司）測定蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，在100℃煮沸5分鐘，使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳條件為：80V恒壓電泳30分鐘，然后120V恒壓電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)移條件為：200mA恒流轉(zhuǎn)移2小時(shí)。將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉1小時(shí)，以防止非特異性結(jié)合。封閉后，將PVDF膜與一抗在4℃孵育過夜。一抗為針對(duì)目的蛋白的特異性抗體，根據(jù)不同的目的蛋白選擇相應(yīng)的抗體。孵育過夜后，用TBST緩沖液清洗PVDF膜3次，每次10分鐘。然后將PVDF膜與二抗在室溫下孵育1小時(shí)。二抗為針對(duì)一抗的熒光標(biāo)記或酶標(biāo)記抗體。孵育結(jié)束后，用TBST緩沖液清洗PVDF膜3次，每次10分鐘。采用化學(xué)發(fā)光法或熒光成像法檢測目的蛋白的表達(dá)水平。如果二抗為酶標(biāo)記抗體，則加入化學(xué)發(fā)光底物，在暗室中曝光，通過膠片或化學(xué)發(fā)光成像儀檢測目的蛋白的條帶。如果二抗為熒光標(biāo)記抗體，則使用熒光成像儀直接檢測目的蛋白的熒光信號(hào)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵循動(dòng)物倫理原則和相關(guān)法規(guī)。構(gòu)建小鼠皮下移植瘤模型時(shí)，將處于對(duì)數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞用PBS緩沖液清洗2-3次，然后用胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液。調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL，在BALB/c裸鼠的背部皮下注射0.1mL細(xì)胞懸液，每只裸鼠接種1×10?個(gè)腫瘤細(xì)胞。接種后，每天觀察裸鼠的一般狀態(tài)，包括飲食、活動(dòng)、精神狀態(tài)等。定期測量腫瘤的體積，使用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到約100-150mm3時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分為不同的治療組，每組5-6只裸鼠。分別給予不同的處理，如溶瘤腺病毒組通過瘤內(nèi)注射或靜脈注射溶瘤腺病毒，對(duì)照組給予等量的PBS緩沖液或空病毒載體，聯(lián)合治療組給予溶瘤腺病毒與化療藥物或放療聯(lián)合治療。在治療過程中，密切觀察裸鼠的體重變化、腫瘤生長情況等指標(biāo)。當(dāng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，處死裸鼠，取出腫瘤組織和相關(guān)臟器，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查、免疫組化分析等。組織病理學(xué)檢查時(shí)，將腫瘤組織和臟器用10%中性福爾馬林固定，然后進(jìn)行石蠟包埋、切片、HE染色等操作，在顯微鏡下觀察組織的病理變化。免疫組化分析時(shí)，將切片與特異性抗體孵育，檢測腫瘤組織中相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)情況。4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.2.1microRNA調(diào)控溶瘤腺病毒的構(gòu)建與鑒定通過一系列嚴(yán)謹(jǐn)且精細(xì)的基因工程操作，成功構(gòu)建了基于microRNA調(diào)控的溶瘤腺病毒。在構(gòu)建過程中，首先利用PCR擴(kuò)增技術(shù)，從特定的模板中獲取了含有microRNA響應(yīng)元件的目的基因片段。以人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549為研究對(duì)象，針對(duì)在A549細(xì)胞中差異表達(dá)顯著的miR-197，設(shè)計(jì)并擴(kuò)增出其響應(yīng)元件序列。將擴(kuò)增得到的目的基因片段與腺病毒穿梭載體進(jìn)行連接，構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒。采用限制性內(nèi)切酶對(duì)穿梭載體和目的基因片段進(jìn)行雙酶切，確保兩者能夠準(zhǔn)確連接。利用T4DNA連接酶將酶切后的目的基因片段與穿梭載體進(jìn)行連接反應(yīng)，構(gòu)建出重組穿梭質(zhì)粒。將重組穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中，通過藍(lán)白斑篩選和測序鑒定，獲得了含有正確重