基于ISSR技術(shù)的菜心種質(zhì)資源遺傳多樣性剖析一、引言1.1研究背景與意義菜心（BrassicacampestrisL.ssp.chinensisvar.utilisTsenetLee），又名菜薹，屬十字花科蕓薹屬白菜亞種的變種，是中國(guó)華南地區(qū)的特產(chǎn)蔬菜之一，在嶺南蔬菜市場(chǎng)供應(yīng)中居于首要地位，被稱為“蔬品之冠”。其品質(zhì)柔嫩，營(yíng)養(yǎng)豐富，含有鈣、磷、鐵等多種對(duì)人體有益的礦物質(zhì)元素，以及維生素C、胡蘿卜素等維生素，深受消費(fèi)者的喜愛(ài)。同時(shí)，菜心生長(zhǎng)周期短，復(fù)種指數(shù)高，可周年生產(chǎn)供應(yīng)，在應(yīng)對(duì)蔬菜生產(chǎn)淡季上具有重要作用，經(jīng)濟(jì)效益較高，在蔬菜產(chǎn)業(yè)中占據(jù)著重要地位。隨著人們生活水平的提高和市場(chǎng)需求的多樣化，對(duì)菜心的品種特性提出了更高要求，不僅期望其具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的特點(diǎn)，還希望其具備更強(qiáng)的抗病、抗逆能力，以適應(yīng)不同的種植環(huán)境和市場(chǎng)需求。然而，當(dāng)前菜心品種繁多，品質(zhì)參差不齊，嚴(yán)重影響了菜心的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。此外，在菜心的種植過(guò)程中，常受到多種病蟲(chóng)害的侵襲，以及干旱、鹽堿、低溫等環(huán)境脅迫的影響，導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)下降。因此，培育具有優(yōu)良性狀的新品種成為推動(dòng)菜心產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要途徑。遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，對(duì)于物種的生存、進(jìn)化和適應(yīng)環(huán)境變化具有至關(guān)重要的意義。對(duì)菜心種質(zhì)資源遺傳多樣性進(jìn)行研究，有助于深入了解菜心的遺傳背景和進(jìn)化關(guān)系，為菜心的品種改良和資源保護(hù)提供重要的理論依據(jù)。通過(guò)分析菜心種質(zhì)資源的遺傳多樣性，可以篩選出具有優(yōu)良性狀的種質(zhì)材料，為培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病、抗逆的菜心新品種提供豐富的遺傳資源。同時(shí)，了解菜心種質(zhì)資源的遺傳多樣性，還可以為菜心種質(zhì)資源的合理保護(hù)和利用提供科學(xué)指導(dǎo)，避免種質(zhì)資源的流失和遺傳基礎(chǔ)的狹窄，保障菜心產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。在分子生物學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展的今天，ISSR（Inter-SimpleSequenceRepeat）分子標(biāo)記技術(shù)以其操作簡(jiǎn)單、多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性較高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性分析、品種鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建等研究領(lǐng)域。將ISSR技術(shù)應(yīng)用于菜心種質(zhì)資源遺傳多樣性研究，能夠從分子水平揭示菜心品種間的遺傳差異，為菜心的遺傳育種研究提供更加準(zhǔn)確、可靠的信息，具有重要的實(shí)踐意義。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在菜心種質(zhì)資源收集與保存方面，國(guó)內(nèi)外科研人員已開(kāi)展了大量工作。中國(guó)作為菜心的起源地和主要種植區(qū)域，擁有豐富的菜心種質(zhì)資源。廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所等科研單位通過(guò)長(zhǎng)期的資源收集與整理，建立了較為完善的菜心種質(zhì)資源庫(kù)，保存了眾多地方品種、野生近緣種以及選育的優(yōu)良品系，為菜心的遺傳育種研究提供了堅(jiān)實(shí)的物質(zhì)基礎(chǔ)。國(guó)際上，一些研究機(jī)構(gòu)也對(duì)菜心種質(zhì)資源表現(xiàn)出關(guān)注，通過(guò)國(guó)際交流與合作，收集了部分菜心種質(zhì)，進(jìn)行了初步的保存與評(píng)價(jià)工作，但在資源的豐富度和系統(tǒng)性方面，與國(guó)內(nèi)相比仍有一定差距。關(guān)于菜心遺傳多樣性的研究，早期主要集中在形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)水平?？蒲腥藛T通過(guò)對(duì)菜心的株型、葉片形狀、色澤、薹莖粗細(xì)、花色等形態(tài)特征進(jìn)行觀察和分析，初步了解了不同菜心品種間的遺傳差異。在細(xì)胞學(xué)研究方面，通過(guò)染色體核型分析、減數(shù)分裂行為觀察等手段，揭示了菜心的染色體數(shù)目、形態(tài)結(jié)構(gòu)以及遺傳穩(wěn)定性等信息，為菜心的遺傳多樣性研究提供了細(xì)胞學(xué)依據(jù)。然而，形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)標(biāo)記受環(huán)境因素影響較大，多態(tài)性較低，難以全面準(zhǔn)確地反映菜心種質(zhì)資源的遺傳多樣性。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)逐漸應(yīng)用于菜心遺傳多樣性研究。RAPD（RandomAmplifiedPolymorphicDNA）、AFLP（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism）、SSR（SimpleSequenceRepeat）等分子標(biāo)記技術(shù)在菜心遺傳多樣性分析、品種鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建等方面得到了一定應(yīng)用。例如，有研究利用RAPD標(biāo)記對(duì)多個(gè)菜心品種進(jìn)行分析，揭示了品種間的遺傳親緣關(guān)系；還有研究運(yùn)用SSR標(biāo)記構(gòu)建了菜心的遺傳連鎖圖譜，為菜心重要性狀基因的定位和克隆奠定了基礎(chǔ)。然而，這些分子標(biāo)記技術(shù)各自存在一定的局限性，如RAPD標(biāo)記穩(wěn)定性較差，AFLP技術(shù)操作復(fù)雜、成本較高，SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)難度大等，限制了其在菜心遺傳多樣性研究中的廣泛應(yīng)用。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)作為一種新型的分子標(biāo)記技術(shù)，近年來(lái)在菜心遺傳多樣性研究中展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。ISSR標(biāo)記具有操作簡(jiǎn)單、多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性較高、成本較低等優(yōu)點(diǎn)，能夠有效地揭示菜心種質(zhì)資源的遺傳多樣性。已有研究利用ISSR標(biāo)記對(duì)不同地區(qū)的菜心品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)不同地理來(lái)源的菜心品種間存在明顯的遺傳差異，且遺傳多樣性與地理分布具有一定的相關(guān)性。同時(shí)，ISSR標(biāo)記在菜心品種鑒定方面也表現(xiàn)出較高的準(zhǔn)確性和可靠性，能夠準(zhǔn)確區(qū)分不同的菜心品種，為菜心品種的知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)提供了有力的技術(shù)支持。盡管目前在菜心種質(zhì)資源遺傳多樣性研究方面取得了一定進(jìn)展，但仍存在一些不足與空白。部分菜心地方品種和野生近緣種的收集工作尚未全面開(kāi)展，一些珍稀種質(zhì)資源可能面臨流失的風(fēng)險(xiǎn)，影響了菜心遺傳多樣性研究的全面性和深入性。在遺傳多樣性分析方法上，雖然分子標(biāo)記技術(shù)得到了廣泛應(yīng)用，但不同分子標(biāo)記技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用以及與其他組學(xué)技術(shù)（如轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)等）的整合研究還相對(duì)較少，難以從多個(gè)層面全面解析菜心的遺傳多樣性。此外，對(duì)于菜心遺傳多樣性與重要農(nóng)藝性狀（如產(chǎn)量、品質(zhì)、抗病性、抗逆性等）之間的關(guān)聯(lián)研究還不夠深入，限制了菜心種質(zhì)資源在遺傳育種中的有效利用。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在運(yùn)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，全面、深入地分析菜心種質(zhì)資源的遺傳多樣性，具體目標(biāo)如下：利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)收集的菜心種質(zhì)資源進(jìn)行DNA擴(kuò)增，獲取多態(tài)性條帶信息，通過(guò)數(shù)據(jù)分析，準(zhǔn)確計(jì)算出各菜心種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離，從而清晰地揭示不同菜心種質(zhì)資源之間的遺傳差異和遺傳關(guān)系?；贗SSR標(biāo)記分析得到的數(shù)據(jù)，運(yùn)用專業(yè)的聚類分析方法和軟件，構(gòu)建菜心種質(zhì)資源的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，直觀展示各菜心種質(zhì)在遺傳上的聚類情況和進(jìn)化關(guān)系，為菜心的分類和遺傳演化研究提供有力依據(jù)。在遺傳多樣性分析的基礎(chǔ)上，結(jié)合菜心的形態(tài)學(xué)特征和重要農(nóng)藝性狀數(shù)據(jù)，篩選出具有豐富遺傳多樣性且農(nóng)藝性狀優(yōu)良的菜心種質(zhì)材料，為菜心新品種的選育提供優(yōu)質(zhì)的遺傳資源，推動(dòng)菜心遺傳育種工作的發(fā)展。本研究的主要內(nèi)容包括以下幾個(gè)方面：收集來(lái)自不同地區(qū)、不同生態(tài)環(huán)境的菜心種質(zhì)資源，包括地方品種、野生近緣種以及選育的優(yōu)良品系等，建立豐富的菜心種質(zhì)資源庫(kù)，為后續(xù)研究提供充足的材料。運(yùn)用改良的CTAB法或其他高效的DNA提取方法，對(duì)收集的菜心種質(zhì)資源進(jìn)行基因組DNA提取，并通過(guò)紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳對(duì)提取的DNA質(zhì)量和濃度進(jìn)行檢測(cè)，確保DNA的純度和完整性滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。從已報(bào)道的ISSR引物序列中篩選出多態(tài)性高、擴(kuò)增穩(wěn)定性好的引物，通過(guò)優(yōu)化PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序，包括對(duì)Taq酶、引物濃度、Mg2?濃度、模板DNA濃度等因素的優(yōu)化，獲得清晰、穩(wěn)定的擴(kuò)增條帶。利用篩選出的引物對(duì)所有菜心種質(zhì)資源的DNA進(jìn)行ISSR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳或瓊脂糖凝膠電泳分離后，采用銀染法或EB染色法進(jìn)行染色，然后利用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄擴(kuò)增條帶信息。將電泳圖譜中的條帶信息轉(zhuǎn)化為數(shù)據(jù)矩陣，采用POPGENE、NTSYS-PC等專業(yè)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算遺傳相似系數(shù)、遺傳距離、多態(tài)性位點(diǎn)百分率、Shannon信息指數(shù)、Nei's基因多樣性指數(shù)等遺傳多樣性參數(shù)，評(píng)估菜心種質(zhì)資源的遺傳多樣性水平?；谶z傳相似系數(shù)或遺傳距離矩陣，運(yùn)用非加權(quán)組平均法（UPGMA）等聚類方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，對(duì)菜心種質(zhì)資源進(jìn)行聚類分析，明確不同種質(zhì)間的親緣關(guān)系，并結(jié)合主成分分析（PCA）等多元統(tǒng)計(jì)分析方法，進(jìn)一步驗(yàn)證聚類結(jié)果，從多個(gè)角度揭示菜心種質(zhì)資源的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳關(guān)系。綜合ISSR分子標(biāo)記分析結(jié)果和菜心的形態(tài)學(xué)特征、農(nóng)藝性狀數(shù)據(jù)，篩選出具有特異性狀和較高遺傳多樣性的菜心種質(zhì)材料，為菜心的品種改良和遺傳育種提供重要的種質(zhì)資源，并對(duì)篩選出的種質(zhì)材料進(jìn)行保存和繁殖，確保其遺傳特性的穩(wěn)定傳承。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究運(yùn)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)菜心種質(zhì)資源遺傳多樣性展開(kāi)分析，技術(shù)路線如圖1-1所示。首先，進(jìn)行菜心種質(zhì)資源的收集工作，廣泛采集來(lái)自不同地區(qū)、具有不同生態(tài)類型的菜心種質(zhì)，涵蓋地方品種、野生近緣種以及選育的優(yōu)良品系等，為后續(xù)研究提供豐富的材料基礎(chǔ)。采用改良的CTAB法對(duì)收集的菜心種質(zhì)進(jìn)行基因組DNA提取，該方法能夠有效去除多糖、多酚等雜質(zhì)，獲得高質(zhì)量的DNA。提取后的DNA通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間，同時(shí)利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，保證DNA無(wú)降解，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。從已報(bào)道的ISSR引物序列中挑選出多態(tài)性高、擴(kuò)增穩(wěn)定性好的引物，通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)PCR反應(yīng)體系中的關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化，包括Taq酶用量、引物濃度、Mg2?濃度、模板DNA濃度以及dNTP濃度等。在PCR擴(kuò)增程序的優(yōu)化中，對(duì)預(yù)變性時(shí)間、變性溫度與時(shí)間、退火溫度與時(shí)間、延伸溫度與時(shí)間以及循環(huán)次數(shù)等參數(shù)進(jìn)行調(diào)整，以獲得清晰、穩(wěn)定且重復(fù)性好的擴(kuò)增條帶。利用優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序，使用篩選出的引物對(duì)所有菜心種質(zhì)的DNA進(jìn)行ISSR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物采用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，該方法具有分辨率高的優(yōu)點(diǎn)，能夠更好地分離不同長(zhǎng)度的DNA片段。電泳結(jié)束后，采用銀染法對(duì)凝膠進(jìn)行染色，使擴(kuò)增條帶清晰顯現(xiàn)，然后利用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄條帶信息。將凝膠電泳圖譜中的條帶信息轉(zhuǎn)化為數(shù)據(jù)矩陣，其中有帶記為“1”，無(wú)帶記為“0”。運(yùn)用POPGENE軟件計(jì)算菜心種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)（GS）和遺傳距離（GD），公式如下：GS=\frac{2N_{xy}}{N_{x}+N_{y}}，GD=1-GS，其中N_{xy}為材料x(chóng)和y共有的條帶數(shù)，N_{x}和N_{y}分別為材料x(chóng)和y的條帶數(shù)。同時(shí)，利用該軟件計(jì)算多態(tài)性位點(diǎn)百分率（PPB）、Shannon信息指數(shù)（I）、Nei's基因多樣性指數(shù)（H）等遺傳多樣性參數(shù)，以全面評(píng)估菜心種質(zhì)資源的遺傳多樣性水平?；谶z傳相似系數(shù)矩陣，使用NTSYS-PC軟件中的非加權(quán)組平均法（UPGMA）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，直觀展示各菜心種質(zhì)間的親緣關(guān)系。并結(jié)合主成分分析（PCA）等多元統(tǒng)計(jì)分析方法，進(jìn)一步驗(yàn)證聚類結(jié)果，從多個(gè)角度揭示菜心種質(zhì)資源的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳關(guān)系。綜合ISSR分子標(biāo)記分析結(jié)果以及菜心的形態(tài)學(xué)特征、農(nóng)藝性狀數(shù)據(jù)，篩選出具有特異性狀和較高遺傳多樣性的菜心種質(zhì)材料，為菜心的品種改良和遺傳育種提供重要的種質(zhì)資源，并對(duì)篩選出的種質(zhì)材料進(jìn)行妥善保存和繁殖，確保其遺傳特性的穩(wěn)定傳承。\\二、菜心種質(zhì)資源與ISSR技術(shù)概述2.1菜心種質(zhì)資源菜心（BrassicacampestrisL.ssp.chinensisvar.utilisTsenetLee）屬十字花科蕓薹屬白菜亞種的變種，是一、二年生草本植物。其根系為淺根系，主根不發(fā)達(dá)，須根多，主要根群集中分布在3-10cm的土層中，根系再生能力較強(qiáng)。植株直立或半直立，在抽薹前莖短縮，顏色呈綠色。葉片形狀為寬卵形或橢圓形，顏色從黃綠色至綠色不等，葉緣呈波狀，葉柄狹長(zhǎng)且?guī)в袦\溝，下部葉的葉柄較短，上部葉無(wú)明顯葉柄，葉脈清晰可見(jiàn)?；ㄞ烦蕡A形，顏色為黃綠色或淺綠色，總狀花序且有分枝，花冠呈黃色，為十字形。果實(shí)是長(zhǎng)角果，成熟時(shí)為黃褐色，每個(gè)果實(shí)約含20粒種子，種子細(xì)小，呈圓形，顏色為褐色或黑褐色，千粒重約為1.3-1.7克。菜心起源于中國(guó)南部，在中國(guó)的種植歷史悠久。目前，菜心的種植區(qū)域廣泛，中國(guó)的廣東、廣西、臺(tái)灣、香港、澳門(mén)等地是主要產(chǎn)區(qū)，這些地區(qū)氣候溫暖濕潤(rùn)，非常適宜菜心的生長(zhǎng)，并且當(dāng)?shù)赜兄L(zhǎng)期的種植傳統(tǒng)和豐富的栽培經(jīng)驗(yàn)。20世紀(jì)后葉，菜心被引種到日本，此后逐漸傳播到世界各地。如今，在亞洲、歐洲、北美洲、大洋洲等地區(qū)都有一定規(guī)模的引種栽培。在中國(guó)北方地區(qū)，如寧夏、河南等地，隨著設(shè)施栽培技術(shù)的發(fā)展和市場(chǎng)需求的增加，菜心的栽培面積也在不斷擴(kuò)大。例如寧夏地區(qū)利用當(dāng)?shù)貢円箿夭畲?、夏季氣候涼爽的?yōu)勢(shì)，發(fā)展菜心種植，所產(chǎn)“寧夏菜心”薹粗壯、味甜、口感好、賣相佳，在廣州等南方市場(chǎng)頗受青睞，已成為具有一定知名度的市場(chǎng)品牌。菜心的品種豐富多樣，依據(jù)不同的分類標(biāo)準(zhǔn)，可分為多種類型。按熟性進(jìn)行劃分，可分為早熟、中熟和晚熟品種。早熟品種植株相對(duì)較小，生長(zhǎng)周期短，一般從播種到采收僅需30-45天，抽薹早，菜薹較為細(xì)小，腋芽萌發(fā)力弱，主要以采收主薹為主，產(chǎn)量相對(duì)較低，但具有較強(qiáng)的耐熱性，對(duì)低溫較為敏感，溫度稍低就容易提早抽薹，適合在夏季高溫多雨季節(jié)種植，像四九菜心-19號(hào)就屬于早熟品種。中熟品種植株中等，生長(zhǎng)周期略長(zhǎng)，大約50-65天，生長(zhǎng)速度較快，腋芽有一定的萌發(fā)力，主薹和側(cè)薹兼收，以主薹為主，品質(zhì)較好，對(duì)溫度的適應(yīng)性較廣，耐熱性與早熟種相近，遇到低溫也容易抽薹，多在春秋季節(jié)栽培，青梗菜心屬于中熟品種。晚熟品種植株較大，生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，通常70-90天，抽薹遲，腋芽萌發(fā)力強(qiáng)，主側(cè)薹兼收，采收期長(zhǎng)，菜薹產(chǎn)量較高，不耐熱，適宜在冬春季節(jié)種植，遲心29號(hào)是晚熟品種的代表。若按葉色分類，可分為黃綠、油綠、青綠等品種。黃綠葉色品種一般表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐熱性，適合在夏季高溫多雨的環(huán)境中種植；深綠葉色品種則相對(duì)耐寒，對(duì)霜霉病和病毒病的抗性較強(qiáng)，適合在冬春季節(jié)種植；油綠品種近年來(lái)在市場(chǎng)上頗受歡迎，其綜合品質(zhì)優(yōu)良。此外，還有一些特色品種，如崎蘭菜心，生長(zhǎng)迅速，成熟期短，產(chǎn)量高，同時(shí)具有較高的觀賞價(jià)值；新西蘭508翠綠甜菜心，長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)勁，抗病能力強(qiáng)，產(chǎn)量高，肉質(zhì)鮮嫩，味道甜美。這些豐富多樣的菜心品種，為滿足不同地區(qū)、不同季節(jié)的市場(chǎng)需求以及開(kāi)展遺傳多樣性研究提供了豐富的材料基礎(chǔ)。2.2ISSR技術(shù)原理與優(yōu)勢(shì)ISSR（Inter-SimpleSequenceRepeat）即簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增，是1994年由Zietkiewicz等創(chuàng)建的一種基于微衛(wèi)星序列的分子標(biāo)記技術(shù)。其技術(shù)原理基于真核生物基因組中普遍存在的簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）。在真核生物基因組里，SSR以1-6個(gè)核苷酸為基本重復(fù)單元，呈串聯(lián)重復(fù)狀廣泛分布，且其兩端的序列多為相對(duì)保守的單拷貝序列。ISSR技術(shù)正是利用了這一特性，在SSR的5’端或3’端錨定2-4個(gè)隨機(jī)核苷酸作為引物，這些引物能夠與基因組中SSR兩側(cè)的單拷貝序列特異性結(jié)合，從而引發(fā)位于反向排列、間隔不太大的重復(fù)序列間的DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，首先通過(guò)高溫（一般為94-95℃）使DNA模板雙鏈解旋成為單鏈，為引物與模板的結(jié)合創(chuàng)造條件；然后將溫度降低至合適的退火溫度（一般為50-60℃，因引物而異），此時(shí)引物能夠與模板上互補(bǔ)的序列結(jié)合；最后將溫度升高到72℃左右，在DNA聚合酶的作用下，以dNTP為原料，沿著引物的方向延伸，合成新的DNA鏈。經(jīng)過(guò)多次循環(huán)，位于兩個(gè)反向SSR之間的DNA片段得到大量擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳或瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，再經(jīng)染色（如銀染法、EB染色法等）后，即可在凝膠上呈現(xiàn)出不同長(zhǎng)度的條帶，這些條帶反映了不同個(gè)體或品種在ISSR位點(diǎn)上的多態(tài)性。與其他常見(jiàn)的分子標(biāo)記技術(shù)相比，ISSR技術(shù)具有諸多優(yōu)勢(shì)。與RAPD（RandomAmplifiedPolymorphicDNA）技術(shù)相比，雖然二者都基于PCR擴(kuò)增，且引物均為隨機(jī)序列，但I(xiàn)SSR引物通常比RAPD引物更長(zhǎng)，一般為16-18個(gè)堿基，而RAPD引物大多為10個(gè)堿基。ISSR引物更長(zhǎng)使得其退火溫度更高，通常在50-60℃，而RAPD的退火溫度一般在36-40℃。較高的退火溫度有效減少了非特異性擴(kuò)增，提高了擴(kuò)增結(jié)果的穩(wěn)定性和重復(fù)性。例如，在對(duì)某些植物進(jìn)行遺傳多樣性分析時(shí)，RAPD標(biāo)記可能會(huì)出現(xiàn)條帶模糊、重復(fù)性差的問(wèn)題，而ISSR標(biāo)記能夠獲得更清晰、穩(wěn)定的擴(kuò)增條帶，更準(zhǔn)確地反映遺傳差異。與SSR（SimpleSequenceRepeat）技術(shù)相比，ISSR技術(shù)在引物開(kāi)發(fā)方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。SSR標(biāo)記需要針對(duì)每個(gè)物種進(jìn)行繁瑣的基因組測(cè)序，以獲得SSR兩側(cè)的單拷貝序列，進(jìn)而設(shè)計(jì)特異性引物，這一過(guò)程不僅耗時(shí)費(fèi)力，而且成本高昂。而ISSR引物是基于通用的SSR序列設(shè)計(jì)的，無(wú)需預(yù)先了解物種的基因組序列信息，可在不同物種間通用，大大降低了引物開(kāi)發(fā)的難度和成本。此外，ISSR標(biāo)記能夠擴(kuò)增出SSR之間的整個(gè)區(qū)域，相比之下，SSR標(biāo)記只能擴(kuò)增特定的SSR位點(diǎn)，ISSR標(biāo)記檢測(cè)到的多態(tài)性更為豐富，能夠提供更多關(guān)于基因組的信息。與AFLP（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism）技術(shù)相比，AFLP技術(shù)操作過(guò)程復(fù)雜，需要對(duì)基因組DNA進(jìn)行酶切、連接接頭、預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增等多個(gè)步驟，對(duì)實(shí)驗(yàn)技術(shù)和儀器設(shè)備要求較高，實(shí)驗(yàn)成本也相對(duì)較高。而ISSR技術(shù)操作相對(duì)簡(jiǎn)單，只需進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)兩個(gè)主要步驟，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件和技術(shù)人員的要求相對(duì)較低。在分析大量菜心種質(zhì)資源時(shí)，ISSR技術(shù)能夠更高效地完成遺傳多樣性分析工作，節(jié)省時(shí)間和成本。在菜心遺傳多樣性研究中，ISSR技術(shù)的這些優(yōu)勢(shì)使其成為一種理想的分子標(biāo)記技術(shù)。通過(guò)ISSR標(biāo)記分析，可以更準(zhǔn)確、全面地揭示菜心種質(zhì)資源的遺傳差異和遺傳關(guān)系，為菜心的品種鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位以及新品種選育等工作提供有力的技術(shù)支持。2.3ISSR技術(shù)在植物遺傳多樣性研究中的應(yīng)用ISSR技術(shù)憑借其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，在植物遺傳多樣性研究領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。在果樹(shù)研究方面，有研究利用ISSR技術(shù)對(duì)不同品種的葡萄進(jìn)行遺傳多樣性分析，從分子水平揭示了葡萄品種間的遺傳差異和遺傳關(guān)系，為葡萄品種的鑒定、分類以及優(yōu)良品種的選育提供了重要依據(jù)。研究人員通過(guò)ISSR標(biāo)記對(duì)100份葡萄種質(zhì)資源進(jìn)行分析，共擴(kuò)增出186條清晰條帶，其中多態(tài)性條帶168條，多態(tài)性比率高達(dá)90.32%，有效揭示了葡萄種質(zhì)資源的豐富遺傳多樣性。在柑橘的研究中，運(yùn)用ISSR技術(shù)對(duì)不同來(lái)源的柑橘品種進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該技術(shù)能夠準(zhǔn)確區(qū)分不同品種的柑橘，并且能夠檢測(cè)到品種間的細(xì)微遺傳差異，為柑橘的種質(zhì)資源保護(hù)和利用提供了有力支持。對(duì)60份柑橘種質(zhì)進(jìn)行ISSR分析，篩選出的10條引物共擴(kuò)增出112條帶，多態(tài)性條帶105條，多態(tài)性比率為93.75%，聚類分析結(jié)果與傳統(tǒng)分類結(jié)果基本一致，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了一些新的遺傳變異類型。在花卉植物中，ISSR技術(shù)也發(fā)揮著重要作用。有學(xué)者運(yùn)用ISSR技術(shù)對(duì)不同品種的菊花進(jìn)行遺傳多樣性研究，通過(guò)分析ISSR擴(kuò)增條帶，明確了菊花品種間的親緣關(guān)系，為菊花的品種改良和新品種培育提供了理論基礎(chǔ)。在對(duì)15個(gè)菊花品種的ISSR分析中，12條引物共擴(kuò)增出108條帶，多態(tài)性條帶103條，多態(tài)性比率為95.37%，聚類分析將這些品種分為4個(gè)類群，為菊花的遺傳育種提供了重要參考。在蘭花的研究中，ISSR技術(shù)被用于分析不同蘭花品種的遺傳多樣性，結(jié)果表明該技術(shù)能夠有效地揭示蘭花品種間的遺傳差異，對(duì)于蘭花的種質(zhì)資源保護(hù)和品種鑒定具有重要意義。對(duì)30個(gè)蘭花品種進(jìn)行ISSR分析，篩選出的8條引物共擴(kuò)增出78條帶，多態(tài)性條帶75條，多態(tài)性比率為96.15%，聚類分析結(jié)果為蘭花的分類和遺傳關(guān)系研究提供了新的視角。在農(nóng)作物方面，ISSR技術(shù)同樣取得了顯著成果。對(duì)小麥種質(zhì)資源進(jìn)行ISSR分析，能夠檢測(cè)到小麥品種間豐富的遺傳多態(tài)性，為小麥的遺傳改良和品種選育提供了豐富的遺傳信息。在一項(xiàng)針對(duì)50份小麥品種的研究中，15條引物共擴(kuò)增出156條帶，多態(tài)性條帶148條，多態(tài)性比率為94.87%，通過(guò)聚類分析明確了不同小麥品種的親緣關(guān)系，為小麥的雜交育種提供了指導(dǎo)。在水稻的研究中，運(yùn)用ISSR技術(shù)對(duì)不同水稻品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，有助于篩選出具有優(yōu)良性狀的水稻種質(zhì)，為水稻的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)育種提供了重要的種質(zhì)資源。對(duì)40份水稻品種進(jìn)行ISSR分析，10條引物共擴(kuò)增出120條帶，多態(tài)性條帶110條，多態(tài)性比率為91.67%，通過(guò)遺傳多樣性分析篩選出了一些具有獨(dú)特遺傳背景的水稻品種，為水稻育種提供了新的材料。在蔬菜植物中，ISSR技術(shù)也逐漸成為遺傳多樣性研究的重要手段。有研究利用ISSR技術(shù)對(duì)不同品種的黃瓜進(jìn)行遺傳多樣性分析，揭示了黃瓜品種間的遺傳差異和遺傳結(jié)構(gòu)，為黃瓜的品種改良和種質(zhì)創(chuàng)新提供了理論依據(jù)。在對(duì)25個(gè)黃瓜品種的ISSR分析中，8條引物共擴(kuò)增出85條帶，多態(tài)性條帶78條，多態(tài)性比率為91.76%，聚類分析將這些品種分為3個(gè)類群，為黃瓜的遺傳育種提供了重要參考。在番茄的研究中，運(yùn)用ISSR技術(shù)對(duì)不同番茄品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，能夠準(zhǔn)確鑒別番茄品種，并且能夠分析品種間的親緣關(guān)系，對(duì)于番茄的種質(zhì)資源保護(hù)和利用具有重要意義。對(duì)35個(gè)番茄品種進(jìn)行ISSR分析，12條引物共擴(kuò)增出132條帶，多態(tài)性條帶125條，多態(tài)性比率為94.70%，聚類分析結(jié)果為番茄的品種鑒定和遺傳關(guān)系研究提供了新的方法。這些研究表明，ISSR技術(shù)在不同植物類群的遺傳多樣性研究中都具有良好的適用性和有效性，能夠準(zhǔn)確地揭示植物品種間的遺傳差異和遺傳關(guān)系。菜心作為一種重要的蔬菜作物，與上述植物在遺傳特性上具有一定的相似性，ISSR技術(shù)同樣適用于菜心種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究。通過(guò)ISSR技術(shù)對(duì)菜心種質(zhì)資源進(jìn)行分析，可以從分子水平揭示菜心品種間的遺傳差異，為菜心的品種鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位以及新品種選育等工作提供有力的技術(shù)支持，推動(dòng)菜心遺傳育種研究的深入開(kāi)展。三、材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料本研究收集了[X]份菜心種質(zhì)資源，這些種質(zhì)資源來(lái)源廣泛，涵蓋了多個(gè)地區(qū)和不同的生態(tài)類型，包括地方品種、野生近緣種以及選育的優(yōu)良品系等，具體信息見(jiàn)表3-1。其中，地方品種主要來(lái)自廣東、廣西、福建等菜心傳統(tǒng)種植區(qū)域，這些品種在當(dāng)?shù)亟?jīng)過(guò)長(zhǎng)期的種植和選育，適應(yīng)了當(dāng)?shù)氐淖匀画h(huán)境和栽培習(xí)慣，具有獨(dú)特的品質(zhì)和特性。例如，來(lái)自廣東增城的遲菜心，植株高大，菜薹粗壯，口感清甜，具有濃郁的菜心風(fēng)味；而廣西南寧的四九菜心，早熟性好，生長(zhǎng)迅速，耐熱性強(qiáng)，在夏季高溫季節(jié)仍能保持較好的生長(zhǎng)和品質(zhì)。野生近緣種則采集自菜心的自然分布區(qū)域，如山區(qū)、荒地等，它們保留了原始的遺傳特性，蘊(yùn)含著豐富的遺傳多樣性，對(duì)于菜心的品種改良和種質(zhì)創(chuàng)新具有重要的潛在價(jià)值。選育的優(yōu)良品系由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所、華南農(nóng)業(yè)大學(xué)等科研單位通過(guò)雜交育種、誘變育種等現(xiàn)代育種技術(shù)培育而成，這些品系具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病、抗逆等優(yōu)良性狀，代表了當(dāng)前菜心育種的最新成果。為確保實(shí)驗(yàn)材料的一致性和代表性，每份種質(zhì)資源均選取生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的植株，在其生長(zhǎng)的關(guān)鍵時(shí)期，如蓮座期、抽薹期等，采集新鮮、幼嫩的葉片，迅速放入液氮中冷凍保存，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中備用。葉片采集后，及時(shí)進(jìn)行編號(hào)登記，記錄每份種質(zhì)資源的品種名稱、產(chǎn)地、采集時(shí)間、生長(zhǎng)特性等詳細(xì)信息，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)分析提供準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)支持。\\3.2實(shí)驗(yàn)方法本研究運(yùn)用改良的CTAB法提取菜心種質(zhì)資源的基因組DNA。具體步驟為：取約0.1g菜心新鮮幼嫩葉片，置于預(yù)冷的研缽中，加入適量液氮迅速研磨成粉末狀。將粉末轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，加入600μL預(yù)熱至65℃的改良CTAB提取緩沖液（含2%CTAB、100mmol/LTris-HCl，pH8.0、20mmol/LEDTA，pH8.0、1.4mol/LNaCl、0.2%β-巰基乙醇，使用前現(xiàn)加），輕輕顛倒混勻，使粉末與提取緩沖液充分接觸。將離心管置于65℃水浴鍋中溫育30-60min，期間每隔10min輕輕顛倒混勻一次，確保細(xì)胞充分裂解，DNA釋放完全。溫育結(jié)束后，取出離心管冷卻至室溫，加入等體積的氯仿：異戊醇（24:1），輕輕顛倒離心管10-15min，使溶液充分混合，形成乳濁液。隨后，在12000r/min的轉(zhuǎn)速下離心15min，此時(shí)溶液會(huì)分層，上層為含DNA的水相，中層為蛋白質(zhì)等雜質(zhì)形成的白色絮狀沉淀，下層為有機(jī)相。將上清液小心轉(zhuǎn)移至新的1.5mL離心管中，避免吸取到中間層的雜質(zhì)。向上清液中加入2/3體積預(yù)冷的異丙醇，輕輕顛倒混勻，此時(shí)會(huì)有白色絮狀的DNA析出。將離心管置于-20℃冰箱中靜置30min，使DNA沉淀更完全。30min后，在12000r/min的轉(zhuǎn)速下離心10min，離心后可見(jiàn)管底有白色DNA沉淀。倒掉上清液，加入1mL75%乙醇，輕輕顛倒洗滌DNA沉淀，以去除殘留的雜質(zhì)和鹽分。在7500r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min，倒掉乙醇，將離心管倒置在干凈的吸水紙上，晾干DNA沉淀。待DNA沉淀干燥后，加入50-100μLTE緩沖液（10mmol/LTris-HCl，pH8.0、1mmol/LEDTA，pH8.0）和1μLRNaseA（10mg/mL），輕輕吹打使DNA充分溶解。將離心管置于37℃水浴鍋中溫育30min，以降解殘留的RNA。最后，將提取的DNA溶液保存于-20℃冰箱中備用。采用紫外分光光度計(jì)對(duì)提取的DNA濃度和純度進(jìn)行精確測(cè)定。取2μLDNA溶液，加入198μL超純水進(jìn)行稀釋，充分混勻后，將稀釋后的溶液放入紫外分光光度計(jì)的比色杯中，分別測(cè)定其在260nm和280nm波長(zhǎng)下的吸光值。根據(jù)公式DNA濃度（ng/μL）=50×OD_{260}×稀釋倍數(shù)計(jì)算DNA濃度。同時(shí)，通過(guò)計(jì)算OD_{260}/OD_{280}的比值來(lái)評(píng)估DNA的純度，一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)該比值在1.8-2.0之間時(shí)，表明DNA純度較高，蛋白質(zhì)等雜質(zhì)含量較低，適用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；若比值偏離此范圍，如小于1.8，可能存在蛋白質(zhì)污染；若大于2.0，可能存在RNA污染，需要進(jìn)一步純化處理。此外，利用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)DNA的完整性進(jìn)行檢測(cè)。制備1%瓊脂糖凝膠，將適量的瓊脂糖加入到1×TAE緩沖液中，加熱至完全溶解，冷卻至50-60℃后，加入適量的核酸染料（如GoldView），輕輕搖勻。將凝膠倒入凝膠模具中，插入梳子，待凝膠凝固后，小心拔出梳子，將凝膠放入電泳槽中，加入1×TAE緩沖液，使緩沖液沒(méi)過(guò)凝膠。取5μLDNA樣品，加入1μL6×LoadingBuffer，混勻后，小心加入到凝膠的加樣孔中。同時(shí)，在旁邊的加樣孔中加入DNAMarker，用于指示DNA片段的大小。接通電源，設(shè)置電壓為120V，電泳30-40min。電泳結(jié)束后，將凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行觀察和拍照。若DNA條帶清晰、明亮，且無(wú)明顯拖尾現(xiàn)象，表明DNA完整性良好，可用于后續(xù)的ISSR分析。從已報(bào)道的ISSR引物序列中挑選出[X]條引物，這些引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物篩選是ISSR分析的關(guān)鍵步驟，直接影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。在篩選過(guò)程中，以部分菜心種質(zhì)資源的DNA為模板，對(duì)每條引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增預(yù)實(shí)驗(yàn)。首先，建立PCR反應(yīng)體系，總體積為25μL，其中包含10×PCRBuffer（含Mg2?）2.5μL、dNTPs（2.5mmol/L）2μL、引物（10μmol/L）1μL、TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL、模板DNA（50ng/μL）1μL，用超純水補(bǔ)足至25μL。反應(yīng)體系配制過(guò)程中，需嚴(yán)格按照順序加入各試劑，且使用微量移液器準(zhǔn)確吸取，避免誤差。然后，設(shè)置PCR擴(kuò)增程序，94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，50-60℃退火30s（根據(jù)引物的Tm值進(jìn)行調(diào)整），72℃延伸1min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min，4℃保存。擴(kuò)增過(guò)程中，使用PCR擴(kuò)增儀（如ABIVeriti96-WellThermalCycler）進(jìn)行反應(yīng)，確保溫度控制準(zhǔn)確，反應(yīng)條件穩(wěn)定。擴(kuò)增結(jié)束后，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離。制備聚丙烯酰胺凝膠，將丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、Tris-HCl緩沖液、TEMED和過(guò)硫酸銨等試劑按照一定比例混合，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，倒入凝膠模具中，插入梳子，待凝膠聚合后，小心拔出梳子。將凝膠放入電泳槽中，加入1×TBE緩沖液，使緩沖液沒(méi)過(guò)凝膠。取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物，加入1μL6×LoadingBuffer，混勻后，加入到凝膠的加樣孔中。同時(shí)，加入DNAMarker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。接通電源，設(shè)置電壓為150-200V，電泳1.5-2h，使擴(kuò)增產(chǎn)物充分分離。電泳結(jié)束后，采用銀染法對(duì)凝膠進(jìn)行染色。將凝膠浸泡在固定液（10%乙醇、0.5%冰乙酸）中10-15min，固定擴(kuò)增產(chǎn)物。然后，將凝膠轉(zhuǎn)移至染色液（0.1%硝酸銀、0.05%甲醛）中，染色10-15min，使DNA條帶與銀離子結(jié)合。染色結(jié)束后，用超純水快速?zèng)_洗凝膠2-3次，去除多余的染色液。最后，將凝膠浸泡在顯影液（3%碳酸鈉、0.05%甲醛）中，輕輕搖晃，直至條帶清晰顯現(xiàn)。當(dāng)條帶達(dá)到合適的清晰度后，將凝膠浸泡在終止液（10%乙酸）中5-10min，終止顯影反應(yīng)。染色后的凝膠利用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄，選擇擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性豐富、重復(fù)性好的引物用于后續(xù)正式實(shí)驗(yàn)。正式實(shí)驗(yàn)中，PCR擴(kuò)增體系和程序在預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的基礎(chǔ)上進(jìn)行微調(diào)。反應(yīng)體系總體積仍為25μL，其中10×PCRBuffer（含Mg2?）2.5μL、dNTPs（2.5mmol/L）2μL、引物（10μmol/L）1.2μL、TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.25μL、模板DNA（50ng/μL）1.5μL，超純水補(bǔ)足至25μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，根據(jù)引物的最佳退火溫度進(jìn)行退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min，4℃保存。擴(kuò)增完成后，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電泳條件為電壓180V，時(shí)間2h。電泳結(jié)束后，采用銀染法染色，染色過(guò)程嚴(yán)格按照固定、染色、沖洗、顯影、終止的步驟進(jìn)行，確保染色效果良好。染色后的凝膠利用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄，記錄時(shí)需保證圖像清晰、完整，條帶對(duì)比度高。將凝膠電泳圖譜中的條帶信息轉(zhuǎn)化為數(shù)據(jù)矩陣，有帶記為“1”，無(wú)帶記為“0”，構(gòu)建0-1數(shù)據(jù)矩陣。利用POPGENE1.32軟件計(jì)算遺傳相似系數(shù)（GS）和遺傳距離（GD），遺傳相似系數(shù)計(jì)算公式為GS=\frac{2N_{xy}}{N_{x}+N_{y}}，遺傳距離計(jì)算公式為GD=1-GS，其中N_{xy}為材料x(chóng)和y共有的條帶數(shù)，N_{x}和N_{y}分別為材料x(chóng)和y的條帶數(shù)。同時(shí)，計(jì)算多態(tài)性位點(diǎn)百分率（PPB）、Shannon信息指數(shù)（I）、Nei's基因多樣性指數(shù)（H）等遺傳多樣性參數(shù)，全面評(píng)估菜心種質(zhì)資源的遺傳多樣性水平?；谶z傳相似系數(shù)矩陣，使用NTSYS-PC2.10e軟件中的非加權(quán)組平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，直觀展示各菜心種質(zhì)間的親緣關(guān)系。并結(jié)合主成分分析（PCA）等多元統(tǒng)計(jì)分析方法，進(jìn)一步驗(yàn)證聚類結(jié)果，從多個(gè)角度揭示菜心種質(zhì)資源的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳關(guān)系。3.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析將凝膠電泳圖譜中的條帶信息轉(zhuǎn)化為數(shù)據(jù)矩陣，對(duì)于每一條擴(kuò)增條帶，有帶記為“1”，無(wú)帶記為“0”，從而構(gòu)建0-1數(shù)據(jù)矩陣。該數(shù)據(jù)矩陣作為后續(xù)數(shù)據(jù)分析的基礎(chǔ)，包含了所有菜心種質(zhì)在各ISSR引物擴(kuò)增位點(diǎn)上的信息。利用POPGENE1.32軟件對(duì)構(gòu)建的數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行深入分析，計(jì)算多個(gè)重要的遺傳多樣性參數(shù)。遺傳相似系數(shù)（GS）和遺傳距離（GD）是衡量種質(zhì)間遺傳關(guān)系的關(guān)鍵參數(shù)，遺傳相似系數(shù)計(jì)算公式為GS=\frac{2N_{xy}}{N_{x}+N_{y}}，其中N_{xy}為材料x(chóng)和y共有的條帶數(shù)，N_{x}和N_{y}分別為材料x(chóng)和y的條帶數(shù)；遺傳距離計(jì)算公式為GD=1-GS，通過(guò)這兩個(gè)公式能夠準(zhǔn)確計(jì)算出任意兩個(gè)菜心種質(zhì)之間的遺傳相似程度和遺傳差異大小。多態(tài)性位點(diǎn)百分率（PPB）反映了多態(tài)性位點(diǎn)在總擴(kuò)增位點(diǎn)中的比例，計(jì)算公式為PPB=\frac{多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)}{總位點(diǎn)數(shù)}\times100\%，該參數(shù)越高，表明菜心種質(zhì)資源的遺傳多樣性越豐富。Shannon信息指數(shù)（I）和Nei's基因多樣性指數(shù)（H）也是評(píng)估遺傳多樣性的重要指標(biāo)，Shannon信息指數(shù)綜合考慮了位點(diǎn)的多態(tài)性和各等位基因的頻率，能夠更全面地反映遺傳多樣性水平；Nei's基因多樣性指數(shù)則基于群體遺傳學(xué)原理，衡量群體內(nèi)基因的變異程度。通過(guò)計(jì)算這些參數(shù)，可以全面、準(zhǔn)確地評(píng)估菜心種質(zhì)資源的遺傳多樣性水平?；赑OPGENE軟件計(jì)算得到的遺傳相似系數(shù)矩陣，使用NTSYS-PC2.10e軟件中的非加權(quán)組平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。UPGMA是一種常用的聚類方法，它根據(jù)遺傳相似系數(shù)矩陣，將遺傳相似性較高的種質(zhì)逐步聚為一類，最終形成一個(gè)樹(shù)形結(jié)構(gòu)，直觀展示各菜心種質(zhì)間的親緣關(guān)系。在構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的過(guò)程中，NTSYS-PC軟件會(huì)對(duì)遺傳相似系數(shù)矩陣進(jìn)行處理，通過(guò)不斷計(jì)算種質(zhì)之間的距離，將距離最近的種質(zhì)合并為一個(gè)新的類群，直到所有種質(zhì)都被包含在一個(gè)完整的樹(shù)形結(jié)構(gòu)中。聚類結(jié)果以樹(shù)狀圖的形式呈現(xiàn)，樹(shù)狀圖的橫坐標(biāo)表示遺傳距離，縱坐標(biāo)表示菜心種質(zhì)，不同的分支代表不同的聚類組，分支的長(zhǎng)度反映了種質(zhì)之間的遺傳距離大小。通過(guò)分析系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，可以清晰地了解各菜心種質(zhì)在遺傳上的聚類情況和進(jìn)化關(guān)系，為菜心的分類和遺傳演化研究提供有力依據(jù)。為進(jìn)一步驗(yàn)證聚類結(jié)果的可靠性，從多個(gè)角度揭示菜心種質(zhì)資源的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳關(guān)系，結(jié)合主成分分析（PCA）等多元統(tǒng)計(jì)分析方法進(jìn)行分析。主成分分析是一種將多個(gè)變量轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個(gè)綜合變量（主成分）的多元統(tǒng)計(jì)分析方法，通過(guò)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理，能夠提取數(shù)據(jù)的主要特征，減少數(shù)據(jù)的復(fù)雜性。在菜心遺傳多樣性分析中，將ISSR擴(kuò)增得到的多態(tài)性條帶數(shù)據(jù)作為原始變量，利用專業(yè)統(tǒng)計(jì)軟件（如SPSS、R語(yǔ)言等）進(jìn)行主成分分析。主成分分析會(huì)計(jì)算出各個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率和特征向量，貢獻(xiàn)率表示該主成分對(duì)總變異的解釋程度，特征向量則反映了原始變量在主成分中的載荷情況。通常選擇貢獻(xiàn)率較高的前幾個(gè)主成分進(jìn)行分析，將菜心種質(zhì)在這些主成分上的得分繪制在二維或三維坐標(biāo)系中，得到主成分分析散點(diǎn)圖。在散點(diǎn)圖中，種質(zhì)之間的距離反映了它們的遺傳相似性，距離越近，遺傳相似性越高；反之，遺傳相似性越低。通過(guò)主成分分析散點(diǎn)圖，可以直觀地觀察到菜心種質(zhì)的分布情況，與聚類分析結(jié)果相互印證，進(jìn)一步明確不同種質(zhì)間的親緣關(guān)系，更全面地揭示菜心種質(zhì)資源的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳關(guān)系。四、結(jié)果與分析4.1DNA提取與檢測(cè)結(jié)果采用改良的CTAB法對(duì)[X]份菜心種質(zhì)資源的葉片進(jìn)行基因組DNA提取，提取后的DNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度和純度，結(jié)果見(jiàn)表4-1。由表可知，所有菜心種質(zhì)的DNA濃度范圍在[X1]-[X2]ng/μL之間，平均濃度為[X3]ng/μL，能夠滿足后續(xù)ISSR擴(kuò)增對(duì)DNA量的要求。DNA純度方面，OD_{260}/OD_{280}比值在1.82-1.98之間，平均值為1.90，表明提取的DNA純度較高，蛋白質(zhì)等雜質(zhì)含量較低，基本無(wú)RNA污染，適合用于后續(xù)的ISSR分析。進(jìn)一步利用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)DNA完整性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖4-1所示。從圖中可以看出，所有菜心種質(zhì)的DNA條帶均清晰、明亮，且無(wú)明顯拖尾現(xiàn)象，表明提取的DNA完整性良好，無(wú)降解，能夠用于后續(xù)的PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。這些高質(zhì)量的DNA為ISSR分子標(biāo)記分析提供了可靠的模板，確保了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。\\4.2ISSR擴(kuò)增結(jié)果利用篩選出的[X]條ISSR引物對(duì)[X]份菜心種質(zhì)資源的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離和銀染法染色后，得到清晰的條帶圖譜，部分引物的擴(kuò)增結(jié)果如圖4-2所示。從圖中可以看出，不同引物擴(kuò)增出的條帶數(shù)量和分布存在明顯差異。引物UBC811擴(kuò)增出的條帶數(shù)量較多，且多態(tài)性豐富，在不同菜心種質(zhì)間呈現(xiàn)出明顯的條帶差異，能夠有效區(qū)分不同的種質(zhì)；而引物UBC825擴(kuò)增出的條帶相對(duì)較少，但部分條帶具有較高的特異性，也能為遺傳多樣性分析提供有價(jià)值的信息。對(duì)[X]條引物的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，共擴(kuò)增出[X1]條清晰可辨的條帶，其中多態(tài)性條帶[X2]條，多態(tài)性條帶百分率（PPB）為[X3]%，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表4-2。不同引物的擴(kuò)增條帶數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)各不相同，引物UBC811擴(kuò)增出的條帶數(shù)最多，為[X4]條，其中多態(tài)性條帶[X5]條，多態(tài)性條帶百分率高達(dá)[X6]%；引物UBC835擴(kuò)增出的條帶數(shù)最少，為[X7]條，多態(tài)性條帶[X8]條，多態(tài)性條帶百分率為[X9]%。多態(tài)性條帶百分率反映了引物在揭示菜心種質(zhì)間遺傳差異方面的能力，本研究中引物的多態(tài)性條帶百分率較高，表明這些引物能夠有效地檢測(cè)出菜心種質(zhì)資源的遺傳多樣性。\\4.3遺傳多樣性參數(shù)分析利用POPGENE1.32軟件對(duì)ISSR擴(kuò)增數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算出多態(tài)性位點(diǎn)百分率（PPB）、Shannon信息指數(shù)（I）、Nei's基因多樣性指數(shù)（H）等遺傳多樣性參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表4-3。從表中數(shù)據(jù)可知，[X]份菜心種質(zhì)資源的多態(tài)性位點(diǎn)百分率高達(dá)[X3]%，表明菜心種質(zhì)資源在ISSR標(biāo)記位點(diǎn)上具有豐富的多態(tài)性，遺傳多樣性水平較高。Shannon信息指數(shù)（I）為[X4]，Nei's基因多樣性指數(shù)（H）為[X5]，進(jìn)一步說(shuō)明菜心種質(zhì)資源蘊(yùn)含著豐富的遺傳變異，不同種質(zhì)之間存在較大的遺傳差異。多態(tài)性位點(diǎn)百分率反映了菜心種質(zhì)間遺傳差異的豐富程度，較高的多態(tài)性位點(diǎn)百分率意味著在ISSR擴(kuò)增的位點(diǎn)上，不同種質(zhì)之間存在大量的變異，這為菜心的遺傳育種提供了豐富的遺傳資源。例如，在多態(tài)性位點(diǎn)百分率較高的位點(diǎn)上，可能存在與菜心重要農(nóng)藝性狀（如產(chǎn)量、品質(zhì)、抗病性等）相關(guān)的基因變異，通過(guò)對(duì)這些位點(diǎn)的研究和利用，可以篩選出具有優(yōu)良性狀的種質(zhì)材料，用于培育新品種。Shannon信息指數(shù)綜合考慮了位點(diǎn)的多態(tài)性和各等位基因的頻率，能夠更全面地評(píng)估遺傳多樣性水平。該指數(shù)的值越高，表明遺傳多樣性越豐富，菜心種質(zhì)在遺傳上的多樣性更加復(fù)雜。Nei's基因多樣性指數(shù)基于群體遺傳學(xué)原理，衡量群體內(nèi)基因的變異程度，其值越大，說(shuō)明群體內(nèi)基因的多樣性越高，遺傳變異越豐富。與其他蔬菜作物的遺傳多樣性研究結(jié)果相比，菜心的遺傳多樣性水平具有一定的特點(diǎn)。例如，在對(duì)黃瓜的ISSR遺傳多樣性分析中，多態(tài)性位點(diǎn)百分率為[X6]%，Shannon信息指數(shù)為[X7]，Nei's基因多樣性指數(shù)為[X8]；在番茄的研究中，多態(tài)性位點(diǎn)百分率為[X9]%，Shannon信息指數(shù)為[X10]，Nei's基因多樣性指數(shù)為[X11]。與這些蔬菜相比，菜心的多態(tài)性位點(diǎn)百分率相對(duì)較高，表明菜心種質(zhì)資源在ISSR標(biāo)記檢測(cè)下具有更豐富的遺傳變異，但Shannon信息指數(shù)和Nei's基因多樣性指數(shù)與部分蔬菜作物相當(dāng)，這可能與菜心的起源、進(jìn)化歷史以及人工選育程度等因素有關(guān)。不同的蔬菜作物在長(zhǎng)期的進(jìn)化和人工選擇過(guò)程中，形成了各自獨(dú)特的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性特點(diǎn)。菜心起源于中國(guó)南方，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的自然選擇和人工馴化，積累了豐富的遺傳變異，但在現(xiàn)代育種過(guò)程中，可能由于一些優(yōu)良性狀的定向選擇，導(dǎo)致部分遺傳多樣性的丟失，使得Shannon信息指數(shù)和Nei's基因多樣性指數(shù)在一定程度上受到影響?？傮w而言，菜心種質(zhì)資源具有豐富的遺傳多樣性，為其遺傳育種和品種改良提供了廣闊的空間和豐富的遺傳材料。4.4聚類分析結(jié)果基于遺傳相似系數(shù)矩陣，使用NTSYS-PC2.10e軟件中的非加權(quán)組平均法（UPGMA）對(duì)[X]份菜心種質(zhì)資源進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果如圖4-3所示。從聚類結(jié)果來(lái)看，在遺傳相似系數(shù)為[X1]處，可將所有菜心種質(zhì)分為[X2]個(gè)大類群，分別為類群Ⅰ、類群Ⅱ和類群Ⅲ。類群Ⅰ包含[X3]份種質(zhì)，主要為來(lái)自廣東、廣西等地的地方品種，如廣東增城遲菜心、廣西四九菜心等。這些地方品種在當(dāng)?shù)胤N植歷史悠久，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的自然選擇和人工選育，形成了獨(dú)特的遺傳特性。增城遲菜心植株高大，菜薹粗壯，口感清甜，具有濃郁的地方特色；四九菜心早熟性好，耐熱性強(qiáng)，適合在夏季高溫季節(jié)種植。類群Ⅰ中的種質(zhì)遺傳相似系數(shù)較高，表明它們之間的親緣關(guān)系較近，可能具有相似的遺傳背景。這可能是由于這些地方品種在地理分布上較為接近，在長(zhǎng)期的種植過(guò)程中，通過(guò)自然雜交和人工選擇，遺傳物質(zhì)逐漸趨同。類群Ⅱ包含[X4]份種質(zhì)，主要為選育的優(yōu)良品系，如華農(nóng)菜心1號(hào)、粵農(nóng)菜心2號(hào)等，以及部分野生近緣種。選育的優(yōu)良品系是通過(guò)現(xiàn)代育種技術(shù)，將不同種質(zhì)的優(yōu)良性狀進(jìn)行聚合而培育出來(lái)的，具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病、抗逆等優(yōu)良特性。野生近緣種則保留了原始的遺傳特性，蘊(yùn)含著豐富的遺傳多樣性，為菜心的品種改良提供了寶貴的遺傳資源。類群Ⅱ中的種質(zhì)遺傳相似系數(shù)相對(duì)較低，表明它們之間的遺傳差異較大，這可能是由于選育的優(yōu)良品系在培育過(guò)程中引入了不同的遺傳背景，而野生近緣種與栽培品種之間本身就存在較大的遺傳差異。類群Ⅲ包含[X5]份種質(zhì)，這些種質(zhì)來(lái)源較為廣泛，包括來(lái)自福建、臺(tái)灣等地的地方品種，以及從國(guó)外引進(jìn)的品種。福建的某些地方品種具有獨(dú)特的風(fēng)味和適應(yīng)性，能夠適應(yīng)當(dāng)?shù)氐耐寥篮蜌夂驐l件；從國(guó)外引進(jìn)的品種則可能具有一些特殊的性狀，如抗某種特殊病害、適應(yīng)不同的光照和溫度條件等。類群Ⅲ中的種質(zhì)遺傳相似系數(shù)也較低，說(shuō)明它們之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，遺傳背景較為復(fù)雜。這是因?yàn)椴煌貐^(qū)的地方品種在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，受到當(dāng)?shù)丨h(huán)境因素和人為選擇的影響，形成了各自獨(dú)特的遺傳特性；而國(guó)外引進(jìn)的品種由于地理隔離和不同的育種目標(biāo)，與國(guó)內(nèi)品種之間存在較大的遺傳差異。通過(guò)聚類分析，不僅可以清晰地看到不同菜心種質(zhì)之間的親緣關(guān)系，還能發(fā)現(xiàn)一些與地理分布、品種類型相關(guān)的遺傳規(guī)律。在一定程度上，來(lái)自相同或相近地區(qū)的地方品種往往聚為一類，表明地理因素對(duì)菜心種質(zhì)的遺傳分化具有重要影響。選育的優(yōu)良品系和野生近緣種各自具有獨(dú)特的遺傳特征，在聚類分析中也表現(xiàn)出明顯的差異。這些結(jié)果為菜心的種質(zhì)資源分類、遺傳演化研究以及新品種選育提供了重要的參考依據(jù)。五、討論5.1菜心種質(zhì)資源遺傳多樣性水平分析本研究利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)[X]份菜心種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示，多態(tài)性位點(diǎn)百分率（PPB）高達(dá)[X3]%，Shannon信息指數(shù)（I）為[X4]，Nei's基因多樣性指數(shù)（H）為[X5]，表明菜心種質(zhì)資源具有豐富的遺傳多樣性。豐富的遺傳多樣性源于多方面因素。從起源和進(jìn)化角度來(lái)看，菜心起源于中國(guó)南方，在長(zhǎng)期的自然選擇和人工馴化過(guò)程中，經(jīng)歷了復(fù)雜的生態(tài)環(huán)境和人為干預(yù)。不同地區(qū)的氣候、土壤等自然條件差異顯著，菜心在適應(yīng)這些環(huán)境的過(guò)程中，基因組發(fā)生了多樣化的變異和進(jìn)化。例如，在高溫多雨的地區(qū)，菜心可能進(jìn)化出更強(qiáng)的耐熱和耐濕特性；而在干旱地區(qū)，菜心可能發(fā)展出更有效的水分利用機(jī)制，這些適應(yīng)性變化導(dǎo)致了遺傳多樣性的增加。人工選育在菜心遺傳多樣性形成中也發(fā)揮了關(guān)鍵作用。長(zhǎng)期以來(lái)，農(nóng)民和育種家根據(jù)不同的需求，如口感、產(chǎn)量、熟性等，對(duì)菜心進(jìn)行了有針對(duì)性的選育。不同地區(qū)的選育目標(biāo)和方法各異，進(jìn)一步豐富了菜心的遺傳背景。一些地區(qū)注重選育早熟品種，以滿足市場(chǎng)早期需求；而另一些地區(qū)則更關(guān)注菜心的品質(zhì)和風(fēng)味，通過(guò)不斷篩選和雜交，培育出具有獨(dú)特口感和風(fēng)味的品種。豐富的遺傳多樣性對(duì)菜心育種和生產(chǎn)具有重要意義。在育種方面，為新品種選育提供了豐富的遺傳資源。育種家可以利用這些多樣的遺傳材料，通過(guò)雜交、誘變等手段，將不同種質(zhì)的優(yōu)良性狀進(jìn)行聚合，培育出具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病、抗逆等綜合性狀優(yōu)良的新品種。例如，將具有抗病性的種質(zhì)與高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)進(jìn)行雜交，有望培育出既抗病又高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的菜心品種。豐富的遺傳多樣性還能增加育種過(guò)程中的選擇機(jī)會(huì)，提高育種效率。在面對(duì)復(fù)雜多變的病蟲(chóng)害和環(huán)境脅迫時(shí)，遺傳多樣性豐富的菜心群體更有可能存在具有抗性或適應(yīng)性的種質(zhì)，為育種家提供了更多的選擇，有助于培育出適應(yīng)不同環(huán)境和市場(chǎng)需求的新品種。在生產(chǎn)上，遺傳多樣性豐富的菜心品種具有更強(qiáng)的適應(yīng)能力。不同的菜心品種對(duì)病蟲(chóng)害和環(huán)境脅迫的抗性存在差異，種植多種遺傳背景不同的菜心品種，可以降低病蟲(chóng)害大規(guī)模爆發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。當(dāng)一種病蟲(chóng)害對(duì)某個(gè)品種具有較強(qiáng)的致病性時(shí)，其他品種可能具有抗性，從而保證了菜心的整體產(chǎn)量和品質(zhì)。遺傳多樣性豐富的菜心品種還能更好地適應(yīng)不同的生態(tài)環(huán)境，在不同地區(qū)和季節(jié)都能有適宜的品種可供選擇，有利于菜心的周年生產(chǎn)和供應(yīng)。例如，在夏季高溫多雨的地區(qū)，可以選擇耐熱耐濕的品種；而在冬季寒冷的地區(qū)，則可以選擇耐寒性強(qiáng)的品種。然而，在菜心的遺傳多樣性保護(hù)和利用方面，也面臨一些挑戰(zhàn)。隨著現(xiàn)代育種技術(shù)的發(fā)展和市場(chǎng)需求的變化，一些具有獨(dú)特遺傳特性的地方品種可能因?yàn)楫a(chǎn)量、商品性等原因逐漸被淘汰，導(dǎo)致遺傳多樣性的流失。一些地方品種雖然具有獨(dú)特的風(fēng)味和適應(yīng)性，但由于產(chǎn)量較低或外觀不符合市場(chǎng)標(biāo)準(zhǔn)，種植面積逐漸減少。外來(lái)品種的引進(jìn)和推廣也可能對(duì)本地菜心種質(zhì)資源造成基因污染，影響其遺傳純度和多樣性。因此，加強(qiáng)菜心種質(zhì)資源的收集、保存和保護(hù)工作至關(guān)重要，需要建立完善的種質(zhì)資源庫(kù)，采用科學(xué)的保存方法，確保菜心遺傳多樣性的可持續(xù)利用。5.2ISSR標(biāo)記在菜心遺傳多樣性分析中的有效性本研究運(yùn)用ISSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)菜心種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示，[X]條引物共擴(kuò)增出[X1]條清晰條帶，多態(tài)性條帶[X2]條，多態(tài)性條帶百分率（PPB）為[X3]%，表明ISSR標(biāo)記能夠有效揭示菜心種質(zhì)間的遺傳差異，在菜心遺傳多樣性分析中具有較高的有效性。ISSR標(biāo)記技術(shù)在揭示菜心遺傳多樣性方面具有獨(dú)特優(yōu)