地址美國加利福尼亞州有限公司11728本申請?zhí)峁┝擞糜跈z測樣品中的靶核酸分個或多個部分的可連接探針接觸并且使所述探述探針在連接位點處或附近包含至少一個核糖核苷酸和/或其中所述探針或探針部分包含靶標在所述探針與所述靶核酸分子雜交后不與所述靶核酸分子雜交并且形成在連接前被切割的在且提供了使用包含至少一個核糖核苷酸的模板21.一種檢測樣品中靶核酸分子中的靶核酸序列的方法，所述方法包括：a)使所述樣品與鎖式探針接觸并且使所述探針與所述靶核酸分子雜交；b)使用DNA/RNA連接酶使所述樣品進行連接反應(yīng)，以連接并從而環(huán)化已與所述靶核酸分子雜交的任何探針；c)通過用DNA聚合酶進行滾環(huán)擴增以擴增來自步驟(b)的連接的環(huán)化探針；以及d)檢測來自步驟(c)的擴增產(chǎn)物，從而檢測所述靶核酸序列；其中所述鎖式探針以一個或多個部分提供，每個部分具有至少一個靶標特異性結(jié)合位點，所述至少一個靶標特異性結(jié)合位點與在所述靶核酸序列處或相鄰于所述靶核酸序列的同源探針結(jié)合位點互補并且與所述靶核酸分子雜交，使得任選地在切割所述雜交探針和/或使用所述靶核酸分子作為模板延伸其3'末端的步驟之后，使用所述靶核酸分子作為連接模板使所述探針或探針部分的可連接末端并置以彼此連接，從而在所述靶核酸序列處或相鄰于所述靶核酸序列創(chuàng)建連接位點；并且其中任選地在所述切割和/或延伸步驟之后，所述探針在連接位點處或附近包含至少一個核糖核苷酸，并且所述連接的環(huán)化探針主要由DNA構(gòu)成并且包含不超過4個連續(xù)核糖核苷酸。3RNA模板化連接[0001]本申請是申請日2018年10月5日、申請?zhí)?018800608475、發(fā)明名稱為“RNA模板化技術(shù)領(lǐng)域[0002]本發(fā)明涉及核酸檢測領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明提供了用于使用可連接的嵌合DNA-RNA探針檢測靶核酸中的靶核酸序列、并且特別是靶RNA分子中的靶RNA序列的方法。還提供了用于此類方法中的核酸探針。背景技術(shù)[0003]靶核酸序列的檢測應(yīng)用于許多不同領(lǐng)域，包括個人化醫(yī)療、癌癥診斷和治療、傳染病和生物安全性。[0004]與靶核酸序列互補的經(jīng)標記雜交探針可用于檢測靶核酸序列，例如在Southern或Northern印跡測定中。此類探針允許簡單直接地檢測靶核酸序列(包括靶RNA序列),但雜交探針具有相對較高的檢測下限，并且不能容易地用于區(qū)分相似的核酸序列。此外，此類探針不能容易地適用于多重或自動檢測測定。[0005]可以通過首先擴增靶序列來增強檢測靶核酸分子的靈敏度。擴增技術(shù)允許在檢測之前將樣品中極低水平的靶序列擴增，以增加樣品中靶序列的拷貝數(shù)。擴增可以使用本領(lǐng)域中可用的各種技術(shù)中的任一種來進行，諸如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、基于核酸特異性的擴增[0006]PCR可以用于擴增靶核酸分子，并且允許使用對靶核酸分子內(nèi)側(cè)接靶核酸序列的序列具有特異性的一對引物進行指數(shù)擴增。然而，靶RNA序列不能通過PCR直接檢測，并且替代地檢測RNA需要使用逆轉(zhuǎn)錄酶(RT-PCR)形成cDNA中間體，隨后可以對其擴增。類似地，[0007]RCA利用鏈置換聚合酶，并且需要環(huán)狀擴增模板。環(huán)狀模板的擴增提供級聯(lián)的RCA產(chǎn)物，其包含與擴增模板的序列互補的序列的多個拷貝，這些拷貝可以被最終檢測。環(huán)狀RCA模板典型地通過連接反應(yīng)提供，并且可以典型地通過以下提供：使用靶特異性探針作為環(huán)化模板環(huán)化靶核酸分子，或通過使用靶核酸分子作為環(huán)化模板環(huán)化靶特異性探針。[0008]環(huán)狀RCA模板可以使用對稱選擇探針方便地提供，該對稱選擇探針包含懸于較短核酸鏈的兩個末端的較長核酸鏈，該較長鏈在其末端包含與靶核酸分子中的序列互補的序列，如US7883849中所述。雜交后，通過連接將選擇子和靶核酸片段接合在一起，得到環(huán)狀核酸分子。用于選擇和擴增核酸的替代方法涉及基因組片段的一般環(huán)化，如Drmanac等人2010.Science327,78-81和US8518640中所述。用于選擇靶核酸序列的基于選擇探針的方法還在WO03/044229中提供。然而，尚未[0009]在替代技術(shù)中，代替環(huán)化靶核酸，可以將靶核酸用作用于連接一個或多個探針的4DNA鎖式探針檢測特定miRNA(Zhao等人2015.ActaBiochimBiophysSin47,130-136;[0011]已經(jīng)證明了核糖核苷酸探針或含有核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸的探針的靶標供核糖核苷酸而非脫氧核糖核苷酸增強探針的連接效率，并且使用RNA連接模板時特別導5許參與模板化連接的探針的一個或多個末端由連接酶以更高的效率和保真度識別并連接。[0015]還觀察到，當將主要由DNA構(gòu)成的連接探針中的連續(xù)核糖核苷酸數(shù)量保持到最低時，未顯著抑制可以擴增連接產(chǎn)物的效率。因此，發(fā)現(xiàn)有可能使用包含一個或多個核糖核苷酸的探針來提高連接效率，同時允許進行所得連接產(chǎn)物的有效擴增。[0016]最廣泛地，本發(fā)明提供了一種檢測樣品中靶核酸分子中的靶核酸序列的方法，所述方法包括：[0017](a)使所述樣品與可連接探針接觸并且使所述探針與所述靶核酸分子雜交；[0018](b)使用DNA/RNA連接酶使所述樣品進行連接反應(yīng)以連接已經(jīng)與所述靶核酸分子雜交的任何探針；[0020](d)檢測來自步驟(c)的擴增產(chǎn)物，從而檢測所述靶核酸序列；[0021]其中每個探針以一個或多個部分提供，每個部分具有至少一個靶標特異性結(jié)合位點，所述至少一個靶標特異性結(jié)合位點與在所述靶核酸序列處或相鄰于所述靶核酸序列的同源探針結(jié)合位點互補并且與所述靶核酸分子雜交，使得任選地在切割所述雜交探針和/或使用所述靶核酸分子作為模板延伸其3'末端的步驟之后，使用所述靶核酸分子作為連接模板使所述探針或探針部分的可連接末端并置以彼此連接，從而在所述靶核酸序列處或相鄰于所述靶核酸序列創(chuàng)建連接位點；并且[0022]其中所述探針在所述連接位點處或附近包含至少一個核糖核苷酸，任選地在所述切割和/或延伸步驟之后，并且所述連接探針主要由DNA構(gòu)成并且包含不超過4個連續(xù)核糖核苷酸。[0023]本發(fā)明的檢測方法因此可以用于檢測靶DNA分子中的靶DNA序列和/或靶RNA分子中的靶RNA序列。特別優(yōu)選的是，所述靶核酸序列是RNA序列并且所述靶核酸分子是RNA分[0024]在一個實施方式中，所述方法包括使用至少一個針對RNA靶序列的探針和至少一端雜交時在連接位點處或附近還含有至少一個核糖核苷酸是有益的。[0025]本發(fā)明因此提供了一種方法，其允許有效連接包含DNA和RNA核苷酸兩者的探針，并且隨后直接從由靶核酸分子模板化的連接反應(yīng)中擴增連接產(chǎn)物，即無需首先提供與靶分子互補的cDNA分子。這因此提供了一種相對于本領(lǐng)域先前已知的方法簡化的檢測方法。此測其它核酸序列(諸如靶DNA序列)一起進行靶RNA分子中靶RNA序列的檢測。這可以例如允許在同一樣品中同時檢測靶RNA和DNA序列。[0026]還提供了一種用于這種方法的探針。更特別地，可環(huán)化探針是特別感興趣的，并且[0027](i)所述探針包括一個或多個部分，每個部分具有至少一個靶標特異性結(jié)合位點，所述至少一個靶標特異性結(jié)合位點與在所述靶核酸序列處或相鄰于所述靶核酸序列的同源探針結(jié)合位點互補并且與所述靶核酸分子雜交，使得任選地在切割所述雜交探針和/或6使用所述靶核酸分子作為模板延伸其3'末端的步驟之后，使用所述靶核酸分子作為連接模板使所述探針或探針部分的可連接末端并置以彼此連接，以在所述靶核酸序列處或相鄰于所述靶核酸序列創(chuàng)建一個或多個連接位點，其中所述連接位點處的連接環(huán)化所述探針；[0028](ii)所述探針在連接位點處或附近包含至少一個核糖核苷酸；并且[0029](iii)所述探針在連接以形成環(huán)時主要由DNA構(gòu)成并且包含不超過4個連續(xù)核糖核[0030]因此，在一個特定實施方式中，本發(fā)明提供了一種檢測樣品中靶核酸分子中的靶[0031]a)使所述樣品與鎖式探針接觸并且使所述探針與所述靶核酸分子雜交；[0032]b)使用DNA/RNA連接酶使所述樣品進行連接反應(yīng)以連接并且從而環(huán)化已經(jīng)與所述靶核酸分子雜交的任何探針；[0033]c)通過用DNA聚合酶進行滾環(huán)擴增來擴增來自步驟(b)的連接的環(huán)化探針；以及[0034]d)檢測來自步驟(c)的擴增產(chǎn)物，從而檢測所述靶核酸序列；[0035]其中每個鎖式探針以一個或多個部分提供，每個部分具有至少一個靶標特異性結(jié)合位點，所述至少一個靶標特異性結(jié)合位點與在所述靶核酸序列處或相鄰于所述靶核酸序列的同源探針結(jié)合位點互補并且與所述靶核酸分子雜交，使得任選地在切割所述雜交探針和/或使用所述靶核酸分子作為模板延伸其3’末端的步驟之后，使用所述靶核酸分子作為連接模板使所述探針或探針部分的可連接末端并置以彼此連接，從而在所述靶核酸序列處或相鄰于所述靶核酸序列創(chuàng)建連接位點；并且[0036]其中所述探針在連接位點處或附近包含至少一個核糖核苷酸，任選地在所述切割和/或延伸步驟之后，并且所述連接的環(huán)化探針主要由DNA構(gòu)成并且包含不超過4個連續(xù)核糖核苷酸。序列，如下文所論述。因此，在一個優(yōu)選的實施方式中，所述探針能夠結(jié)合并檢測靶RNA分子[0038]由于所述探針可以以一個或多個部分提供，因此可以存在超過一個連接結(jié)合點。換句話說，一個或多個探針部分可以各自包含或產(chǎn)生(即通過切割或延伸)可連接5’和3'末端，并且所述探針整體可以包含或產(chǎn)生一個或多個可連接5’末端和一個或多個可連接3'末端。[0039]在某些實施方式中，探針可以包含兩個或更多個部分并且可以創(chuàng)建兩個或更多個連接結(jié)合點。連接結(jié)合點因此可以在兩個不同探針部分之間提供(或更特別地，在兩個不同探針部分的可連接末端之間，或由兩個不同探針部分的末端產(chǎn)生),或在單個部分探針的兩個末端之間提供或由單個部分探針的末端產(chǎn)生。[0040]在連接后，提供在連接位點處或附近包含至少一個核糖核苷酸的探針。連接位點是探針的5’可連接末端處的末端5’磷酸基團與探針的3'可連接末端處的末端3’羥基基團連接的位點，并且連接可以在各自可連接末端直接并置并且與靶核酸分子中其各自互補堿基對正確雜交時發(fā)生。因此，連接位點一旦形成就是探針或探針部分的3'和5’可連接末端處的核苷酸之間的結(jié)合點，并且其位置由這些核苷酸之間形成的磷酸二酯鍵限定。因此，根據(jù)本發(fā)明的方法和探針，參與連接反應(yīng)的至少一個核苷酸(即提供末端5’磷酸基團或3'羥7基基團的核苷酸)或連接位點附近的核苷酸是核糖核苷酸。優(yōu)選地，連接位點處的可連接3'末端處或附近的至少一個核苷酸是核糖核苷酸。換句話說，在一個優(yōu)選的實施方式中，當與靶核酸分子雜交使得3’和5'末端并置以連接時，所述探針在可連接的3'末端處或附近包含至少一個核糖核苷酸。[0041]因此將看出，連接后，探針在連接位點處或附近(或更特別地，一個或多個連接位點處或附近)包含至少一個核糖核苷酸，其存在在連接反應(yīng)期間增強連接的特異性和效率。根據(jù)本發(fā)明，在存在兩個或更多個連接結(jié)合點的情況下，在這些連接結(jié)合點中的一個或多個處或附近可以存在至少一個核糖核苷酸。不是必需，但優(yōu)選的是，在每個連接結(jié)合點處或附近存在至少一個核糖核苷酸。本發(fā)明的方法因此可以認為提供了使用模板靶核酸分子(例如靶RNA分子)增強主要DNA探針的連接的手段。換句話說，本發(fā)明的方法可以樣品中靶核酸分子的檢測。顯著地，通過提供包含不超過四個連續(xù)核糖核苷酸的連接產(chǎn)物，所述方法還允許進行連接產(chǎn)物的擴增而無顯著阻礙。[0042]在連接位點處或附近的任何核苷酸可以是核糖核苷酸而不是脫氧核糖核苷酸。術(shù)語“附近”在此上下文中是指連接位點5個核苷酸內(nèi)的位置，即連接位點接位點的5個核苷酸5’。因此，連接位點的5個核苷酸內(nèi)的任一個核糖核苷酸都可以是核糖核苷酸。核糖核苷酸可以優(yōu)選地在連接位點的4個核苷酸內(nèi)，或更優(yōu)選地在連接位點的3個核苷酸內(nèi)的位置處提供。在又一個實施方式中，核糖核苷酸可以在連接位點的2個核苷酸內(nèi)。因此，在3'或5'可連接末端的末端核苷酸和/或倒數(shù)第二個核苷酸可以是核糖核苷酸。在某些實施方式中，在3’或5’可連接末端(優(yōu)選3’可連接末端)處的是核糖核苷酸。[0043]在一個優(yōu)選的實施方式中，核糖核苷酸可以在連接位點的3'或5’可連接末端處。[0044]‘在……處’具體指寡核苷酸末端處的末端核苷酸，即提供用于連接的羥基或磷酸基團的核苷酸。因此，在一個實施方式中，提及探針在連接位點處包含連接末端的末端3'核苷酸或5’可連接末端的末端5’核苷酸是核糖核苷酸。優(yōu)選地，連接位點處的3’可連接末端是核糖核苷酸。[0045]連接位點處或附近的超過一個核苷酸可以是核糖核苷酸。因此，在某些實施方式中，在連接位點處或附近的超過一個的核糖核苷酸(即在連接位點的5個核苷酸內(nèi)的10個核苷酸中的任何一個)可以是組合核糖核苷酸，條件是連接探針包含不超過4個其它地方論述的連續(xù)核糖核苷酸。[0046]在一個優(yōu)選的實施方式中，探針在探針或其部分的可連接末端處包含至少一個核糖核苷酸。優(yōu)選地，探針在連接位點處的3'可連接末端處包含至少一個核糖核苷酸。換句話說，在探針或其部分的可連接3'末端處的核苷酸優(yōu)選是核糖核苷酸而不是脫氧核糖核苷[0047]在某些實施方式中，探針或探針部分在連接位點處的5'可連接末端處或附近不包含核糖核苷酸，并且特別是在連接位點處的5’可連接末端處不包含核糖核苷酸。在某些實施方式中，在5’可連接末端由探針或探針部分的5'末端提供的情況下(即在5'可連接末端不是通過切割雜交探針而產(chǎn)生的情況下),探針或探針部分的5'末端核苷酸優(yōu)選不是核糖核苷酸。換句話說，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，探針或其部分的可連接5’末端處的核8苷酸是脫氧核糖核苷酸。在此類實施方式中，來自探針或其部分的可連接3'末端處的核苷酸(它是核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸)的3’羥基基團連接至5'脫氧核糖核苷酸。[0048]如上文所簡述，最終形成連接位點的上文所述的可連接末端需要直接并置并且與靶核酸分子中其各自的互補堿基對雜交，以便進行連接。然而，根據(jù)探針和/或其部分的設(shè)計，可連接末端可以以多種方式并置以連接。[0049]在一個具體的實施方式中，探針或其部分的3'末端是在連接位點處的可連接3'末端。因此，在這種實施方式中，可連接3’末端提供在探針的3'末端處(或者可替代地由其表達),或換句話說，探針與靶核酸分子雜交，使得探針的3'末端可以連接至連接位點處的可[0050]因此，在一個優(yōu)選的實施方式中，探針在探針或其部分的3'末端處或附近(但優(yōu)選地在3'末端處)包含至少一個核糖核苷酸。因此，探針不僅可以在連接位點處的可連接3'末端處或附近包含至少一個核糖核苷酸，如上文所述，而且探針或其部分的3'末端本身可以是如本文所述的可連接3'末端。因此，在這種實施方式中，如本發(fā)明方法的步驟(a)中提供的探針或探針部分可以在其3’末端處或附近包含至少一個核糖核苷酸，所述末端與靶核酸序列雜交并且是用于步驟(b)的連接反應(yīng)的可連接3'末端。換句話說，在此類實施方式中，探針或其部分的3'末端處的核苷酸參與連接反應(yīng)，并且在檢測方法的過程期間連接至連接[0051]在本發(fā)明的另一個實施方式中，探針的5'末端是在連接位點處的可連接5’末端。酸分子雜交，使得探針或其部分的5’末端可以連接至連接位點處的可連接3'末端。[0052]因此，在一個具體實施方式中，兩個可連接末端可以提供在探針或探針部分的末端處，或者換句話說，探針可以與靶核酸分子雜交，使得使用靶核酸分子作為連接模板，使探針或探針部分的可連接末端直接并置以彼此連接，而無需對探針的任何進一步修飾或加工(例如切割或延伸)。換句話說，探針或其每個部分可以在其一個或多個末端包含至少一個靶標特異性結(jié)合位點，使得探針(或其部分)的每個末端可以與靶核酸分子中的直接相鄰的同源探針結(jié)合位點雜交，使得提供可連接的末端以連接。換句話說，在某些實施方式中，步驟(b)可以由連接步驟組成，而無需任何其它步驟來提供并置以連接的探針或探針部分[0053]然而，不需要探針在其各自的末端包含靶標特異性結(jié)合位點，所述末端與靶核酸分子中彼此直接相鄰的同源序列雜交，以便使如上文所述的可連接末端并置以連接，并且任選地探針的一個或兩個可連接末端可以僅在連接發(fā)生之前的一個或多個處理步驟中產(chǎn)[0054]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，當探針與靶核酸分子雜交(即通過切割雜交探針)時，可以通過切割創(chuàng)建探針或其部分的5’可連接末端。[0055]因此，探針可以包含提供5'可連接末端的探針或探針部分(或外部)的附加序列5',使得探針或探針部分的5'可連接末端僅可以在所述附加序列已通過切割(切割)后創(chuàng)建。換句話說，探針或探針部分可以包含5’附加序列。因此，探針或探針部分的5’末端內(nèi)部的第一靶標特異性靶結(jié)合位點，使得探針或探針部分與靶核酸分子雜交并且在適當時候在連接位點(即靶標特異性結(jié)合位點)提供可連接5’末端的部9分在其5'末端包含不與靶核酸分子雜交的附加序列。以此方式，在已經(jīng)通過切割移除位于[0056]不與靶核酸分子雜交的第一靶標特異性結(jié)合位點的此附加序列5’因此形成5’活瓣(flap),所述5’活瓣可以通過切割去除，從而創(chuàng)建探針或探針部分的5’可連接末端。[0057]應(yīng)理解，在多部分探針(即包括兩個或更多個部分的探針)中，可以形成超過一個5'活瓣。例如，在兩部分探針(例如包含主鏈寡核苷酸和缺口寡核苷酸的鎖式探針，所述缺口寡核苷酸與主鏈寡核苷酸的兩個雜交末端之間的靶標雜交，如下文進一步所述)的情況可以形成5’活瓣，并且在又一個實施方式中，主鏈和缺口寡核苷酸的5'末端均可以形成5'活瓣。另外，多部分鎖式探針可以包含超過一個缺口寡核苷酸。因此，兩個或更多個缺口寡[0058]因此，在步驟(a)之后，所述方法可以包括切割已經(jīng)與靶核酸分子雜交的任何探針的步驟。此步驟移除在探針或探針部分與靶核酸分子雜交時形成的(或任何)5’活瓣。[0059]切割雜交探針以移除5’活瓣的步驟可以使用酶來進行。能夠進行移除5’活應(yīng)的任何酶可以用于此步驟中，即能夠切割、降解或消化不與靶核酸分子雜交的5’單鏈序列的任何酶，但是典型地這將是具有5’核酸酶和/或結(jié)構(gòu)特異性切割活性的酶。[0060]以此方式形成的5’活瓣可以由結(jié)構(gòu)特異性切割酶識別，例如能夠識別單鏈5’突出端與DNA雙鏈體之間的結(jié)合點并且切割單鏈突出端的酶。應(yīng)理解，作為結(jié)構(gòu)特異性切割酶的底物的支鏈三鏈結(jié)構(gòu)可以由一個探針部分的5’末端和另一個探針部分的3'末端在兩者已經(jīng)與靶核酸分子雜交時形成，以及由一個探針的5’和3'末端形成。適用于這種切割的酶包括Flap核酸內(nèi)切酶(FENS),其是一類具有核酸內(nèi)切酶活性并且能夠催化單鏈和雙鏈DNA結(jié)合點處的磷酸二酯鍵的水解切割的酶。因此，在一個優(yōu)選的實施方式中，第一靶標特異性結(jié)合位點的附加序列5'由結(jié)構(gòu)特異性切割酶，例如Flap核酸內(nèi)切酶切割。在優(yōu)選的實施方式中，所述酶可以是來自激烈火球菌(Pfu)、閃爍古生球菌(Afu)、詹氏甲烷球菌(Mja)或嗜熱自養(yǎng)甲烷桿菌(Mth)的天然或重組古細菌FEN1酶，例如如Ma等人2000.JBC275,24693-24700中所述。[0061]在其它實施方式中，能夠識別并降解具有游離5'末端的單鏈寡核苷酸的酶可以用于從如上文所述的結(jié)構(gòu)切割附加序列(5’活瓣)。因此，具有5’核酸酶活性的酶可以用于切能夠識別單鏈寡核苷酸的游離5’末端并降解所述單鏈寡核苷酸。5’核酸外切酶通過將來自內(nèi)切酶活性可以在一個或多個核苷酸內(nèi)部切割5’活瓣序列。此外，5’核酸酶活性可以通過酶在識別出游離5'末端之后使單鏈寡核苷酸跨越雙鏈體區(qū)域，并且將單鏈區(qū)切割成較大的組成核苷酸(例如二核苷酸或三核苷酸),或切割整個5’單鏈區(qū)域來發(fā)生，例如針對TaqDNA聚合酶和其5’核酸酶如Lyamichev等人1999.PNAS96,6143-性的優(yōu)選酶包括核酸外切酶VIII,或來自水生棲熱菌(Thermusaquaticus)(Taq)、嗜熱棲熱菌(Thermusthermophilus)或黃色棲熱菌(Thermusflavus)的天然或重組DNA聚合酶，或來自其中的核酸酶結(jié)構(gòu)域。[0062]在如上文所述探針或探針部分在其5’末端包含附加序列的某些實施方式中，附加序列內(nèi)的一個或多個核苷酸可以與靶核酸分子中的同源核苷酸互補，但可以不與探針或探針部分(可以是不同的探針部分，如上文所提及)的3’可連接末端同時與靶核酸分子雜交。特別地，以此方式，所述附加序列的3'末端處(即5’活瓣的3'末端處)的一個或多個核苷酸可以與靶核酸分子中的同源核苷酸互補。因為它們不能與靶核酸分子雜交，并且被探針或探針部分的3’可連接末端防止如此，所以可以視為附加序列形成置換活瓣，并且所述附加序列內(nèi)與靶核酸分子中的同源核苷酸互補的核苷酸可以被認為是置換核苷酸或置換堿基。[0063]因此，在一個優(yōu)選的實施方式中，附加序列的3’末端處(即在最接近第一靶結(jié)合位點的附加序列的末端處)的一個或多個核苷酸與靶核酸分子中的同源核苷酸互補，其中所述核苷酸不能與探針的3'可連接末端或另一個探針部分的3'可連接末端同時與靶核酸分子雜交。換句話說，附加序列的3'末端處的一個或多個核苷酸可以通過3’可連接末端防止與靶核酸分子結(jié)合，或者可以認為是從靶核酸分子置換而來。因此，這些核苷酸可以稱為置換核苷酸。[0064]在可能發(fā)生探針連接之前，需要通過切割移除任何這種附加序列。在其(或一個)5’末端具有這種附加序列的探針(即其中第一個靶標特異性結(jié)合位點位于探針或探針部分的5'末端內(nèi)部的探針)因此可以被認為需要在連接之前被活化(即通過切割)。是在所述5’附加序列的3'末端處存在核糖核苷酸(即附加序列的最3'核苷酸)增強附加序列的移除(即切割)效率。下文更詳細描述的所謂的侵入性切割反應(yīng)中特別指出此效果。上文所述的附加序列因此可以在某些實施方式中包含一個或多個核糖核苷酸。在本發(fā)明的某些實施方式中，5’附加序列的3'末端處的一個或多個核苷酸可以是核糖核苷酸。更特別地，如上文所述的5'附加序列的3'末端處的與靶核酸分子中的同源核苷酸互補的一個或多個核苷酸(即如上文所述的置換核苷酸)可以是核糖核苷酸。在一個具體實施方式中，附加序列可以完全由核糖核苷酸組成。[0066]探針的5’附加序列的增強切割與增強的連接效率是分開的，該增強的連接效率是由于具有位于嵌合DNA-RNA探針中的連接位點處或附近的核糖核苷酸而產(chǎn)生的。因此，切割之后在連接位點處或附近不包含核糖核苷酸的探針中也可以看到上文所述的效果。[0067]在另一個方面，本發(fā)明因此提供了一種檢測樣品中靶核酸分子中的靶核酸序列的[0068](a)使所述樣品與可連接探針接觸并且使所述探針與所述靶核酸分子雜交；[0069](b)使用DNA/RNA連接酶使所述樣品進行連接反應(yīng)以連接已經(jīng)與所述靶核酸分子雜交的任何探針；[0071](d)檢測來自步驟(c)的擴增產(chǎn)物，從而檢測所述靶核酸序列；[0072]其中每個探針以一個或多個部分提供，每個部分具有至少一個靶標特異性結(jié)合位點，所述至少一個靶標特異性結(jié)合位點與在所述靶核酸序列處或相鄰于所述靶核酸序列的同源探針結(jié)合位點互補并且與所述靶核酸分子雜交，其中所述探針的一個靶標特異性結(jié)合位點或探針部分的至少一個靶標特異性結(jié)合位點位于所述探針或探針部分的5’末端內(nèi)部，使得在所述探針或探針部分與所述靶核酸分子雜交后，所述探針或探針部分包含至所述靶標特異性結(jié)合位點的附加序列5’,所述附加序列5’不與所述靶核酸分子雜交并且形成5’活11瓣，其中所述5’附加序列的3'末端處或附近的一個或多個核苷酸是核糖核苷酸，并且其中在切割所述雜交探針以移除所述5’活瓣的步驟之后，并且任選地在使用所述靶核酸分子作為模板延伸其3’末端的步驟之后，使用所述靶核酸分子作為連接模板，使所述探針或探針部分的可連接末端并置以彼此連接，從而在所述靶核酸序列處或相鄰于所述靶核酸序列處創(chuàng)建連接位點。列的3'末端附近的一個或多個核苷酸也可以是核糖核苷酸。分子。如上文所論述，本發(fā)明的此方面的此方法還可以用于檢測超過一個靶序列(包括在超品中)。[0075]在另一個方面，本發(fā)明因此提供了一種用于這種方法的探針。本發(fā)明的此方面提[0076](i)所述探針包括一個或多個部分，每個部分具有至少一個靶標特異性結(jié)合位點，所述至少一個靶標特異性結(jié)合位點與在所述靶核酸序列處或相鄰于所述靶核酸序列的同源探針結(jié)合位點互補并且與所述靶核酸分子雜交，其中所述探針的第一靶標特異性結(jié)合位點或探針部分的靶標特異性結(jié)合位點位于所述探針或探針部分的5’末端內(nèi)部，并且所述探針或探針部分包含至所述靶標特異性結(jié)合位點的附加序列5’,使得當所述探針或探針部分與所述靶核酸分子雜交時，所述附加序列形成5’活瓣，所述5’活瓣不與所述靶核酸分子雜交，并且可以通過切割移除以產(chǎn)生可以連接至所述探針或探針部分的3’末端的可連接5’末端，其中所述附加序列含有一個或多個核糖核苷酸(優(yōu)選在其3'末端),使得在切割雜交探針或探針部分的步驟之后并且任選地在使用所述靶核酸分子作為模板延伸其3'末端的步驟之后，使用所述靶核酸分子作為連接模板，使所述探針或探針部分的可連接末端并置以彼此連接，從而在所述靶核酸序列處或相鄰于所述靶核酸序列處創(chuàng)建一個或多個連接位[0077]在一個優(yōu)選的實施方式中，形成5’活瓣的任何附加序列的3’末端處的核苷酸與靶核酸分子中與探針的3’末端處的核苷酸相同的同源核苷酸互補。因此，任何附加序列的3'末端處(即在最接近第一靶結(jié)合位點的附加序列的末端處)的一個或多個核苷酸可以與靶核酸分子中的同源核苷酸互補，其中所述核苷酸不能與探針的3'可連接末端或另一個探針部分的3'可連接末端同時與靶核酸分子雜交。[0078]這種探針可以任選地是單個部分或兩個(或更多個)部分的鎖式探針，或包含兩個或更多個如本文中其它地方所定義的部分的探針，除了它在連接位點處或附近不包含核糖核苷酸。[0079]具有在連接之前需要通過切割移除的5’附加序列的探針是本領(lǐng)域熟知的，例如呈用于侵入測定中的侵入探針的形式。本領(lǐng)域的侵入測定典型地包括使用具有靶標特異性結(jié)合位點的第一探針和第二探針，其中第一探針包含位于探針的5’末端內(nèi)部的第一靶結(jié)合位點。在這種測定中，第一探針和第二探針典型地被設(shè)計成互補的并且能夠與靶核酸分子中的同源結(jié)合位點雜交，使得第一探針與靶核酸分子的5’部分雜交，并且第二探針直接與第一探針并置地與靶核酸分子的3’部分雜交，并且防止第一探針的附加序列的3’末端處的核文所述的置換核苷酸。由于第二探針防止第一探針的附加序列的3'末端與靶核酸分子雜交，并且隨后切割了5'附加序列，因此此類方法也稱為侵入性切割反應(yīng)。[0080]因此，本發(fā)明的探針可以是侵入探針。此類探針特別可用于檢測單核苷酸多態(tài)性。本發(fā)明的檢測方法因此可以用于檢測靶核酸序列中的單核苷酸多態(tài)性或?qū)嶋H上任何變體堿基。用于這種方法的探針可以被設(shè)計成使得探針的3’可連接末端與靶分子中感興趣的核苷酸(變體核苷酸)互補并且能夠與其雜交，并且探針的5'末端處或另一個不同探針部分的5'末端處的5’附加序列的3'末端處的核苷酸與相同的所述核苷酸互補，但被3’可連接末端防止與其雜交(即它是如上文所述的置換核苷酸)。切割探針以移除附加序列提供5’可連接末端，如果3'可連接末端與靶核酸分子正確雜交(即與其互補),則5’可連接末端可以連接至探針或探針部分的3'可連接末端。根據(jù)此原理設(shè)計的探針提供在感興趣位置處的不同變體之間的高度區(qū)分，因為只有3'可連接末端與感興趣位置處的核苷酸互補的探針才能參與供。[0081]最近，已經(jīng)證明了侵入探針的替代設(shè)計提供與上文概述的設(shè)計相當?shù)慕Y(jié)果(Krzywkowski等人2017.NucleicAcidsResearch45,e161)。盡管此設(shè)計在利用鎖式探針(如下文將詳細描述的“入侵鎖式”(iLock)探針)的入侵測定中具體公開，但此類探針的某些特征通?？梢赃m用于侵入探針。[0082]在此替代設(shè)計中，探針(其在iLock探針的上下文中以具有一個部分的探針提供)被設(shè)計成使得鎖式探針中3'靶標特異性結(jié)合位點(如本文所述的第二靶標特異性結(jié)合位點)的3'核苷酸與感興趣核苷酸的靶核酸分子3’中的核苷酸(即與緊接變體核苷酸3’的核苷酸)互補并且能夠與其雜交，并且鎖式探針中的5'靶標特異性結(jié)合位點(如本文所述的第一靶標特異性結(jié)合位點)的5'核苷酸與靶核酸分子中感興趣的核苷酸(即變體核苷酸)互補，并且能夠與其雜交。此類探針包含至第一靶標特異性結(jié)合位點的附加序列5’,使得第一靶標特異性結(jié)合位點位于探針的5'末端內(nèi)部。附加序列的最3’末端核苷酸與感興趣核苷酸的靶核酸分子3'中的核苷酸(即緊鄰感興趣核苷酸/變體核苷酸的3’)互補，但是被探針的3'可連接末端(即第二靶標特異性結(jié)合位點)防止與靶核酸分子雜交，并且因此是置換核苷酸。如上文，可以提供類似的探針設(shè)計，其中5'靶標特異性結(jié)合位點和3'靶標特異性結(jié)合位點由不同的探針部分提供。[0083]因此，更通常地，探針可以被設(shè)計成使得探針或探針部分的3'可連接末端與感興趣核苷酸(變體核苷酸)的靶分子3’中的核苷酸互補并且能夠與其雜交，并且探針的5’附加序列的3’末端處或另一個不同探針部分的5’末端處的核苷酸與感興趣核苷酸(緊鄰變體核切割以移除附加序列提供5’可連接末端，如果5’可連接末端與靶核酸分子正確雜交(即與其互補),則5’可連接末端可以連接至探針或探針部分的3'可連接末端。根據(jù)此原理設(shè)計的探針提供在感興趣位置處的不同變體之間的高度區(qū)分，因為只有5’可連接末端與感興趣位置處的核苷酸互補的探針才能參與連接反應(yīng)。如上文所述，在一個實施方式中，探針以單個[0084]因此，在某些實施方式中，本發(fā)明的方法可以用于檢測靶核酸分子中的變體堿基。特別地，根據(jù)上文提及的“侵入”設(shè)計中的任一種的探針可以特別用于檢測靶核酸分子中的變體堿基。[0085]在創(chuàng)建5’活瓣的此類侵入探針中，在加序列(創(chuàng)建5’活瓣)的3'末端處或附近的一個或多個核苷酸是核糖核苷酸。更特別地，附糖核苷酸。[0086]侵入型探針可以以鎖式探針提供，所述鎖式探針可以由一個或多個部分構(gòu)成，如下文進一步描述。因此，鎖式探針可以是與靶核酸分子雜交以形成“侵入”結(jié)構(gòu)的單個部分掛鎖，或者它可以包含兩個或更多個雜交以形成一個或多個具有用于切割的5'活瓣的“侵[0087]在一個具體的代表性實施方式中，用于這種方法的探針是以單一可環(huán)化寡核苷酸提供的鎖式探針，其包含位于所述探針的5’末端內(nèi)部的第一靶標特異性結(jié)合位點和位于所述探針的3'末端處的第二靶標特異性結(jié)合位點，使得在所述探針與所述靶核酸分子雜交后，所述探針包含不與所述靶核酸分子雜交的所述第一靶結(jié)合位點的附加序列5',其中所述探針的3'末端處的核苷酸是核糖核苷酸并且其中所述探針的3'末端和所述附加序列的3’末端處的核苷酸與同一核苷酸互補，其中當所述探針的3'末端處的核苷酸和所述附加序列的3'末端處的核苷酸與變體堿基互補時，所述附加序列的3’末端處的核苷酸不能與所述探針的3’末端同時與所述靶核酸分子雜交并且通過切割移除所述附加序列從而產(chǎn)生所述探針的5'可連接末端，并且其中當所述附加序列的3'末端處的核苷酸和所述探針的3'末端處的核苷酸不與所述變體堿基互補時，所述附加序列的3'末端處的核苷酸通過切割移除并且所述探針的3'末端處的核苷酸不與所述靶核酸分子雜交，從而防止連接。[0088]在另一個具體的代表性實施方式中，所述探針是單一可環(huán)化寡核苷酸，其包含位于所述探針的5’末端內(nèi)部的第一靶標特異性結(jié)合位點和位于所述探針的3'末端處的第二靶標特異性結(jié)合位點，使得在所述探針與所述靶核酸分子雜交后，所述探針包含不與所述靶核酸分子雜交的所述第一靶結(jié)合位點的附加序列5’,其中所述探針的3'末端處的核苷酸是核糖核苷酸，并且其中所述探針的3'末端處和所述附加序列的3'末端處的核苷酸與同一核苷酸互補，其中所述探針的3’末端處的核苷酸和所述附加序列的3'末端處的核苷酸與所述變體堿基的所述位置3’處的核苷酸互補并且其中所述附加序列的3’末端處的核苷酸不能與所述探針的3'末端同時與所述靶核酸分子雜交，其中當所述第一靶標特異性結(jié)合位點的5’末端處的核苷酸與所述變體堿基互補時，通過切割移除所述附加序列從而產(chǎn)生所述探針的5’可連接末端，并且其中當所述第一靶標特異性結(jié)合位點的所述5'末端處的核苷酸不與所述變體堿基互補時，也通過切割移除所述核苷酸，從而在所述5'可連接末端與3’可連接末端之間產(chǎn)生缺口并且防止連接。[0089]在其它實施方式中，此類侵入鎖式探針可以類似地以兩個或更多個部分提供，所述鎖式探針例如包含主鏈寡核苷酸和一個或多個缺口寡核苷酸，如下文進一步描述。[0090]在某些實施方式中，可以將探針設(shè)計為結(jié)合靶核酸分子內(nèi)的兩個或更多個非連續(xù)序列。換句話說，探針或兩個探針部分可以與在探針或探針部分的相應(yīng)靶結(jié)合位點之間具有缺口的靶核酸分子雜交。當探針或探針部分的末端已雜交以留下缺口時，可以使用靶核酸分子作為延伸模板，通過在連接至5'末端之前將探針的雜交3'末端延伸來填充此缺口。在探針的3’末端已經(jīng)延伸到與5’可連接末端相鄰后，可以通過連接反應(yīng)將兩個末端連接起[0091]由于將靶核酸序列的補體摻入到連接探針中，這種延伸缺口-填充實施方式可以特別用于檢測高度可變的靶核酸序列。因此，在擴增之后，檢測擴增的連接探針(例如通過測序)允許確定靶核酸序列的序列。在其它實施方式中，這種通過延伸的缺口填充可以與通過切割5’活瓣產(chǎn)生可連接5'末端的特征相組合。因此，在侵入型探伸也可以用于產(chǎn)生或提供3’可連接末端。[0092]上文所述的‘延伸缺口填充’實施方式需要將核苷酸摻入延伸產(chǎn)物中，并且因此在這類實施方式中，反應(yīng)混合物中需要核苷三磷酸的混合物以進行延伸。在某些實施方式中，提供的一個或多個核苷三磷酸(一個、兩個、三個或全部四個核苷三磷酸)(nATP、nGTP、nCTP、dTTP/rUTP)可以是核糖核苷三磷酸。這可以允許在延伸探針的3’末端的過程中將至少一個核糖核苷酸摻入3’可連接末端。因此，在一個實施方式中，的三個可以是脫氧核糖核苷三磷酸，并且第四核苷三磷酸分子可以是核糖核苷三磷酸。優(yōu)選地，基于靶核酸分子序列的了解，以核糖核苷三磷酸提供的一種或多種核苷三磷酸可以選擇成使得在聚合后所得延伸產(chǎn)物的3'末端處或附近的核苷酸(例如連接位點處的3'可連接末端的3'末端核苷酸)是核糖核苷酸。通過代表性實例，如果已知在探針的兩個部分之間的缺口的5'末端處的核苷酸是“G”,則可以使用包含rCTP的核苷三磷酸的混合物，從而在延伸探針的3'可連接末端處提供rCTP核苷酸。[0093]在使探針或其部分延伸以提供3'可連接末端的一些實施方式中，提供并且與靶核酸分子雜交的探針(或部分)可以完全由DNA構(gòu)成，并且可以如上文所述通過延伸引入核糖子雜交的可連接探針可以通過延伸步驟變成嵌合DNA-RNA探針。換句話說，在本發(fā)明的方法中，具有并置以連接(即準備連接)的可連接5’末端和3'末端的與靶分子雜交的可連接探針[0094]在通過延伸反應(yīng)將核糖核苷酸引入可連接探針的實施方式中，可以在可連接3'末端處或附近引入核糖核苷酸，例如延伸序列的末端和/或倒數(shù)第二個3’核苷酸可以是核糖核苷酸，和/或延伸反應(yīng)可以引入5個或更少個核苷酸，或不超過4個核苷酸。[0095]可以使用RNA作為延伸模板的任何便利的聚合酶，優(yōu)選非置換聚合酶都可以用于(RdRP),和/或RNA依賴性DNA聚合酶(RdDP)(例如逆轉(zhuǎn)錄酶)可以用于上文所述的‘缺口填[0096]在一個優(yōu)選的實施方式中，聚合酶可以能夠使用RNA模板將DNA和RNA殘基兩者摻入延伸產(chǎn)物中，例如包含E895A或E895G取代的突變的人線粒體DNA聚合酶γ,已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)所述聚合酶將rNTP和dNTP核苷三磷酸兩者摻入延伸產(chǎn)物中(Kasiviswanathan等人2011.JBC286,31490-31[0097]用于本文公開的檢測方法中的探針可以以一個或多個部分提供，其每個部分包含至少一個靶標特異性結(jié)合位點，所述至少一個靶標特異性結(jié)合位點與靶核酸分子中的靶核酸序列處或相鄰于靶核酸序列的同源探針結(jié)合位點互補。因此，探針(或其每個部分)能夠與靶核酸分子雜交。探針或探針部分以如下這種方式與靶核酸分子雜交：使用靶核酸分子核酸分子中的同源探針結(jié)合位點互補的至少一個靶標特異性結(jié)合位點。在這種實施方式中，步驟(b)中的連接包括探針的第一部分的5'可連接末端與探針的第二部分的3'可連接的特定核苷酸互補的核苷酸。探針的部分可以僅在與未知序列中的核苷酸正確雜交時連的同源探針結(jié)合位點互補，所述靶核酸分子通過不與靶核酸互補的序列(主鏈或接頭)連寡核苷酸包含位于所述探針的5’末端處或內(nèi)部的第一靶標特異性結(jié)合位點和在所述探針的3'末端處的第二靶標特異性結(jié)合位點，其中第一靶標特異性結(jié)合位點和第二靶標特異性結(jié)合位點分別形成或構(gòu)成所述探針的5’可連接末端和3’可連接末端。[0104]在此類實施方式中，連接可以是直接的，即鎖式探針的5'和3'末端可以與彼此直接相鄰的靶核酸分子雜交，使得鎖式探針的3’末端連接至鎖式探針的5’可連接末端，從而形成環(huán)狀連接產(chǎn)物。可替代地，在此類實施方式中，鎖式探針的5子雜交，在其靶標特異性結(jié)合位點之間具有缺口，并且探針的3'末端可以如本文其它地方所述延伸，以提供探針的3’可連接末端為連接至鎖式探針的5'可連接末端。[0105]以單一可環(huán)化寡核苷酸提供的鎖式探針可以任選地包含其5'靶結(jié)合位點的附加序列5’,所述附加序列可以被切割以在連接位點處提供5’可連接末端實施方式中，所述探針可以是單一可環(huán)化寡核苷酸，其包含位于所述探針的5'末端內(nèi)部的第一靶標特異性靶結(jié)合位點和位于所述探針的3'末端處的第二靶標特異性結(jié)合位點，使得在所述探針與所述靶核酸分子雜交后，所述探針包含不與所述靶核酸分子雜交的所述第一靶結(jié)合位點的附加序列5’,其中所述附加序列的3'末端處的核苷酸是核糖核苷酸，所述核糖核苷酸與所述靶核酸分子中的同源核苷酸互補但不能與所述探針的3'可連接末端同時與所述靶核酸分子雜交，其中通過切割移除所述附加序列從而創(chuàng)建所述探針的5’可連接末端。[0106]鎖式探針可以可替代地以兩個或更多個部分提供，即提供為兩個或更多個寡核苷酸，所述寡核苷酸經(jīng)連接以形成環(huán)狀寡核苷酸。第一寡核苷酸可以包含在其5'末端處或內(nèi)部的第一靶標特異性結(jié)合位點和在其3'末端處的第二靶標特異性結(jié)合位點，并且可以與靶核酸分子雜交，在其靶標特異性結(jié)合位點之間具有缺口。然而，并非延伸鎖式探針的3'末端以提供用于連接的3'可連接末端，可以提供第二寡核苷酸(和任選的第三、第四等寡核苷酸),其包含與靶核酸分子中位于第一靶標特異性結(jié)合位點和第二靶標特異性結(jié)合位點的各自同源探針結(jié)合位點之間的同源探針結(jié)合位點互補的一個或多個靶標特異性結(jié)合位點。在這種實施方式中，鎖式探針的環(huán)化包括將第一寡核苷酸的5’和3’可連接末端連接至這些寡核苷酸的3’和5’可連接末端(例如分別連接至第二寡核苷酸的3'類實施方式中，第二寡核苷酸和后續(xù)的寡核苷酸可以被認為是缺口寡核苷酸。以兩個或更多個部分提供的鎖式探針因此可以被認為包含主鏈寡核苷酸(即包含第一靶標特異性結(jié)合位點和第二靶標特異性結(jié)合位點的寡核苷酸)和一個或多個缺口寡核苷酸。[0107]一個或多個缺口寡核苷酸可以用于通過連接測序，如上文所述。[0108]在某些實施方式中，鎖式探針(或更特別地，鎖式探針的主鏈寡核苷酸)本身可以以兩個或更多個部分，優(yōu)選以兩個部分提供，所述部分可以在環(huán)化鎖式探針的過程中在不同于在與靶核酸分子雜交的探針或探針部分的部分之間形成的連接位點的位置處連接。換句話說，鎖式探針的主鏈寡核苷酸可以以兩個或更多個部分提供，所述部分可以在不與靶核酸互補的序列(即如上文所述的主鏈或接頭)內(nèi)的位置處連接。其中主鏈寡核苷酸以兩個部分提供的主鏈寡核苷酸的鎖式探針的實例示于圖17中。[0109]以兩個或更多個部分提供的主鏈寡核苷酸的這種連接可以通過連接模板來模板化，所述連接模板能夠與主鏈寡核苷酸的兩個或更多個部分的每一個雜交，從而使各自的5’和3'末端并置以連接。連接模板因此包含與主鏈寡核苷酸的兩個或更多個部分的每一個的末端處的序列互補的區(qū)域。[0110]連接模板可以是單獨的寡核苷酸，例如與探針一起或分別添加到樣品中，或與探針預先雜交的寡核苷酸，或者可以是另一個靶核酸分子，或同一靶核酸分子的另一個部分(即位于同一靶核酸分子內(nèi)的不同位置處的另一個單獨靶序列)。因此，連接模板可以是合[0111]主鏈寡核苷酸的部分的連接可以是直接的或間接的，如本文其它地方所定義，或者可能需要缺口填充延伸或與在主鏈寡核苷酸的兩個部分的末端之間的連接模板雜交的其它寡核苷酸(即類似于缺口寡核苷酸)。此外，連接可能需要切割5附加序列的3'末端處的核苷酸是核糖核苷酸，和/或其中在連接位點處或附近提供核糖核苷酸，如本文其它地方所述?？梢钥闯?，這種環(huán)化方法(其中主鏈寡核苷酸以2個或更多個部分提供)可以方便地用于在不同于作為模板的(主要)靶分子上的所述(或一個)連接位點的位點處將核糖核苷酸引入主鏈寡核苷酸(例如通過使用rNTP延伸)。在主鏈寡核苷酸中的一個或多個不同位點處存在一個或多個此類核糖核苷酸可能有益于連接的(環(huán)化的)鎖式探[0112]在步驟(b)期間發(fā)生超過一個連接的情況下(即在形成兩個或更多個連接位點的情況下),任何連接位點均可以包含如上文更詳細論述的至少一個核糖核苷酸(即探針可以在任何連接位點處或附近包含核糖核苷酸)。因此，在存在兩個或更多個連接位點的情況下，一個或多個所述連接位點可以包含如本文所定義的至少一個核糖核苷酸。在本發(fā)明的一個具體實施方式中，探針可以在每個連接位點處或附近包含核糖核苷酸。因此，在一個優(yōu)選方面，以兩個或更多個部分提供的探針的任何一個或所有部分可以在連接位點處的可連接3'末端處或附近包含至少一個核糖核苷酸，并且在一個具體實施方式中，探針的每個部分可以在連接位點處的其可連接3’末端處或附近包含至少一個核糖核苷酸。更優(yōu)選地，探針的每個部分可以在其3'末端處或附近包含至少一個核糖核苷酸。然而，應(yīng)注意，在探針以兩個或更多個部分提供的情況下，所述兩個或更多個部分中的僅一個可以在其可連接3'末端處或附近或在其3'末端處包含至少一個核糖核苷酸是足夠的。[0113]在探針以如上文所述的兩個或更多個部分提供的情況下，探針的任何或所有部分提供的探針的任何或所有部分的靶標特異性結(jié)合位點可以位于探針部分的5'末端內(nèi)部(即可以包含不與靶核酸分子雜交的靶結(jié)合位點的附加序列5’),所述附加序列可以在連接之前通過切割移除。類似地，探針的任何兩個或更多個部分可以與靶核酸分子中的非連續(xù)序列雜交，并且它們之間的缺口視需要通過延伸任何或所有探針的3'末端來填充，如上文所論述。[0114]探針中所含的核糖核苷酸數(shù)量并不關(guān)鍵，只要探針滿足連接探針包含不超過4個連續(xù)核糖核苷酸的要求即可。更特別地，連接探針可以包含不超過3個連續(xù)核糖核苷酸，并且在一個優(yōu)選的實施方式中，不超過2個連續(xù)核糖核苷酸(例如1個或2個核糖核苷酸)。因為探針可以包含超過一個連接位點，并且核糖核苷酸可以存在于每個或多個連接位點處或附近，所以應(yīng)理解，核糖核苷酸可以存在于連接探針中的多個(即兩個或更多個)位點處，但在每個位點處，存在不超過4個(或3個或2個)連續(xù)核糖核苷酸。換句話說，在每個連接位點處可以存在1個核糖核苷酸或不超過4個(或3個或2個)連續(xù)核糖核苷酸，實際上，在上文闡述的范圍內(nèi)，在整個探針的其它位點處(即不僅在連接位點處)包括核糖核苷酸沒有限制。令人驚訝的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在環(huán)狀連接探針中存在核糖核苷酸允許滾環(huán)擴增更快地進行。用于本發(fā)明方法的探針因此可以任選地在一個或多個位點處(包括在不同于連接位點處或附近的一個或多個位置處)包含一個或多個(和至多4個連續(xù))核糖核苷酸。[0115]如上文所述，探針或探針部分可以具有第一靶結(jié)合位點的附加序列5',并且此附加序列形成可以移除的5’活瓣。如上文所述，附加序列(5’活瓣序列)可以包含一個或多個可以連續(xù)的核糖核苷酸，并且數(shù)量不受限制；這些核糖核苷酸可以通過切割移除，使得當連接探針時，探針中剩余不超過4個(或不超過3個或2個)連續(xù)核糖核苷酸。[0116]在探針是鎖式探針的一些實施方式中，主鏈寡核苷酸可以完全由DNA構(gòu)成，并且核糖核苷酸可以包含在一個或多個缺口寡核苷酸中(更具體地，在其3’可連接末端處或附近),和/或它們可以通過延伸引入，如上文所論述。在其它實施方式中鏈寡核苷酸可以含有一個或多個核糖核苷酸，例如單個核糖核苷酸可散布在各處。在另一個實施方式中，主鏈寡核苷酸可以在3'可連接末端處或附近包含至少一個核糖核苷酸。在這種實施方式中，一個或多個缺口寡核苷酸還可以在其3'可連接末端處或附近含有至少一個核糖核苷酸?？商娲?，可以僅在主鏈寡核苷酸中提供核糖核苷酸?？梢允褂眠@些特征的任何組合。[0117]本發(fā)明因此可以可替代地視為提供一種檢測與可連接嵌合DNA-RNA探針雜交的靶核酸分子中的靶核酸序列的方法，所述方法包括：[0120]iii)檢測來自步驟(ii)的擴增產(chǎn)物，從而檢測所述靶核酸序列；[0121]其中所述可連接嵌合DNA-RNA探針以一個或多個部分提供，每個部分具有至少一個靶標特異性結(jié)合位點，所述至少一個靶標特異性結(jié)合位點與在所述靶核酸序列處或相鄰于靶核酸序列的同源探針結(jié)合位點互補并且與所述靶核酸分子雜交，使得使用所述靶核酸分子作為連接模板使所述探針或探針部分的可連接末端并置以彼此連接，從而在所述靶核酸序列處或相鄰于所述靶核酸序列創(chuàng)建連接位點；并且[0122]其中所述可連接嵌合DNA-RNA探針在所述連接位點處或附近包含至少一個核糖核苷酸，并且所述連接探針主要由DNA構(gòu)成并且包含不超過4個連續(xù)核糖核苷酸。[0123]顯然的是，根據(jù)這種方法，例如在切割和/或延伸步驟之后，可能已經(jīng)產(chǎn)生彼此并置以連接的探針或探針部分的可連接末端，如上文更詳細描述。其修飾變體。因此，核酸可以由核糖核苷酸和/或脫氧核糖核苷酸以及能夠參與Watson-Crick型或類似堿基對相互作用的合成核苷酸構(gòu)成。因此，核酸可以是或可以包含例如亞硫[0125]靶核酸分子因此可以是編碼或非編碼DNA,例如基因組DNA或其子部分，或者可以衍生自基因組DNA,例如其拷貝或擴增子，或者它可以是cDNA或其子部分，或者其擴增子或拷貝等。池中的RNA分子或其它核酸分子或核苷酸序列，例如人類或來自任何來源，來自轉(zhuǎn)錄組，或任何其它核酸(例如細胞器核酸，即線粒體或質(zhì)體核酸),天然存在或合成的核酸。靶RNA分子因此可以是或可以源自編碼(即前mRNA或mRNA)或非編碼RNA序列(諸如tRNA、rRNA、分子典型地可以是期望在樣品中檢測的RNA分子，從其是測定的靶標，即分析物的意義上而言。在一個優(yōu)選的實施方式地其中16SRNA來自樣品中的微生物(例如病原微生物)并且可從其中鑒定?？商娲兀写?，靶RNA分子可以是來自病毒基因組的正義RNA、反義RNA或雙鏈RNA,或來自逆轉(zhuǎn)錄病毒[0127]本發(fā)明的方法對于檢測短靶核酸分子，并且特別是短靶RNA分子具有特別的優(yōu)勢，它們通常難以通過本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)擴增和表征。因此，在本發(fā)明的具體實施方式中，靶核酸分子的長度可以小于或至多100個核苷酸，或更優(yōu)選地長度小于或至多90、80、70、25個核苷酸。WO2015/071445中示出了具有一對包含6個核苷酸的靶標特異性結(jié)合位點的鎖式探針，所述靶標特異性結(jié)合位點各自可以結(jié)合靶核酸分子并且以靶標依賴性方式連標分子也可以在本發(fā)明的方法中檢測到。靶核酸分子可以具有在上述任意整數(shù)之間的范圍內(nèi)的多個核苷酸。[0128]靶核酸分子可以存在于樣品內(nèi)。樣品可以是含有任何數(shù)量核酸的任何樣品，其來自任何來源或?qū)儆谌魏蝸碓?，在所述樣品中需要檢測靶核酸分子中的靶核酸序列。樣品因此可以是任何臨床或非臨床樣品，并且可以是其中可能存在靶核酸分子的任何生物、臨床或環(huán)境樣品。[0129]樣品可以是任何含有靶核酸分子的樣品，并且包括天然和合成樣品，即天然存在的材料或已制備的制劑。天然存在的樣品可以在經(jīng)受本發(fā)明的方法之前經(jīng)處理或加工。包括所有生物和臨床樣品，例如生物體的任何細胞或組織樣品，或由其衍生的任何體液或制樣品或食物樣品。樣品可以是新鮮制備的，或者它們可以以任何方便方式進行預處理，例如[0130]代表性樣品因此包括可以含有靶核酸分子的任何材料，包括例如食品和相關(guān)產(chǎn)品、臨床和環(huán)境樣品。樣品可以是生物樣品，其可以含有任何病毒或細胞材料，包括所有原生動物等，或病毒。代表性樣品因此包括全血和血液源性產(chǎn)物，諸如血漿、血清和血沉棕黃活組織檢查、細胞培養(yǎng)物、細胞懸浮液、條件培養(yǎng)基或細胞培養(yǎng)物成分的其它樣品等。可以以任何方便或期望的方式預處理樣品，以準備用于本發(fā)明的方法和用途，例如通過細胞裂[0131]在一個具體的實施方式中，樣品包含已經(jīng)從臨床樣品或臨床樣品的培養(yǎng)物中分離的微生物細胞或病毒。在這種樣品中，靶核酸分子可以是存在于微生物細胞中的核苷酸序[0132]本文所述的探針，以及實際上探針的一個或多個部分可以包含一個或多個其它序列，所述其它序列可以用于將序列引入連接產(chǎn)物中，例如標簽或檢測序列，例如條形碼或可鑒別基序，或檢測探針或引物的結(jié)合位點。這種其它序列可以例如在探針或探針部分的3'或5’末端(優(yōu)選位于探針或探針部分的可連接末端的相反端)處發(fā)現(xiàn)，或者可以在探針或探針部分末端的中間發(fā)現(xiàn)，例如在不與靶核酸分子雜交的可環(huán)化主鏈寡核苷酸的一部分中發(fā)現(xiàn)。諸如條形碼的標簽或探針/引物結(jié)合位點可以以不同的需求/目的來設(shè)計，例如，為了引入通用或常見序列，以使得能夠一起處理多重環(huán)境中的不同連接探針，例如以引入通用或常見擴增引物的結(jié)合位點。這將使得能夠一起擴增不同的連接探針，例如通過PCR或RCA呈文庫擴增?？商娲鼗蛄硗猓瑯撕?條形碼序列可以用于“標記”得它們可以容易地彼此區(qū)分(即“靶標”標簽或標記物),或者標記不同的樣品等，使得它們可以在常見/通用擴增步驟之前匯集(即“樣品”標簽或標記物)。為不同的探針(即用于不同靶核酸分子的探針)提供不同的標簽序列(例如不同的標記物或檢測序列)和/或可以為它們提供相同的一個或多個標簽序列，例如以用于引入常見或通用序列。此類方法可以優(yōu)選與通過雜交測序、通過連接測序或其它下一代測序化學方法結(jié)合使用，例如用于樣品中多個靶核酸的多重檢測中。[0133]術(shù)語“檢測”在本文中廣泛地使用以包括確定靶核酸分子中靶核酸序列的存在的任何手段。應(yīng)理解的是，在本發(fā)明的方法中，靶核酸通過檢測樣品中擴增的連接探針(即存在還是不存在)或擴增的連接探針的任何測量形式來檢測。因此，步驟(c)的擴增產(chǎn)物可以作為靶核酸序列的“報告子”來檢測。因此，確定、測量、評估或測定擴增的連接探針的存在或不存在或數(shù)量或位置。樣品中擴增的連接探針的存在(即確認其存在或量或連接)指示或鑒定靶核酸序列的存在，因為探針的成功連接(允許擴增發(fā)生)取決于靶核酸分子，并且更特別地其中靶核酸分子的存在。因此，檢測擴增的連接探針允許確定靶核酸序列的存在。[0134]包括定量和定性測定、測量或評估，包括半定量的。此類測定、測量或評估可以是相對的(例如在檢測樣品中的兩個或更多個不同的靶核酸分子時),或絕對的。因此，術(shù)語“定量”在定量樣品中的一個或多個靶核酸分子的上下文中使用時可以指絕對或相對定量。絕對定量可以通過包括已知的一種或多種濃度的一個或多個對照RNA分子和/或以已知對照RNA分子參照靶核酸分子的檢測水平(例如通過生成標準曲線)來實現(xiàn)?？商娲兀鄬Χ靠梢酝ㄟ^比較兩個或更多個不同靶核酸分子之間的檢測水平或量以提供兩個或更多個不同RNA分子中的每一個的相對定量(即相對于彼此)來完成。[0135]可以相對于探針及其靶核酸分子的序列來選擇探針的序列。因此，盡管相對于它們所結(jié)合的靶核酸分子選擇靶互補區(qū)，但是探針其余部分的序列并不是關(guān)鍵的。然而，應(yīng)該選擇序列以避免分子內(nèi)雜交的發(fā)生。在選擇或鑒定序列后，可以使用任何方便的方法合成探針。[0136]如本文所用的術(shù)語“雜交”或“雜交化”是指在充分互補以經(jīng)由Watson-Crick配對形成雙鏈體的核苷酸序列之間形成雙鏈體。當兩個核苷酸序列共有堿基對組織同源性時，這些分子是“互補的”。因此，探針區(qū)域中的互補區(qū)是指該區(qū)域中能夠形成雙鏈體(或換句話說，結(jié)合其同源互補序列)的一部分。這些術(shù)語還用于指代類似于Watson-Crick堿基配對的堿基對相互作用，包括Hoogsteen堿基配對，其是很少觀察到的堿基配對變異，它也允許第三鏈纏繞以Watson-Crick模式組裝的雙螺旋以形成三鏈體。[0137]可以選擇添加到樣品中的探針量以在反應(yīng)混合物中提供足夠低的探針濃度從而最小化非靶標特異性相互作用，即確保探針不會隨機結(jié)合樣品中的非靶核酸分子到任何較組合后，反應(yīng)混合物中每個探針的濃度在約1fM至1μM,諸如10,約1pM至約1nM的范圍內(nèi)，包[0138]可以將多個不同的探針添加到樣品中以用于多重測定(例如，在樣品中存在多個不同的靶核酸分子的情況下),以便并行檢測多個靶核酸分子。多重測定可能涉及樣品中數(shù)十個、數(shù)百個、數(shù)千個或甚至數(shù)萬個核酸分子的檢測。因此，多重測的探針，即能夠與不同的第一RCA產(chǎn)物(直接或間接地)雜交并且因此例如檢測不同分析物500、1000、10000或更多個探針。此外，本發(fā)明的檢測方法法)可以與用于檢測樣品中其它核酸分子的更廣泛的方法組合使用。在一個其中靶核酸分子是靶RNA分子的具體實施方式中，這可以允許與用于檢測樣品中的其它(例如非RNA)核酸[0139]在將含有靶核酸分子的樣品和一個或多個探針組合后，可以將反應(yīng)混合物溫育一段足以使一個或多個探針結(jié)合樣品中其靶核酸分子的時段。如上文所述，在探針已經(jīng)結(jié)合靶核酸分子之后，連接探針(任選地在切割和/或延伸雜交探針的步驟之后)以產(chǎn)生可以隨后被擴增的連接產(chǎn)物，并且檢測擴增產(chǎn)物從而檢測靶核酸序列。[0140]在一些代表性實施方式中，例如在原位測定或其中固定靶核酸分子的其它測定中，可以在添加探針與連接和/或擴增連接產(chǎn)物之間包括洗滌步驟。換句話說，可以將靶核酸分子捕獲或固定在固體支持物或底物上，將其洗滌以移除未結(jié)合或非特異性結(jié)合的探針。在一些實施方式中，可以在連接探針與擴增連接產(chǎn)物之間包括洗滌步驟，以移除未連接探針。在其它代表性實施方式中，在進行連接之前可以包括洗滌步驟。[0141]在探針是多部分掛鎖的情況下，可以使主鏈寡核苷酸與樣品接觸并使其雜交，并且然后可以添加一個或多個缺口寡核苷酸(如果使用)并使其雜交?？商娲?，可以一起添加多部分探針的所有部分。[0142]連接包括在與靶核酸序列雜交并且并置以連接的兩個相鄰堿基中，探針3'處的3'OH基團與探針5'末端處的5’磷酸基團之間形成磷酸二酯鍵。因此，根據(jù)探針的設(shè)計，可以在核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸上提供3'0H基團和/或5’磷酸基團。因此，可以選擇能夠以靶標特異性方式催化磷酸二酯鍵形成的連接酶。[0143]連接酶可以是DNA連接酶(即特征在于其能夠催化在與靶核酸分子雜交的兩個相鄰的脫氧核糖核苷酸之間形成磷酸二酯鍵的連接酶)或RNA連接酶(即特征在于其能夠催化與靶核酸分子雜交的兩個相鄰核糖核苷酸之間形成磷酸二酯鍵的連接酶)。如實施例所證明，現(xiàn)已顯示DNA和RNA連接酶兩者催化以有效和靶標依賴性方式在與靶標核酸分子雜交的相鄰的3’核糖核苷酸與5'脫氧核糖核苷酸之間，以及相鄰的3’核糖核苷酸與5'核糖核苷酸連接位點處或附近包含核糖核苷酸的連接產(chǎn)物。[0144]特別可用于本發(fā)明的檢測方法中的示例性連接酶包括小球藻病毒DNA連接酶 靶核酸序列的檢測時，觀察到連接的效率和保真度提高。[0145]可以將合適的連接酶和必要和/或期望的任何試劑與反應(yīng)混合物組合，并且保持在足以發(fā)生雜交的寡核苷酸的連接的條件下。連接反應(yīng)條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。在連接期間，反應(yīng)混合物在某些實施方式中可以維持在約4℃至約105℃、約4至約80℃,諸如約10至約70℃、約15至約60℃,典型地諸如約20℃至約37℃范圍內(nèi)的溫度下持續(xù)在約5秒至約16小時，諸如約1分鐘至約1小時范圍內(nèi)的時間段。在又其它實施方式中，反應(yīng)混合物可以維持在約35℃至約45℃,諸如約37℃至約42℃范圍內(nèi)，例如在或約38℃、39℃、40℃或41℃下的溫度下持續(xù)在約5秒至約16小時，諸如約1分鐘至約1小時，包括約2分鐘至約8小時范圍內(nèi)的時間段。在一個代表性實施方式中，連接反應(yīng)混合物包括50mMTrispH7.5、10mMDNA連接酶。在又一個代表性實施方式中，采用2.125mM鎂離子、0.2單位/mlRNA酶抑制劑；[0146]顯然，連接條件可以取決于本發(fā)明方法中使用的連接酶。因此，上文所述的連接條件僅是代表性實例，并且參數(shù)可以根據(jù)熟知的方案改變。然而，應(yīng)進一步理解，改變一個參數(shù)(例如溫度)可能需要修改其它條件以確保測定的其它步驟不受抑制或破壞，例如探針與靶核酸分子的結(jié)合。RCA測定方法的這種操作在本領(lǐng)域是常規(guī)的。[0147]在形成連接探針后，將其擴增以增加樣品中連接產(chǎn)物的拷貝數(shù)，這可以增加本發(fā)明的檢測方法的靈敏度。在某些實施方式中，連接探針的一部分或部分被擴增。連接探針(或其部分)可以使用本領(lǐng)域已知的任何方便的方法，諸如PCR或其變型、SDA、HAD、LAMP或[0148]在一個優(yōu)選的實施方式中，通過連接環(huán)化探針。優(yōu)選地，在此類實施方式中，可以通過滾環(huán)擴增(RCA)來擴增探針。使用環(huán)狀模板進行擴增的滾環(huán)擴增提供包含多個串聯(lián)重復序列的串聯(lián)RCA產(chǎn)物，每個重復序列具有與環(huán)狀模板寡核苷酸互補的序列(即環(huán)化的連接產(chǎn)物)。RCA可以例如通過使樣品與單獨的引物接觸來進行，所述引物與所得環(huán)互補并且能子可以包含或提供可以充當RCA擴增的引物的3’末端。如本文所用的術(shù)語“DNA聚合酶”包括能夠摻入dNTP的任何酶，并且因此包括具有DNA和RNA聚合酶活性的酶。特別地，DNA聚合酶可以是其主要活性或功能是合成DNA,但連接探針包含至少一個核糖核苷酸。用于步驟(c)的代表性聚合酶包括VentDNA聚合酶和[0150]令人驚訝的是，還發(fā)現(xiàn)Phi29DNA聚合酶能夠使用含有核糖核苷酸的嵌合模板寡核苷酸合成DNA寡核苷酸，其包括將脫氧核糖核苷酸摻入與靶核酸分子中的核糖核苷酸互補的合成產(chǎn)物中。換句話說，Phi29能夠充當逆轉(zhuǎn)錄酶，并且摻入對應(yīng)于與模板中的核糖核苷酸互補的RNA堿基的DNA核苷酸(dNTP)。已經(jīng)證明了使用Phi29DNA聚合酶擴增包含至多四個連續(xù)核糖核苷酸的連接探針。在上文定義的本發(fā)明的各種方法的方法優(yōu)選實施方式底物的能力拓寬了Phi29介導的擴增，并且特別是RCA的應(yīng)用范圍，并且開辟了除上文所述且可應(yīng)用于下一代測序技術(shù)的寡核苷酸合成和文庫制備。[0151]在一個方面，本發(fā)明因此提供了Phi29DNA聚合酶作為逆轉(zhuǎn)錄酶的用途。[0152]可替代地看，此方面還提供了一種合成DNA分子的方法，所述方法包括使包含RNA[0153]盡管已經(jīng)報道了通過引入特定的氨基酸取代可以將Phi29DNA聚合酶轉(zhuǎn)化為具有RNA依賴性的DNA聚合酶活性，但尚未證明野生型Phi29DNA聚合酶或任何其它尚未為了增加逆轉(zhuǎn)錄酶活性而進行修飾的Phi29序列變體可能具有以此方式起作用的能力。[0154]特別地，本發(fā)明因此提供Phi29DNA聚合酶作為逆轉(zhuǎn)錄酶的用途，其中未對Phi29DNA聚合酶的序列進行修飾以增加逆轉(zhuǎn)錄酶的活性?；哪０搴怂岱肿优cPhi29DNA聚合酶接觸，并且產(chǎn)生其的DNA反向補體，其中尚未對Phi29DNA聚合酶的序列進行修飾以增加逆轉(zhuǎn)錄酶活性。[0156]特別地，本發(fā)明提供了一種通過滾環(huán)擴增合成DNA分子的方法，所述方法包括使包含至少一個核糖核苷酸和不超過四個連續(xù)核糖核苷酸的環(huán)狀模板核酸分子與Phi29DNA聚合酶接觸，并且產(chǎn)生DNA分子，所述DNA分子包含所述模板核酸分子的反向互補序列的多個串聯(lián)重復序列，其中未修飾所述Phi29DNA聚合酶的序列以提高RT活性。[0157]提及未修飾Phi29DNA聚合酶的序列以增加逆轉(zhuǎn)錄酶活性，意指尚未為了引入(即賦予)或增加逆轉(zhuǎn)錄酶活性的目的將序列修飾引入Phi29氨基酸序列，所述逆轉(zhuǎn)錄酶活性是酶對包含一個或多個核糖核苷酸的模板起作用并且將與模板中核糖核苷酸互補的脫氧核苷酸摻入合成產(chǎn)物中的活性。因此，該序列沒有被修飾以賦予或增加Phi29DNA聚合酶的逆轉(zhuǎn)錄酶活性。這并不排除與野生型或天然序列相比，Phi29酶的氨基酸序列可以具有其它序列修飾，但是沒有旨在地或有意地引入修飾以賦予或增加活性。更特別地，相對于野生型或天然Phi29酶可能存在的任何序列修飾都不會賦予或增加RT活性。[0158]通過代表性實例，的結(jié)構(gòu)引導方法概述于US2017/0159033中，其提出了許多氨基酸取代以提供具有諸如以下的特性：與對應(yīng)的親本聚合酶相比，模板聚合酶穩(wěn)定性或加工性增加、核酸外切酶活性降低和/或模板特異性改變?？梢员蝗〈氖纠园被岚赡芘cRNA/DNA異源雙鏈體發(fā)生沖突的那些氨基酸，或可能導致聚合酶與模板2'OH部分之間的空間沖突的那些氨基酸，并且提出了許多示例性取代。其它氨基酸取代可以是降低或消除Phi29DNA聚合酶的核酸外切酶活性的那些，增加活性位點中同源堿基親和力的取代，抑制引物鏈與核酸外切酶結(jié)構(gòu)域結(jié)合的取代，提高讀取長度和/或加工性的取代，減少脈沖間距離的取代，增強包括聚合酶和核酸底物的二元復合物和/或包括聚合酶、核酸底物和同源核苷酸或核苷酸類似物的三元復合物的熱