(19)國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局(30)優(yōu)先權(quán)數(shù)據(jù)(62)分案原申請(qǐng)數(shù)據(jù)(71)申請(qǐng)人塔夫茨大學(xué)信托人地址美國(guó)馬薩諸塞州(74)專利代理機(jī)構(gòu)北京市君合律師事務(wù)所專利代理師吳瑜顧云峰A23L13/00(2016.01)(54)發(fā)明名稱使用基因修飾細(xì)胞的培養(yǎng)肉產(chǎn)品本文提供基因工程改造的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其內(nèi)源性表達(dá)一種或多種植物化學(xué)物、維生素或治療劑且適用于培養(yǎng)肉產(chǎn)品。還提供制造和使用所述基因工程改造的哺乳動(dòng)物細(xì)胞和所述培養(yǎng)肉產(chǎn)品的方法。T圖21.一種工程改造細(xì)胞，其內(nèi)源性合成一種或多種抗氧化因子，其中，所述工程改造細(xì)胞包含編碼所述一種或多種抗氧化因子的異源多核苷酸。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程改造細(xì)胞，其中，所述一種或多種抗氧化因子包含抗氧化類胡蘿卜素。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程改造細(xì)胞，其中，所述一種或多種抗氧化因子包含抗氧化植物營(yíng)養(yǎng)素。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程改造細(xì)胞，其中，所述一種或多種抗氧化因子包含抗氧化植物代謝物。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程改造細(xì)胞，其中，所述一種或多種抗氧化因子包含非動(dòng)物細(xì)胞天然產(chǎn)生的抗氧化代謝物。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程改造細(xì)胞，其中，所述一種或多種抗氧化因子包含八氫番茄紅素且所述細(xì)胞包含編碼八氫番茄紅素合成酶的異源多核苷酸。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的工程改造細(xì)胞，其中所述八氫番茄紅素合成酶具有與SEQIDNO:1或SEQIDNO:10至少90%相同的序列。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程改造細(xì)胞，其中所述細(xì)胞內(nèi)源性合成番茄紅素且包含編碼八氫番茄紅素去飽和酶的異源多核苷酸。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的工程改造細(xì)胞，其中所述八氫番茄紅素去飽和酶具有與SEQIDNO:3至少90%相同的序列。10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的工程改造細(xì)胞，其中所述細(xì)胞內(nèi)源性合成β-胡蘿卜素且包含編碼番茄紅素環(huán)化酶的異源多核苷酸。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的工程改造細(xì)胞，其中所述番茄紅素環(huán)化酶具有與SEQIDNO:5或SEQIDNO:11至少90%相同的序列。12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程改造細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程改造細(xì)胞，其中細(xì)胞是Pax7哺乳動(dòng)物肌肉前體細(xì)胞。14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程改造細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是肌動(dòng)蛋白肌球蛋白重鏈(MHC)哺乳動(dòng)物多核肌管。15.根據(jù)權(quán)利要求10所述的細(xì)胞，其中所述工程改造細(xì)胞中的總類胡蘿卜素產(chǎn)量比沒(méi)有編碼八氫番茄紅素合成酶、八氫番茄紅素去飽和酶和番茄紅素環(huán)化酶的所述異源多核苷酸的所述細(xì)胞中的總類胡蘿卜素產(chǎn)量高至少5倍。16.一種制造根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞的方法，其包括向天然合成香葉基香葉基焦磷酸的細(xì)胞中引入編碼一種或多種抗氧化因子的異源多核苷酸。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述細(xì)胞是Pax7+哺乳動(dòng)物肌肉前體細(xì)胞。18.一種培養(yǎng)肉產(chǎn)品，其包含匯合的無(wú)血清培養(yǎng)物，所述培養(yǎng)物包含在食品安全基質(zhì)上接種的根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的培養(yǎng)肉產(chǎn)品，其中所述基質(zhì)是膜。20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的培養(yǎng)肉產(chǎn)品，其中所述基質(zhì)是海綿或三維基質(zhì)。21.根據(jù)權(quán)利要求18所述的培養(yǎng)肉產(chǎn)品，其中所述基質(zhì)是殼聚糖基質(zhì)。22.根據(jù)權(quán)利要求18所述的培養(yǎng)肉產(chǎn)品，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物包含衍生自Pax7+哺乳動(dòng)物衛(wèi)星細(xì)胞的多核肌管。323.根據(jù)權(quán)利要求22所述的培養(yǎng)肉產(chǎn)品，其中所述多核肌管表達(dá)肌球蛋白重鏈(MHC)和肌動(dòng)蛋白。4時(shí)申請(qǐng)和2019年6月14日提交的第62/861,606號(hào)美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)，所述臨時(shí)申請(qǐng)中[0004]本發(fā)明是在政府支持下在由美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院(NationalInstitutesof[0005]對(duì)通過(guò)EFS-WEB提交的序列表的引用[0006]創(chuàng)建于2020年6月1日并在此與本申請(qǐng)一起通過(guò)EFS-Web以電子方治療性蛋白生產(chǎn)(例如單克隆抗體)或疾病的研究和治療(例如代謝重編程)的應(yīng)用(Davy等的代謝工程改造工作已經(jīng)采用了多種分類的轉(zhuǎn)基因以用于從醫(yī)藥和化妝品到能源和農(nóng)業(yè)[0008]一種所述應(yīng)用為通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)肉類(以各種術(shù)語(yǔ)已知，此文將使用“培養(yǎng)具有與SEQIDNO:1或SEQIDNO:_至少90%相同的序列。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞內(nèi)源性合成番茄紅素且包含編碼八氫番茄紅素去飽和酶的異源多核苷酸。在一些實(shí)施方式5中，所述細(xì)胞內(nèi)源性合成β-胡蘿卜素且包含編碼番茄紅素環(huán)化酶的異源多核苷酸。在一些實(shí)施方式中，所述番茄紅素環(huán)化酶具有與SEQIDNO:5或SEQIDNO:_至少90%相同的序列。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，物肌肉前體細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是肌動(dòng)蛋白肌球蛋白重鏈(MHC)哺乳動(dòng)物多核肌管。在一些實(shí)施方式中，所述工程改造細(xì)胞中的總類胡蘿卜素產(chǎn)量比沒(méi)有編碼八氫番茄紅素合成酶、八氫番茄紅素去飽和酶和番茄紅素環(huán)化酶的所述異源多核苷酸的所述細(xì)胞中的總類胡蘿卜素產(chǎn)量高至少5倍。[0010]在第二方面中，本文提供一種制造如本文所描述的工程改造細(xì)胞的方法，其包括向天然合成香葉基香葉基焦磷酸的細(xì)胞中引入(i)編碼八氫番茄紅素合成酶的異源多核苷酸；(ii)編碼八氫番茄紅素去飽和酶的異源多核苷酸；(iii)編碼番茄紅素環(huán)化酶的異源多核苷酸；或(iv)其組合。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是Pax7+哺乳動(dòng)物肌肉前體[0011]在第三方面中，本文提供一種工程改造細(xì)胞，其內(nèi)源性合成維生素C且包含一種或[0012]在第四方面中，本文提供一種工程改造細(xì)胞，其內(nèi)源性合成姜黃素且包含一種或多種編碼酪氨酸氨裂解酶(PTAL)、4-香豆酸-CoA連接酶(4CL)、苯基丙?；?二酮-CoA合成酶(DCS)和姜黃素合成酶(CURS3)的異源多核苷酸。[0013]在第五方面中，本文提供一種工程改造細(xì)胞，其內(nèi)源性合成大麻二酚(CBD)且包含一種或多種編碼3,5,7-三氧代十二?；?CoA合成酶(OLS)、橄欖醇酸環(huán)化酶(OAC)、大麻萜酚酸合成酶(CBGAS)和大麻二酚酸合成酶(CBDAS)的異源多核苷酸。[0014]在第六方面中，本文提供一種工程改造細(xì)胞，其包含編碼具有與SEQIDNO:7至少95%相同的序列的納米抗體V565的異源多核苷酸。在一些實(shí)施方式中，所述多核苷酸編碼通過(guò)可裂解多肽連接子與腫瘤壞死因子α(TNFa)共價(jià)連接的所述V565納米抗體。在一些實(shí)施方式中，所述可裂解多肽連接子包含SEQIDNO:9。[0015]在第七方面中，本文提供一種工程改造細(xì)胞，其包含編碼具有與SEQIDNO:8至少95%相同的序列的抗微生物肽16(AMP16)的異源多核苷酸。在一些實(shí)施方式中，所述多核苷個(gè)AMP16的重復(fù)序列，每個(gè)重復(fù)序列由包含Asn-Pro-Val重復(fù)序列的連接子多肽間隔開(kāi)。[0016]在第八方面中，本文提供一種培養(yǎng)肉產(chǎn)品，其包含匯合的無(wú)血清培養(yǎng)物，所述培養(yǎng)物包含在食品安全基質(zhì)上接種的如本文所描述的工程改造細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，所述基質(zhì)是膜。在一些實(shí)施方式中，所述基質(zhì)是海綿或三維基質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，所述基質(zhì)是殼聚糖基質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞培養(yǎng)物包含衍生自Pax7+哺乳動(dòng)物衛(wèi)星細(xì)胞的[0017]本申請(qǐng)還包含以下的實(shí)施方式：[0018]1.一種工程改造細(xì)胞，其內(nèi)源性合成八氫番茄紅素且包含編碼八氫番茄紅素合成酶的異源多核苷酸。[0019]2.根據(jù)實(shí)施方式1所述的工程改造細(xì)胞，其中所述八氫番茄紅素合成酶具有與SEQIDNO:1或SEQIDNO:10至少90%相同的序列。[0020]3.根據(jù)實(shí)施方式1或2所述的工程改造細(xì)胞，其中所述細(xì)胞內(nèi)源性合成番茄紅素且6包含編碼八氫番茄紅素去飽和酶的異源多核苷酸。[0021]4.根據(jù)實(shí)施方式3所述的工程改造細(xì)胞，其中所述八氫番茄紅素去飽和酶具有與SEQIDNO:3至少90%相同的序列。[0022]5.根據(jù)實(shí)施方式3或4所述的工程改造細(xì)胞，其中所述細(xì)胞內(nèi)源性合成β-胡蘿卜素且包含編碼番茄紅素環(huán)化酶的異源多核苷酸。[0023]6.根據(jù)實(shí)施方式5所述的工程改造細(xì)胞，其中所述番茄紅素環(huán)化酶具有與SEQIDNO:5或SEQIDNO:11至少90%相同的序列。[0024]7.根據(jù)實(shí)施方式1-6中任一項(xiàng)所述的工程改造細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。[0025]8.根據(jù)實(shí)施方式1-7中任一項(xiàng)所述的工程改造細(xì)胞，其中細(xì)胞是Pax7哺乳動(dòng)物肌肉前體細(xì)胞。[0026]9.根據(jù)實(shí)施方式1-7中任一項(xiàng)所述的工程改造細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是肌動(dòng)蛋白肌球蛋白重鏈(MHC)哺乳動(dòng)物多核肌管。[0027]10.根據(jù)實(shí)施方式5或6所述的細(xì)胞，其中所述工程改造細(xì)胞中的總類胡蘿卜素產(chǎn)量比沒(méi)有編碼八氫番茄紅素合成酶、八氫番茄紅素去飽和酶和番茄紅素環(huán)化酶的所述異源多核苷酸的所述細(xì)胞中的總類胡蘿卜素產(chǎn)量高至少5倍。[0028]11.一種制造根據(jù)實(shí)施方式1-10中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞的方法，其包括向天然合成香葉基香葉基焦磷酸的細(xì)胞中引入(i)編碼八氫番茄紅素合成酶的異源多核苷酸；(ii)編碼八氫番茄紅素去飽和酶的異源多核苷酸；(iii)編碼番茄紅素環(huán)化酶的異源多核苷酸；或(iv)其組合。[0029]12.根據(jù)實(shí)施方式11所述的方法，其中所述細(xì)胞是Pax7+哺乳動(dòng)物肌肉前體細(xì)胞。[0030]13.一種工程改造細(xì)胞，其內(nèi)源性合成維生素C且包含一種或多種編碼UDP-葡萄糖(RGN)和L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯氧化酶(GULO)的外源多核苷酸。[0031]14.一種工程改造細(xì)胞，其內(nèi)源性合成姜黃素且包含一種或多種編碼酪氨酸氨裂[0032]15.一種工程改造細(xì)胞，其內(nèi)源性合成大麻二酚(CBD)且包含一種或多種編碼3,5,7-三氧代十二?；?CoA合成酶(OLS)、橄欖醇酸環(huán)化酶(OAC)、大麻萜酚酸合成酶(CBGAS)和大麻二酚酸合成酶(CBDAS)的異源多核苷酸。[0033]16.一種工程改造細(xì)胞，其包含編碼具有與SEQIDNO:7至少95%相同的序列的納米抗體V565的異源多核苷酸。[0034]17.根據(jù)實(shí)施方式16所述的工程改造細(xì)胞，其中所述多核苷酸編碼通過(guò)可裂解多肽連接子與腫瘤壞死因子α(TNFa)共價(jià)連接的所述V565納米抗體。[0035]18.根據(jù)實(shí)施方式17所述的工程改造細(xì)胞，其中所述可裂解多肽連接子包含SEQ[0036]19.一種工程改造細(xì)胞，其包含編碼具有與SEQIDNO:8至少95%相同的序列的抗微生物肽16(AMP16)的異源多核苷酸。[0037]20.根據(jù)實(shí)施方式19所述的工程改造細(xì)胞，其中所述多核苷酸編碼至少2個(gè)、至少37每個(gè)重復(fù)序列由包含Asn-Pro-Val重復(fù)序列的連接子多肽間隔開(kāi)。[0038]21.一種培養(yǎng)肉產(chǎn)品，其包含匯合的無(wú)血清培養(yǎng)物，所述培養(yǎng)物包含在食品安全基質(zhì)上接種的根據(jù)實(shí)施方式1-10和13-20中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞。[0039]22.根據(jù)實(shí)施方式21所述的培養(yǎng)肉產(chǎn)品，其中所述基質(zhì)是膜。[0040]23.根據(jù)實(shí)施方式21所述的培養(yǎng)肉產(chǎn)品，其中所述基質(zhì)是海綿或三維基質(zhì)。[0041]24.根據(jù)實(shí)施方式21-23中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)肉產(chǎn)品，其中所述基質(zhì)是殼聚糖基[0042]25.根據(jù)實(shí)施方式21-24中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)肉產(chǎn)品，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物包含衍生自Pax7+哺乳動(dòng)物衛(wèi)星細(xì)胞的多核肌管。[0043]26.根據(jù)實(shí)施方式25所述的培養(yǎng)肉產(chǎn)品，其中所述多核肌管表達(dá)肌球蛋白重鏈(MHC)和肌動(dòng)蛋白。附圖說(shuō)明[0044]本專利或?qū)＠暾?qǐng)文件含有至少一張彩色附圖。附有彩色附圖的本專利或?qū)＠暾?qǐng)公開(kāi)拷貝將在請(qǐng)求和支付必要費(fèi)用之后由專利局提供。[0045]圖1顯示基因構(gòu)建體和其在類胡蘿卜素生物合成途徑中對(duì)應(yīng)的終端產(chǎn)物。所有基因構(gòu)建體含有由雙向合成RBPSA/CMV啟動(dòng)子同時(shí)啟動(dòng)的嘌呤霉素抗性基因和目的基因。所有目的基因區(qū)域含有單獨(dú)或作為多順?lè)醋觤RNA轉(zhuǎn)錄物的一部分產(chǎn)生的綠色熒光蛋白(GFP)[0046]圖2A-圖2B顯示牛衛(wèi)星細(xì)胞表征。(圖2A)Pax7,即一種轉(zhuǎn)錄因子和衛(wèi)星細(xì)胞標(biāo)記物的免疫熒光染色(綠色),以及細(xì)胞肌動(dòng)蛋白(毒傘素，re(D)和細(xì)胞核(DAPI,藍(lán)色)的復(fù)染。(圖2B)肌球蛋白重鏈(MF20),即一種骨骼肌收縮蛋白的免疫熒光染色(綠色),以及細(xì)胞肌動(dòng)蛋白和細(xì)胞核的復(fù)染。分化細(xì)胞的高倍染色(high-objectivestaining)揭露肌動(dòng)蛋白[0047]圖3A-圖3C顯示工程改造細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育。(圖3A)用全部四種構(gòu)建體(產(chǎn)生類胡蘿卜素的構(gòu)建體和對(duì)照構(gòu)建體)工程改造的C2C12和BSC中的GFP表達(dá)的熒光圖像。由于構(gòu)建體的結(jié)構(gòu)，GFP表達(dá)暗示基因構(gòu)建體中的其它酶的成功表達(dá)。(圖3B)用全部四種構(gòu)建體工程改造的C2C12和BSC八天內(nèi)的生長(zhǎng)曲線，n=3個(gè)不同樣品，*指示對(duì)應(yīng)顏色的與pGFP的顯著差異，p<0.05。(圖3C)分化之前(頂部)和之后(底部)pCrtB/I/YBSC中Pax7(re(D)和肌球蛋白重鏈(re(D)的免疫熒光染色。DAPI復(fù)染(藍(lán)色)顯示細(xì)胞核，并且內(nèi)源性GFP(綠色)顯示細(xì)胞[0048]圖4A-圖4B顯示工程改造細(xì)胞中的類胡蘿卜素產(chǎn)量。工程改造細(xì)胞中的類胡蘿卜素產(chǎn)量。(圖4A)用pCrtB、pCrtB/I和pCrtB/I/Y工程改造的C2C12中的類胡蘿卜素產(chǎn)量。在pCrtB細(xì)胞中，僅產(chǎn)生八氫番茄紅素。在pCrtB/I細(xì)胞中，大部分八氫番茄紅素轉(zhuǎn)化為番茄紅蘿卜素水平顯著減少。n=3個(gè)不同樣品；不同字母指示條柱之間的統(tǒng)計(jì)差異，p<0.05。(圖4B)用pCrtB、pCrtB/I和pCrtB/I/Y工程改造的BSC中的類胡蘿卜素產(chǎn)量。趨勢(shì)遵循C2C12,其中總類胡蘿卜素含量在所有情況下與C2C12相比減少約10倍。n=3個(gè)不同樣品；不同字母指8示條柱之間的統(tǒng)計(jì)差異，p<0.05。類胡蘿卜素?cái)?shù)據(jù)以μg/g蛋白質(zhì)提供。相對(duì)于蛋白質(zhì)比較類胡蘿卜素的個(gè)別值和數(shù)據(jù)在圖4C-圖4D中給出。[0049]圖4C-圖4D顯示類胡蘿卜素和蛋白質(zhì)定量數(shù)據(jù)。個(gè)別類胡蘿卜素和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)點(diǎn)用于產(chǎn)生μg/g數(shù)據(jù)。(圖4C)對(duì)于所有細(xì)胞類型和處理，每百萬(wàn)細(xì)胞的C2C12類胡蘿卜素和蛋白質(zhì)定量。趨勢(shì)與圖4和圖5中相同。(圖4D)對(duì)于所有細(xì)胞類型和處理，每百萬(wàn)細(xì)胞的BSC類胡蘿卜素和蛋白質(zhì)定量。趨勢(shì)與圖4A-圖4B和圖5A-圖5C中相同。對(duì)于全部，n=3個(gè)不同樣[0050]圖5A-圖5C顯示類胡蘿卜素優(yōu)化。(圖5A)在其作為膽固醇合成中前體的共用途徑的情形下的類胡蘿卜素生物合成途徑。顯示了優(yōu)化的可能機(jī)制。嘌呤霉素(紫色)通過(guò)選擇提供較高酶表達(dá)并且因此增加類胡蘿卜素合成通量的細(xì)胞而起作用。酮康唑(re(D)通過(guò)抑制羊毛固醇轉(zhuǎn)化成酵母固醇，通過(guò)引起羊毛固醇、角鯊烯和FPP的上游累積，或通過(guò)減少膽固醇作為上游FPP合成反應(yīng)的反饋抑制因子的影響來(lái)增加類胡蘿卜素前體法呢基焦磷酸(FPP)水平起作用。(圖5B)工程改造BSC的細(xì)胞團(tuán)圖像。可以看到類胡蘿卜素的著色效果，其中pGFP細(xì)胞微綠，pCrtB不含色素，而pCrtB/I和pCrtB/Y細(xì)胞含有一些橙色色素。優(yōu)化的pCrtB/I/Y細(xì)胞明顯橙色更重，指示類胡蘿卜素水平增加。(圖5C)優(yōu)化細(xì)胞中β-胡蘿卜素的酮康唑和嘌呤霉素一起不顯著增加β-胡蘿卜素。n=3個(gè)不同樣品；*p<0.05。類胡蘿卜素?cái)?shù)據(jù)以μg/g蛋白質(zhì)提供。相對(duì)于蛋白質(zhì)比較類胡蘿卜素的個(gè)別值和數(shù)據(jù)在圖4C-圖4D中給出。[0051]圖6顯示有或無(wú)加熱下的工程改造BSC的硫代巴比妥酸反應(yīng)性物質(zhì)(TBARS)分析。所有加熱樣品與生(raw)樣品相比呈現(xiàn)丙二醛(MD(A)的顯著增加，指示來(lái)自此“烹制”過(guò)程上不同(p<0.05)。[0052]圖7A-圖7B顯示類胡蘿卜素優(yōu)化處理。(圖7A)用pCrtB/I/Y工程改造的C2C12和BSC中的平均熒光強(qiáng)度的流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量結(jié)果(完整流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)在圖8A_圖8B中)。細(xì)胞與的熒光強(qiáng)度指示較高的平均GFP表達(dá)，其對(duì)應(yīng)于較高的平均酶表達(dá)。誤差以平均值標(biāo)準(zhǔn)差給[0053]圖8A-圖8B顯示流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)。(圖8A)用不同水平的嘌呤霉素處理的細(xì)胞的BSC2.5μg/mL嘌呤霉素(1×puro)、pCrtB/I/Y與5μg/mL嘌呤霉素(2×puro)和pCrtB/I/Y與10μg/mL嘌呤霉素(4×)。頂部行是前向散射(FSC)和側(cè)向散射(SSC)數(shù)據(jù)，顯示了針對(duì)活細(xì)胞(使用非工程改造對(duì)照組確定)的門控(gate),其中門控值(gatevalue)是相對(duì)于總計(jì)數(shù)(7,500)的百分比。底部行為GFP數(shù)據(jù)，顯示了針對(duì)GFP陽(yáng)性細(xì)胞(使用非工程改造對(duì)照組確定)的門控，其中門控值為相對(duì)于活細(xì)胞(在頂部行中門控)的百分比。(圖8B)用不同水平的9×puro)和pCrtB/I/Y與10胞(使用非工程改造對(duì)照組確定)的門控，其中門控值是相對(duì)于總計(jì)數(shù)(7,500)的百分比。底部行為GFP數(shù)據(jù)，顯示了針對(duì)GFP陽(yáng)性細(xì)胞(使用非工程改造對(duì)照組確定)的門控，其中門控值為相對(duì)于活細(xì)胞(在頂部行中門控)的百分比。[0054]圖9A-圖9B顯示優(yōu)化細(xì)胞的類胡蘿卜素概況。(圖9A)無(wú)優(yōu)化(頂部)或進(jìn)行嘌呤霉素處理和酮康唑處理(底部)的pCrtB/I/YC2C12的八氫番茄紅素、番茄紅素和β-胡蘿卜素含量。n=3個(gè)不同樣品。(圖9B)無(wú)優(yōu)化(左上)、無(wú)嘌呤霉素處理但進(jìn)行酮康唑處理(右上)、進(jìn)行嘌呤霉素處理但無(wú)酮康唑處理(左下)或進(jìn)行嘌呤霉素處理和酮康唑處理(左下)的同字母指示條柱之間的統(tǒng)計(jì)差異，p<0.05)。[0055]圖10顯示BSC中從前體的維生素C、姜黃素和大麻二酚合成途徑。將被工程改造以合成各種化合物，所述各種化合物將在分化前和分化后分析。在3中，將分析細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)素生物可用性和營(yíng)養(yǎng)素功能。[0057]圖12顯示實(shí)施例3的概述。將藥物表達(dá)載體(A)和賦形劑(B)工程改造到牛肌肉和脂肪細(xì)胞中以探究體外藥物合成。綠色熒光蛋白(GFP)與治療組分的同時(shí)表達(dá)充當(dāng)基因表達(dá)的簡(jiǎn)單標(biāo)記。藥物表達(dá)載體(V565和AMP16,各自包含GFP標(biāo)記物)進(jìn)一步被工程改造以并入用于藥物活性的各種疾病反應(yīng)性機(jī)制，包括可裂解胰蛋白酶的富含賴氨酸的連接子、可裂解彈性蛋白酶的NPV-連接子或兩者的組合。在IBD和腸道沙門氏菌(Salmonellaenterica)感染的3D模型中測(cè)試牛肌肉細(xì)胞(增殖或分化)中的疾病反應(yīng)性可食用治療劑，[0058]圖13A-圖13E顯示牛衛(wèi)星細(xì)胞(BSC)培養(yǎng)結(jié)果。(圖13A)原代BSC的表征。增殖細(xì)胞顯示Pax7(一種肌肉干細(xì)胞標(biāo)記物)的普遍表達(dá)(比例尺：100μm)。(圖13B)分化細(xì)胞顯示肌管形成和肌球蛋白重鏈(MF20)的表達(dá)，指示成肌分化(比例尺是100μm)。(圖13C)在含血清的生長(zhǎng)培養(yǎng)基(GM)和無(wú)血清培養(yǎng)基(B8)的稀釋液中培養(yǎng)的BSC的四天生長(zhǎng)。在所有情況下，包括B8單獨(dú)使用(即無(wú)血清，最右柱),相比于GM單獨(dú)使用(最左柱),含有B8的稀釋液顯示顯著提高的四天內(nèi)生長(zhǎng)。不同字母指示組之間的統(tǒng)計(jì)顯著性(p<0.05)。(圖13D)用游離脂肪酸(FFA)進(jìn)行的BSC的成脂轉(zhuǎn)分化。用0到150μM亞油酸和亞油酸、芥子酸和反油酸(elaidid的AdipoRed分析結(jié)果。[0059]圖14A-圖14D顯示BSC組成工程改造。(圖14A)用pCrtB、pCrtB/I和pCrtB/I/Y工程大部分八氫番茄紅素轉(zhuǎn)化為番茄紅素。在pCrtB/I/Y細(xì)胞中，類胡蘿卜素以β-胡蘿卜素累積，但與pCrtB和pCrtB/I相比，總類胡蘿卜素水平顯著減少。不同字母指示條柱之間的統(tǒng)計(jì)增加。*指示顯著性(p<0.05)。(圖14C)有或無(wú)加熱下的工程改造BSC的硫代巴比妥酸反應(yīng)性物質(zhì)(TBARS)分析。所有加熱樣品與生樣品相比呈現(xiàn)丙二醛(MDA)的顯著增加，指示來(lái)自此現(xiàn)MDA的顯著減少，且pCrtB不呈現(xiàn)顯著變化。共享同一字母的條柱在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不同(p<熒光和光學(xué)顯微圖像。綠色熒光指示基因表達(dá)。在嘌呤霉素選擇之后，所有細(xì)胞都表達(dá)GFP[0060]圖15A-圖15H顯示3D腸模型。圖15A-圖15D顯示腸支架?7。(圖15A-圖15B)產(chǎn)生用于構(gòu)建圖案化和非圖案化模型腸的基于絲的3D多孔支架的示意圖。支架通過(guò)以下方式制備：將絲溶液澆鑄于PDMS模具中，并且將特氟隆涂布的線材或尼龍螺釘插入穿過(guò)圓柱體，凍干且誘導(dǎo)β折疊形成(比例尺：4mm)。(圖15C)支架中和2D培養(yǎng)物中的腸細(xì)胞標(biāo)記物(Z0-1和液沉積的甲苯胺藍(lán)染色的光學(xué)顯微鏡觀察顯示3D支架中相比于2D粘液厚度增加，且圖案化支架中相比于非圖案化粘液厚度增加(比例尺：200μm)。定量(數(shù)據(jù)未顯示)揭露非圖案化和圖案化支架的粘液沉積的與2D培養(yǎng)物相比分別增加2倍和3倍。圖15E-圖15H顯示IBD模型化55。圖15E通過(guò)用大腸桿菌(E.coli)0111:B4LPS和IFNγ處理誘導(dǎo)發(fā)炎。發(fā)炎模型中e-鈣黏素的染色顯示在第7天發(fā)炎組與未發(fā)炎組之間的上皮覆蓋度(epithelialcoverage)的差異(比例尺：100μm)。F)MUC2染色顯示所有組的染色陽(yáng)性指示杯狀細(xì)胞的存在(比例尺：100μm)。圖15G第7天模型的橫截面顯示不同的如通過(guò)e-鈣黏素觀察的上皮覆蓋度(比例尺[0061]圖15I-圖15L顯示微小隱孢子蟲(Cryptosporidiumparvum)感染3D腸模型5?。圖15I未感染的細(xì)胞顯示規(guī)律的微絨毛(比例尺：2μm)。圖15J第3天的微小隱孢子蟲I型裂殖體(meront)(粗箭頭)和納蟲空泡(emptyparasitophorousvacuole)(細(xì)箭頭)(比例尺：2μ[0062]圖16A-圖16B顯示牛衛(wèi)星細(xì)胞(BSC)培養(yǎng)結(jié)果。(圖16A)原代BSC的表征。增殖細(xì)胞(左圖)顯示Pax7(一種肌肉干細(xì)胞標(biāo)記物)的普遍表達(dá)。分化細(xì)胞(右圖)顯示肌管形成和肌球蛋白重鏈(MF20)的表達(dá)，指示成肌分化。(圖16B)在含血清的生長(zhǎng)培養(yǎng)基(GM)和無(wú)血清培養(yǎng)基(B8)的稀釋液中培養(yǎng)的BSC(左圖)。在所有情況下，包括B8單獨(dú)使用(即無(wú)血清，最右柱),相比于GM單獨(dú)使用(最左柱),含有B8的稀釋液顯示顯著提高的四天內(nèi)生長(zhǎng)。B8培養(yǎng)基2濃度顯示顯著提高的四天內(nèi)生長(zhǎng)。在左圖中，不同字母指示組之間的統(tǒng)計(jì)顯著性(p<[0063]圖17A-圖17B顯示用游離脂肪酸(FFA)進(jìn)行的牛衛(wèi)星細(xì)胞(BSC)的成脂轉(zhuǎn)分化。(圖導(dǎo)的脂質(zhì)累積的定量分析的AdipoRed分析結(jié)果。[0064]圖18顯示實(shí)施例4的概述。將配制培養(yǎng)基以探究牛肌肉和脂肪組織的無(wú)血清和無(wú)11抗生素培養(yǎng)的各種不同的方法。將分析細(xì)胞增殖和分化，也將分析營(yíng)養(yǎng)和肉類質(zhì)量特征。[0065]以引用的方式并入[0066]本說(shuō)明書中提到的所有公開(kāi)、專利和專利申請(qǐng)都以引用的方式并入本文中，其引用程度就如同每個(gè)個(gè)別的公開(kāi)、專利和專利申請(qǐng)?zhí)囟ǖ夭⑶覀€(gè)別地指示以引用的方式并入具體實(shí)施方式[0067]本公開(kāi)描述工程改造細(xì)胞和其在培養(yǎng)肉產(chǎn)品中的用途。細(xì)胞可以被工程改造以通過(guò)在細(xì)胞中表達(dá)一種或多種外源性生物合成途徑酶來(lái)內(nèi)源性地產(chǎn)生一種或多種代謝物。細(xì)胞還可以被工程改造以通過(guò)增加或減少細(xì)胞天然具有的生物合成途徑酶來(lái)增加或減少一種或多種內(nèi)源性產(chǎn)生的代謝物，或通過(guò)將非天然生物合成途徑酶引入到細(xì)胞中來(lái)增加天然代謝物的內(nèi)源性產(chǎn)生。[0068]如本文所用，“代謝物”是指是細(xì)胞中通過(guò)一種或多種生物合成途徑的初級(jí)或次級(jí)代謝的中間產(chǎn)物或最終產(chǎn)物的化合物。細(xì)胞代謝物在對(duì)蛋白質(zhì)和酶、酶輔因子或酶共底物、防御和與其它生物體或細(xì)胞的相互作用的供能、結(jié)構(gòu)、信號(hào)傳導(dǎo)、刺激和抑制作用方面具有苷酸、抗氧化因子、有機(jī)酸、多元醇和維生素。本文所述的細(xì)胞可以被工程改造以內(nèi)源性地產(chǎn)生一種或多種代謝物，包括但不限于植物化學(xué)物[0069]如本文所用，“植物化學(xué)物”是指在植物中發(fā)現(xiàn)且由植物產(chǎn)生的生物活性化合物，其通常在植物生長(zhǎng)或針對(duì)競(jìng)爭(zhēng)者、病原體或捕食者的防御中起作用。植物化學(xué)物生物合成途徑可以是初級(jí)或次級(jí)代謝途徑。盡管植物化學(xué)物可以從來(lái)源植物中提取和分離，但也可以將產(chǎn)生植物化學(xué)物的生物合成途徑基因工程改造到細(xì)菌、真菌或其它真核細(xì)胞中，或植物化學(xué)物可以合成方式產(chǎn)生。[0070]“植物營(yíng)養(yǎng)素”是指作為哺乳動(dòng)物飲食中的必需營(yíng)養(yǎng)素或具有支持哺乳動(dòng)物健康(health/wellness)的特定生物活性的植物化學(xué)物。植物營(yíng)養(yǎng)素可以包括但不限于多酚、萜糖苷、植物雌激素、植物固醇、花色素苷、@-3脂肪酸和益生菌。植物域中描述了植物營(yíng)養(yǎng)素和其在哺乳動(dòng)物和人類健康(health/wellness)中的功能。參見(jiàn)例如Gupta等人("Phytonutrientsastherapeuticagents,"J.ComplementIntegr.Med.,2014,11(3):151-169),其以引用的方式并入本文中。[0071]總體來(lái)說(shuō)，將編碼產(chǎn)生所關(guān)注的一種或多種代謝物所必需的一種或多種生物合成途徑酶的一種或多種異源和/或外源多核苷酸引入到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中以產(chǎn)生基因工程改造細(xì)胞，所述基因工程改造細(xì)胞內(nèi)源性產(chǎn)生所關(guān)注的一種或多種代謝物。細(xì)胞可以被工程改造以短暫地表達(dá)所需的所關(guān)注的生物合成途徑酶，或細(xì)胞可以被工程改造以穩(wěn)定地表達(dá)所需的所關(guān)注的生物合成途徑酶。可使用任何所屬領(lǐng)域中已知的轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)方法將編碼生物合成途徑酶的異源多核苷酸引入到細(xì)胞中?！吧锖铣赏緩矫浮笨苫Q地使用并且是指催化化學(xué)反應(yīng)的蛋白質(zhì)。關(guān)于任意獨(dú)立或作為生物合成途徑一部分的特定酶的敘述應(yīng)理解為包括酶正常運(yùn)作所必需的酶輔因子、輔酶和金酸、寡核苷酸、多核苷酸(所述術(shù)語(yǔ)可互換地使用)或其任何片段。這些短語(yǔ)還指天然或合成來(lái)源的DNA或RNA(其可以是單鏈或雙鏈的并且可以表示有義鏈或反義鏈)。多核苷酸可以是cDNA或基因組DNA。[0074]還提供與本文所述的多核苷酸同源的多核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解基因密碼的簡(jiǎn)并性和多種多核苷酸可以編碼同一多肽。在一些實(shí)施方式中，多核苷酸(即，編碼生物合成途徑酶以合成所關(guān)注的代謝物的多核苷酸)可針對(duì)特定細(xì)胞中的表達(dá)被密碼子優(yōu)化，所述特定細(xì)胞包括但不限于哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞或真菌細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，多核苷酸針對(duì)屬或物種特異性表達(dá)(例如，在牛細(xì)胞中表達(dá))被密碼子優(yōu)化。雖然本文公開(kāi)特定多核苷酸序列的實(shí)施例，但可使用編碼本文所描述的多肽的所要形式的任何多核苷酸序列。因此，可以使用非天然存在的序列。這些可以是合乎需要的，例如以增強(qiáng)在多肽或蛋白質(zhì)的異源表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)?？墒褂糜糜诋a(chǎn)生簡(jiǎn)并編碼序列的計(jì)算機(jī)程序且用于此目多核苷酸為通過(guò)實(shí)驗(yàn)室方法形成的多核苷酸，其包括來(lái)源于至少兩種不同天然來(lái)源的多核苷酸序列或其可以是合成的。因此，構(gòu)建體可以包括通過(guò)例如基因組編輯技術(shù)引入的對(duì)于內(nèi)源性基因的新修飾。構(gòu)建體還可以包括使用例如重組DNA方法產(chǎn)生的重組多核苷酸。[0076]本文所提供的構(gòu)建體可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員可用的方法制備。值得注意的是，本文所描述的構(gòu)建體中的每一種為重組分子，并且因此不存在于自然界中。一般來(lái)說(shuō)，本文中所用的命名法和本發(fā)明中所用的實(shí)驗(yàn)室程序包括本領(lǐng)域中眾所周知并且常用的分子技術(shù)、生物化學(xué)技術(shù)和重組DNA技術(shù)。可供本領(lǐng)域的技術(shù)人員使用的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可用于克隆、DNA[0077]本文所提供的構(gòu)建體可以包含與本文所描述的多核苷酸中的任一種可操作地連接的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可以是與本文所述的生物合成途徑相關(guān)的異源啟動(dòng)子或內(nèi)源性啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)，其可見(jiàn)于本文所描述的多核苷酸的5’側(cè)或3’側(cè)，或多核苷酸的編碼區(qū)內(nèi)，或多核苷酸中的內(nèi)含子內(nèi)的。通常，啟動(dòng)子是能夠在細(xì)胞中結(jié)合RNA聚合酶并且起始下游(3’方向)編碼序列的轉(zhuǎn)錄的DNA調(diào)節(jié)區(qū)。典型5’啟動(dòng)子序列在其3'端以轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為界，并且向上游(5’方向)延伸以包含在高于背景的可檢測(cè)水平下轉(zhuǎn)錄起始所必需的最少數(shù)目個(gè)堿基或元件。啟動(dòng)子序列內(nèi)有轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(方便地通過(guò)用核酸酶S1定位來(lái)定義)以及負(fù)責(zé)RNA聚合酶結(jié)合的蛋白質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(共有序列)。[0079]在一些實(shí)施方式中，編碼本文所述的生物合成途徑酶的多核苷酸與啟動(dòng)子可操作地連接。如本文所用，當(dāng)多核苷酸處于與第二多核苷酸序列的功能關(guān)系中時(shí)，多核苷酸是“可操作地連接(operablyconnected/operablylinked)”。苷酸連接以使得其可影響該多核苷酸的轉(zhuǎn)錄，那么啟動(dòng)子與多核苷酸可操作地連接。在各種實(shí)施方式中，多核苷酸可以與至少1、至少2、至少3、至少4、至少5或作地連接。[0080]可用于本發(fā)明的實(shí)踐的異源啟動(dòng)子包括但不限于組成型、誘導(dǎo)型、時(shí)間調(diào)節(jié)型(temporally-regulated)、發(fā)育調(diào)節(jié)型、化學(xué)調(diào)節(jié)型、組織偏好和組織特異性啟動(dòng)子。異源啟動(dòng)子可以是植物、動(dòng)物、細(xì)菌、真菌或合成啟動(dòng)子。適合于在植物中表達(dá)的啟動(dòng)子包括但不限于花椰菜花葉病毒(cauliflowermosaicvirus)的35S啟動(dòng)子質(zhì)激素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、雌激素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和四環(huán)素誘導(dǎo)型和四環(huán)素抑制型啟動(dòng)子。其它啟動(dòng)子包括但不限于以下的啟動(dòng)子：勞氏肉瘤病毒(Roussarcomavirus,RSV)、人免疫缺陷病毒(HIV-1)、巨細(xì)胞病毒(CMV)、Dox-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(例如Tet反應(yīng)元件(TRE))、泛素C毒等；以及翻譯延伸因子EF-lα啟動(dòng)子或泛素啟動(dòng)子。在昆蟲細(xì)胞中，典型啟動(dòng)子包括但不限于上游活化序列(UAS)、肌動(dòng)蛋白5c(Ac5)和多角體蛋白。在魚細(xì)胞中，典型啟動(dòng)子包括但不限于非洲爪蟾(Xenopuslaevis)延伸因子1α啟動(dòng)子(X1Eefla1)和大洋鱈魚(oceanpout)抗凍蛋白啟動(dòng)子(OP5a)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉廣泛多種用于不同細(xì)胞類型的另外啟動(dòng)子。在一些實(shí)施方式中，異源啟動(dòng)子包括對(duì)于植物宿主內(nèi)源或異源的植物啟動(dòng)子。[0081]提供包括本文所述的構(gòu)建體或多核苷酸中的任一種的載體。術(shù)語(yǔ)“載體”意在指一種多核苷酸，其能夠運(yùn)輸其已連接的另一多核苷酸。在一些實(shí)施方式中，載體可以是“質(zhì)?！?其是指其中可以連接額外DNA片段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。某些載體能夠在其所引入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如，具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和附加型哺乳動(dòng)物載體)。其它載體可以在引入到宿主細(xì)胞中之后整合到宿主細(xì)胞的基因組中，并且由此與宿主基因組一起復(fù)制，如一些病毒載體或轉(zhuǎn)座子。舉例來(lái)說(shuō)，用于本公開(kāi)的組合物和方法的適當(dāng)載體包括附加以下組成的線性或環(huán)形DNA或RNA分子：染色體、非染色體、半合成或合成的核酸。許多適合的載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的，并且是可商購(gòu)的。在一些實(shí)施方式中，載體為附加型載體，其歸因于復(fù)制起點(diǎn)的存在而能夠自主復(fù)制。還包括植物微型染色體作為載體。在一些實(shí)施方式中，載體為多順?lè)醋虞d體，其包含一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)和/或一個(gè)或多個(gè)2A肽序列，從而允許從單一構(gòu)建體或載體共表達(dá)多個(gè)多核苷酸。載體可以帶有基因元件，例如賦予某些藥物或化學(xué)物質(zhì)抗性的基因元件。[0082]在一些實(shí)施方式中，本文所述的構(gòu)建體或載體可以包含可選標(biāo)記物。如本文所用，“可選標(biāo)記物”是指一種基因元件，其允許通過(guò)在細(xì)胞中表達(dá)所述基因元件來(lái)識(shí)別和選擇含有具有所述基因元件的構(gòu)建體或載體的細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，可選標(biāo)記物是編碼熒光蛋白的多核苷酸，使得可以視覺(jué)上或通過(guò)適合細(xì)胞分選方法(例如熒光活化細(xì)胞分選 (FACS))識(shí)別表達(dá)熒光蛋白的細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，可選標(biāo)記物為使表達(dá)可選標(biāo)記物的細(xì)胞帶有抗生素抗性的多核苷酸(例如嘌呤霉素、青霉素、鏈霉素或潮霉素抗性基因)。用具有可選標(biāo)記物的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞可暴露于對(duì)可選標(biāo)記物具有特異性的選擇化學(xué)物質(zhì)以選出含有所述載體的細(xì)胞?？蛇x標(biāo)記物賦予針對(duì)選擇化學(xué)物質(zhì)的抗性，使得含有載體和可選標(biāo)記物的細(xì)胞存活，而不含有載體和可選標(biāo)記物的細(xì)胞被殺滅。[0083]如本文所用，“引入”描述將外源性多核苷酸(例如DNA或RNA)引入到接受細(xì)胞中的過(guò)程。將多核苷酸引入到細(xì)胞中的方法為本領(lǐng)域中已知的并且可包括但不限于顯微注射、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染方法。轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染可以根據(jù)本領(lǐng)域中眾所周知的各種方法在天然或人工條件下進(jìn)行，并且可以依賴于將外來(lái)核酸序列插入到宿主細(xì)胞中的任何已知方法。用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的方法基于所轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的類型選擇，并且可以包括但不限于[0084]在一些實(shí)施方式中，本文所描述的外源性多核苷酸、構(gòu)建體或載體使用適合的運(yùn)載體(carrier)轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。適合的運(yùn)載體在本領(lǐng)域中是已知且被使用了的，包括但不限于脂質(zhì)運(yùn)載體(例如，脂染胺(Lipofetamine))、聚合納米運(yùn)載體，[0085]如果細(xì)胞相比于相同類型的未經(jīng)基因組編輯的細(xì)胞包含對(duì)其基因組的修飾，那么外源性多核苷酸的原核或真核細(xì)胞，不管用于插入的方法是什么。在一些情況下，細(xì)胞已經(jīng)被修飾以包含通過(guò)人工(例如使用重組DNA技術(shù))產(chǎn)生或修飾的非天然存在的核酸分子或衍生自所述分子(例如通過(guò)轉(zhuǎn)錄、翻譯等)。含有外源、重組、合成和苷酸的細(xì)胞被視為工程改造或“基因組編輯”的細(xì)胞?；蚓庉嫽蛐揎椉?xì)胞是指修飾細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核酸，包括基因修飾細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源性和/或外源性核酸?；蛐揎椏梢园ㄈ笔А⒉逅崦富蛉斯すこ谈脑斓暮怂崦?或轉(zhuǎn)座酶進(jìn)行基因編輯。適于根據(jù)本文所提供的方法使用的進(jìn)行基因修飾的其它方法包括但不限于體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移(SCNT)和轉(zhuǎn)基因引入。獲得重組或基因修飾的細(xì)胞的程序在本領(lǐng)域中是一般已知的，并且描述于Sambrook等人，MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor(1989),其以引用的方式并入本文中。[0086]在一些實(shí)施方式中，使用CRISPR/Cas介導(dǎo)的基因編輯(例如II型CRISPR/cas系統(tǒng))將編碼產(chǎn)生所關(guān)注的代謝物所需的生物合成途徑酶的多核苷酸整合到細(xì)胞的基因組中。在一些情況下，使用CRISPR/cas系統(tǒng)減少一種或多種內(nèi)源性基因的蛋白質(zhì)表達(dá)。在一些實(shí)施方式中，CRISPR/Cas系統(tǒng)可用于進(jìn)行位點(diǎn)特異性插入。舉例來(lái)說(shuō)，基因組中的插入位點(diǎn)上的點(diǎn)切可由CRISPR/cas進(jìn)行以促進(jìn)轉(zhuǎn)基因在插入位點(diǎn)處的插入。適合于宿主細(xì)胞的CRISPR/Cas介導(dǎo)的基因編輯的技術(shù)是已知的且如本領(lǐng)域中所描述的。[0087]在一些實(shí)施方式中，使用轉(zhuǎn)座子將編碼產(chǎn)生所關(guān)注的代謝物所需的生物合成途徑酶的多核苷酸整合到細(xì)胞的基因組中。適合的轉(zhuǎn)座子是已知的且如本領(lǐng)域中所描述的，包Hsmar1和Harbinger3_DR。參見(jiàn)例如Ivics等人("Theexpandinguniverseoftransposontechnologiesforgeneandcellengineering,"MobileDNA,1(25),2010),其描述轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)和本領(lǐng)域中用途。[0088]在一些實(shí)施方式中，使用轉(zhuǎn)基因?qū)⒕幋a產(chǎn)生所關(guān)注的代謝物所需的生物合成途徑酶的多核苷酸整合到細(xì)胞的基因組中。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因”是指可以轉(zhuǎn)移到生物體或其細(xì)胞中的基因或基因材料。CN120210127A說(shuō)明書12/87頁(yè)[0089]在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞被工程改造以內(nèi)源性地產(chǎn)生類胡蘿卜素八氫番茄紅素。八氫番茄紅素通過(guò)酶八氫番茄紅素合成酶由兩個(gè)香葉基氫番茄紅素合成酶的多核苷酸引入到天然產(chǎn)生香葉基香葉基焦磷酸的細(xì)胞中以產(chǎn)生表達(dá)素合成酶來(lái)自細(xì)菌鳳梨泛菌(Pantoeaananatis)并且具少85%、90%、95%、98%、99%或99.9%相同的序列。在鳳梨泛菌中，八氫番茄紅素合成酶13/87頁(yè)13/87頁(yè)[0119]CTGGGATCAGCGGCAGTCAACGACCACGCCCGAAAAATTAACGCTGCTGCTGGC[0120]CCTCTGGTCAGGCCCTTACTTCCCGGATGCGGGCTCAT[0122]在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞內(nèi)源性產(chǎn)生量為約1μg/g蛋白質(zhì)到約800μg/g蛋白質(zhì)、約5μg/g蛋白質(zhì)到約600μg/g蛋白質(zhì)、約10μg/g蛋白質(zhì)到約500μg/g蛋白質(zhì)、約25μg/g蛋白質(zhì)到約300μg/g蛋白質(zhì)、約30μg/g蛋白質(zhì)到約250μg/g蛋白質(zhì)或約30μg/g蛋白質(zhì)到100μg/g蛋白質(zhì)的八氫番茄紅素。在一些實(shí)施方式中，與不含有編碼八氫番茄紅素合成酶的多核苷酸的細(xì)胞相比，細(xì)胞內(nèi)源性地產(chǎn)生至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少11倍、至少12倍、至少13倍或至少14倍更多的八氫番茄紅素。[0123]在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞被工程改造以內(nèi)源性地產(chǎn)生類胡蘿卜素番茄紅素。番茄紅素通過(guò)八氫番茄紅素去飽和酶由八氫番茄紅素合成。將編碼八氫番茄紅素去飽和酶的多核苷酸引入到產(chǎn)生八氫番茄紅素的細(xì)胞中以產(chǎn)生表達(dá)八氫番茄紅素去飽和酶并且內(nèi)源性地合成番茄紅素的細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，八氫番茄紅素去飽和酶來(lái)自鳳梨泛菌并且具有SEQIDNO:3的多肽序列。在一些實(shí)施方式中，八氫番茄紅素去飽和酶具有與SEQIDNO:3至少85%、90%、95%、98%、99%或99.9%相同的序列。在鳳梨泛菌中，八氫番茄紅素去飽和酶由具有SEQIDNO:4的序列的基因crtI編碼。在一些實(shí)施方式中，crtI序列可以針對(duì)所關(guān)注的特定細(xì)胞中的表達(dá)被密碼子優(yōu)化。在一些實(shí)施方式中，crtI序列針對(duì)在牛細(xì)胞中的表達(dá)被密碼子優(yōu)化(例如SEQIDNO:39)。[0124]SEQIDNO:3八氫番茄紅素去飽和酶(UniprotP21685):在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞內(nèi)源性產(chǎn)生量為約1μg/g蛋白質(zhì)到約800μg/g蛋白質(zhì)、約5μg/g蛋白質(zhì)到約600μg/g蛋白質(zhì)、約10μg/g蛋白質(zhì)到約500μg/g蛋白質(zhì)、約25μg/g蛋白質(zhì)到質(zhì)的番茄紅素。在一些實(shí)施方式中，與不含有編碼八氫番茄紅素合成酶和八氫番茄紅素去飽和酶的多核苷酸的細(xì)胞相比，細(xì)胞內(nèi)源性地產(chǎn)生至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少11倍、至少12倍、至少13倍或至少14倍更多的番茄紅素。[0129]在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞被工程改造以內(nèi)源性地產(chǎn)生類胡蘿卜素β-胡蘿卜素。β-胡蘿卜素通過(guò)酶番茄紅素環(huán)化酶由番茄紅素合成。將編碼番茄紅素環(huán)化酶的多核苷酸引入到產(chǎn)生番茄紅素的細(xì)胞中以產(chǎn)生表達(dá)番茄紅素環(huán)化酶并且內(nèi)源性合成β-胡蘿卜素的細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，番茄紅素環(huán)化酶來(lái)自細(xì)菌鳳梨泛菌并且具有SEQIDNO:5或SEQIDNO:11的多肽序列。在一些實(shí)施方式中，番茄紅素環(huán)化酶具有與SEQIDNO:5或SEQIDNO:11至少85%、90%、95%、98%、99%或99.9%相同的序列。在鳳梨泛菌中，番茄紅素環(huán)化酶由具有SEQIDNO:6的序列的基因crtY編碼。在一些實(shí)施方式中，crtY序列可以針對(duì)所關(guān)注的特定細(xì)胞中的表達(dá)被密碼子優(yōu)化。在一些實(shí)施方式中，crtY序列針對(duì)在牛細(xì)胞中的表達(dá)被密碼子優(yōu)化(例如SEQIDNO:40)。盡管下文所列的序列來(lái)自鳳梨泛菌，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到同源序列可以從用于本文所述的工程改造細(xì)胞和方法的其它物種識(shí)別出。[0130]SEQIDNO:5番茄紅素環(huán)化酶(UniprotP21687):CN120210127AMQPHYDLILVGAGLANGLIALRLQQQQPDMRILLIDAAPQAGGNHTWSFHRWIAPLVVHHWPDYQVRFPTRRRKLNSGYFCITSQRFAEVLLRQFGPVNAESVRLKKGQVIGARAVIDGRGYAANSALSVGFQAFIGQEWRLSRPHGLS[0131]TVDQQNGYRFVYSLPLSPTRLLIEDTHYIDNATLDPERARQNICDYAAQQGWQLQTLLREEQGALPITLSGNADAFWQQRPLACSGLRAGLFHPTTGYSLPLAVAVAASIHQAITHFARERWQQQRFFRMLNRMLFLAGPADLRWRVMQRFYGLPEDKLTLTDRLRILSGKPPVPVLAALQA[0132]SEQIDNO:11番茄紅素環(huán)化酶：MQPHYDLILVGAGLANGLIALRLQQQQPDMRILLIDAAPQAGGNHTWSFHRWIAPLVVHHWPDYQVRFPTRRRKLNSGYFCITSQRFAEVLQRQFGPVNAESVRLKKGQVIGARAVIDGRGYAANSALSVGFQAFIGQEWRLSHPHGLS[0133]TVDQQNGYRFVYSLPLSPTRLLIEDTHYIDNATLDPECARQNICDYAAQQGWQLQTLLREEQGALPITLSGNADAFWQQRPLACSGLRAGLFHPTTGYSLPLAVAVAASIHHAITHFARERWQQQGFFRMLNRMLFLAGPADSRWRVMQRFYGLPEDKLTLTDRLRILSGKPPVPVLAALQAATGCAACCGCATTATGATCTGATTCTCGTGGGGGCTGGACTCGCGAAGCCCTGCGTCTTCAGCAGCAGCAACCTGATATGCGTATTTTCCCCAGGCGGGCGGAAATCATACGTGGTCATTTCACCACGATCAACATCGTTGGATAGCGCCGCTGGTGGTTCATCACTGGCCTTTCCCACACGCCGTCGTAAGCTGAACAGCGGCTACTTCTGTTCGCTGAGGTTTTACTGCGACAGTTTGGCCCGCACTTGTGGATCAGAGGTTAATGCGGAATCTGTTCGGTTGAAAAAGGGTCAGGCGGTGATTGACGGGCGGGGTTATGCGGCAAACTCAGCACTGGCGTTTATTGGCCAGGAATGGCGATTGAGCCGCCCGCATGTATCATGGATGCCACGGTCGATCAGCAAAATGGTTATCGCTTGCTCTCGCCGACCAGATTGTTAATTGAAGACACGCACTATATAGATCCTGAACGCGCGCGGCAAAATATTTGCGACTATGCCGCGCAACAGCTTCAGACTCTGCTGCGTGAAGAACAGGGCGCCTTACCCATTACCATGCCGACGCATTCTGGCAGCAGCGCCCCCTGGCCTGTAGTGGATTATGTTCCATCCTACCACCGGCTATTCACTGCCGCTGGCGGTTTGAGCGCACTTGATGTCTTTACGTCGGCCTCAATTCATCAGGCCCGCGAGCGCTGGCAGCAGCAGCGCTTTTTCCGCATGCTGAAGCCGGGCCCGCCGATTTACGCTGG[0136]在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞內(nèi)源性產(chǎn)生量為約1μg/g蛋白質(zhì)到約800μg/g蛋白質(zhì)、約5μg/g蛋白質(zhì)到約600μg/g蛋白質(zhì)、約10μg/g蛋白質(zhì)到約500μg/g蛋白質(zhì)、約25μg/g蛋白質(zhì)到約300μg/g蛋白質(zhì)、約30μg/g蛋白質(zhì)到約250μg/g蛋白質(zhì)或約30μg/g蛋白質(zhì)到100μg/g蛋白質(zhì)的β-胡蘿卜素。在一些實(shí)施方式中，與不含有編碼八氫番茄紅素合成酶、八氫番茄紅素去飽和酶和番茄紅素環(huán)化酶的多核苷酸的細(xì)胞相比，細(xì)胞內(nèi)源性地產(chǎn)生至少2倍、至少3倍、至13倍或至少14倍更多的β-胡蘿卜素。[0137]在一些實(shí)施方式中，工程改造細(xì)胞中的總類胡蘿卜素產(chǎn)量為約1μg/g蛋白質(zhì)到約質(zhì)到100μg/g蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，工程改造細(xì)胞中的總類胡蘿卜素產(chǎn)量比不含編碼八氫番茄紅素合成酶、八氫番茄紅素去飽和酶和番茄紅素環(huán)化酶的多核苷酸的細(xì)胞中的總[0138]在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞被工程改造以內(nèi)源性產(chǎn)生維生素C。盡管哺乳動(dòng)物細(xì)胞例如天然產(chǎn)生維生素C前體UDP-葡萄糖并且具有編碼維生素C生物合成途徑酶的基因，但維生素C生物合成途徑通常在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中沉默。維生素C生物合成，包括中間物的示意圖顯示于圖10中。維生素C生物合成途徑酶包括UDP-葡萄糖6-脫氫酶(UGDH)、UDP葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1(UGT1A1)、醛-酮還原酶家族1(AKR1A1)、鈣調(diào)素(RGN)和L-古洛糖酸-γ-內(nèi)酯氧化多核苷酸引入到細(xì)胞中。在一些實(shí)施方式中，將編碼RGN的異源多核苷酸引入到細(xì)胞中。在一些實(shí)施方式中，將編碼GULO的異源多核苷酸引入到細(xì)胞中。在一些實(shí)施方式中，將編碼列對(duì)于其中引入多核苷酸序列的細(xì)胞是內(nèi)源性的。在一些實(shí)施方式中，UGT1A1、UGDH、的氨基酸序列對(duì)于其中引入多核苷酸序列的細(xì)胞是外源性的。在一些實(shí)IDNO:12-16的多肽序列，并且將多核苷酸序列引入到其中的細(xì)胞是牛細(xì)胞。在一些實(shí)施方至少85%、90%、95%、98%、99%或99.9%相同的序列。雖然下文所列的序列來(lái)自歐洲牛，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到同源序列可以從用于本文所述的工程改造細(xì)胞和方法的其它物種識(shí)別出。[0139]SEQIDNO:12UGDH(UniProt:P123SEQIDNO:14AKR1A1(UniProt:Q3ZCJ2):SEQIDNO:15RGN(UniProt:Q9TTJ5):SEQIDNO:16GULO(UniProt:Q3ZC33):在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞被工程改造以內(nèi)源性地產(chǎn)生姜黃素。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中天然產(chǎn)生的酪氨酸是使用生物合成途徑酶酪氨酸氨裂解酶(PTAL)、4-香豆酸-CoA連接酶(4CL)、苯基丙酰基-二酮-CoA合成酶(DCS)和姜黃素合成酶(CURS3)的姜黃素生物合成的前體。生物合成途徑，包括中間物的示意圖顯示于圖10中。將編碼PTAL、4CL、DCS和CURS3的一種或多種多核苷酸引入到天然產(chǎn)生酪氨酸的細(xì)胞中以產(chǎn)生表達(dá)PTAL、4CL、DCS和CURS3并且內(nèi)源性合成姜黃素的細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，PTAL、4CL、DCS和CURS3生物合成酶來(lái)自水稻(0ryzasativa)和姜黃(Curcumalonga),并且分別具有SEQIDNO:17-20的多肽序列。在一些實(shí)施方式中，PTAL、4CL、DCS和CURS3分別具有與SEQIDNO:17-20至少85%、90%、95%、98%、99%或99.9%相同的序列。在一些實(shí)施方式中，將生物合成途徑酶中的僅一種、兩種或三種工程改造到細(xì)胞中以使得產(chǎn)生途徑中間物。雖然下文所列的序列來(lái)自水稻和姜黃，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到同源序列可以從用于本文所述的工程改造細(xì)胞和方法的其它物種識(shí)別出。[0150]SEQIDNO:17PT[0158]在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞被工程改造以使用生物合成途徑酶PTAL、4CL和雙脫甲氧姜黃素合成酶內(nèi)源性產(chǎn)生姜黃素。將編碼PTAL、4CL和雙脫甲氧姜黃素合成酶的一種或多種多核苷酸引入到天然產(chǎn)生酪氨酸的細(xì)胞中以產(chǎn)生表達(dá)PTAL、4CL和雙脫甲氧姜黃素合成酶并且內(nèi)源性合成姜黃素的細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，PTAL、4CL和雙脫甲氧姜黃素合成酶分別具有SEQIDNO:17、18和21的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，PTAL、4CL和雙脫甲氧姜黃素合成酶分別具有與SEQIDNO:17、18和21至少85%、90%、95%、98%、99%或99.9%相同的氨基酸序列。雖然下文所列的序列來(lái)自水稻，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到同源序列可以從用于本文所述的工程改造細(xì)胞和方法的其它物種識(shí)別出。[0159]SEQIDNO:21雙脫甲氧姜黃素合成酶粳稻(UniProt:Q8LILO):[0161]在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞被工程改造以內(nèi)源性地產(chǎn)生大麻二酚。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中天然產(chǎn)生的丙二酰基-CoA是使用生物合成途徑酶3,5,7-三氧代十二?；?CoA合成酶(OLS)、橄欖醇酸環(huán)化酶(0AC)、大麻萜酚酸合成酶(CBGAS,也稱為異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶1或PT1)和大麻二酚酸合成酶(CBDAS)的大麻二酚(CBD)生物合成的前體。生物合成途徑，包括細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，CBD生物合成途徑中可使用異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶NphB代替CPGAS。在且分別具有SEQIDNO:22-26的多肽序列。在一些實(shí)施方式中，0LS、OAC、CPGAS、CBDAS和NphB分別具有與SEQIDNO:22-26至少85%、90%、95%、98%、99%或99.9%相同的序列。在一些實(shí)施方式中，將生物合成途徑酶中的僅一種、兩種或三種工程改造到細(xì)胞中以使得產(chǎn)生途徑中間物。雖然下文所列的序列來(lái)自大麻，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到同源序列可以從用于本文所述的工程改造細(xì)胞和方法的其它物種識(shí)別出。[0162]SEQIDNO:[0164]SEQIDNO:230AC[0168]SEQIDNO:25CBDAS(UniProt:A6P6V9):[0170]SEQIDNO:26NphB(UniProt:ACN120210127AMSGAADVERVYAAMEEAAGLLDVSCAREKIYPLLTVFQDTLTDGVVVFLDFSISVPVSQGDPYATVVKEGLFQATGSPVDELLADTVAHLPVSMFAIDGTYAFFPTDDMPGVAQLAAIPSMPASVAENAELFARYGLDKVQMTSM[0171]SDLKQEYLQPESVVALARELGLRVPGELGLEFCKRSFAVYPTLNWDTGKDPTLVPSEDERDIEMFRNYATKAPYAYVGEKRTLVYGLTLSSTEEYYKL[0172]以下基因序列針對(duì)牛細(xì)胞中表達(dá)被密碼子優(yōu)化。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，基因序列可針對(duì)來(lái)自花藥(anther)物種的細(xì)胞中的表達(dá)而優(yōu)化，或可以使用來(lái)自大麻的野生型序列。ATGAACCACCTGAGAGCCGAAGGACCTGCCTCTGTGCTGGCCATCGTCCTGAGAACATCCTGCTGCAGGACGAGTTCCCCGACTACTAGAGCGAGCACATGACCCAGCTGAAAGAGAAGTTCCGCAAGAATGATCCGCAAGAGGAACTGCTTCCTGAACGAGGAACACCTGAAGCAGCTGGTGGAACACGAGATGCAGACCCTGGACGCCAGACAGGAAAGTGCCCAAGCTGGGCAAAGATGCCTGTGCCAAGGCCATCAAAGAGCCTAAGAGCAAGATCACCCACCTGATCTTCACCAGCGCCAGGGCGCCGATTACCACTGCGCCAAACTGCTGGGACTGAGCCCATGATGTACCAGCTGGGCTGTTACGGCGGAGGCACCGTGCTGAGAATTATCGCCGAGAACAACAAGGGCGCCAGAGTGCTGGCCGTGTG[0174]CCTGCCTGTTCAGGTTTTTGGAGATGGCGCCGCTGCTGTGATCGTGGGAGCTGAGCCGCGAAAGACCCATCTTCGAGCTGGTGTCTACCGGCCAGACCAGGGAACCATCGGCGGCCACATCAGAGAAGCCGGCCTGATCTTTGACGACGTGCCCATGCTGATCTCCAACAACATCGAGAAGTGCCTCCCATCGGCATCAGCGACTGGAACAGCATCTTCTGGATCAGGCCATCCTGGACAAGGTGGAAGAGAAGCTGCACCTGAAGTCACAGCAGACACGTGCTGTCCGAGCACGGCAACATGAGCAGCTCTACGTGATGGACGAGCTGAGGAAGCGCTCTCTGGAAGAGGGCAAGCGGATTTGAATGGGGCGTGCTGTTTGGCTTCGGCCCTGGACTATGGCAGTTAAGCACCTGATCGTGCTGAAGTTCAAGGACGAGATCACGAAAGAAGAGTTCTTCAAGACCTACGTGAACCTGGTCAACAAGGACGTGTACTGGGGCAAAGACGTGACCCAGAAGAACAAAGAGGAACCACATCGTGGAAGTGACCTTCGAGTCCGTGGAAACCATCCCCCCGCTCACGTCGGATTCGGCGACGTGTACAGATCCTTCTCN120210127A說(shuō)明書22/87頁(yè)ATGGGATTGAGTAGCGTGTGCACCTTCAGCTTCCAAACGAACTACCAAACCCGCACAACAACAACCCCAAGACCAGCCTGCTGTGCTACAGGCACCCATCAAGTACAGCTACAACAACTTCCCCAGCAAGCACTGCAGCTCCATCTGCAAAACAAGTGCAGCGAGAGCCTGTCTATCGCCAGCCGCCACCACCAATCAGACCGAGCCTCCAGAGTCTGACACAAGATCCTGAACTTCGGCAAGGCCTGCTGGAAGCTGCAGATTGCCTTCACCTCTTGCGCCTGCGGCCTGTTCGGAAAAGAGCATCTGATCAGCTGGTCCCTGATGTTCAAGGCCTTCTTCTTCCTGGTGTATCGCCAGCTTCACCACCACCATCAACCAGATCTACGATCTCAACAAGCCCGATCTGCCTCTGGCCTCTGGCGAGATCTCTG[0178]CATGAGCATCATCGTGGCCCTGTTCGGGCACCCCTGTACATCTTCGGCTACTGCTTCGGCATCTTCGGAGGCATCGCCTCCATTCCGCTGGAAGCAGAATCCCTCTACCGCCTTCCTACATCATTACCAACTTCACCTTCTACTACGCCAGCAGGGCCGCTCTTTGAACTGAGGCCCTCTTTCACCTTTCTGCTGGCCTTTATGAACCTGGCTCTGATCAAGGATGCCAGTGATGTGGAAGGCGACAGCACCCTGGCCTCTAAGTACGGCAGCAGAAATCTGACCCTGTGCTGCTGTCTTACGTGGCCGCTATCCTGGCCGGAATCATTTGCAGCAACGTGATGCTGCTGAGCCACGCCATTCTGGCCTTTTCAGGGATTTCGCCCTGACCAACTACGATCCTGAGGCCGGCACATGTGGAAGCTGTACTACGCCGAGTACCTGG[0181]在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞被工程改造以表達(dá)抗TNFa納米抗體V565(SEQIDNO:7)。用編碼納米抗體V565的異源多核苷酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞以產(chǎn)生表達(dá)納米抗體V565的細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，多核苷酸編碼與SEQIDNO:7至少85%、90%、95%、98%、99%或99.9%相同的多肽。在一些實(shí)施方式中，編碼V565的多核苷酸針對(duì)所關(guān)注的特定細(xì)胞中的表達(dá)被密碼子優(yōu)化。在一些實(shí)施方式中，編碼V565的多核苷酸針對(duì)牛細(xì)胞中的表達(dá)被密碼子優(yōu)化。SEQIDNO:7納米抗體V565:在一些實(shí)施方式中，V565通過(guò)柔性可裂解連接子與人TNFa連接，并且將表達(dá)通過(guò)柔性可裂解連接子與人TNFa連接的V565的多核苷酸引入到細(xì)胞中。不希望受任何特定理論CN120210127A說(shuō)明書24/87頁(yè)苷酸編碼與SEQIDNO:8至少85%、90%、95%、98%、99%或99.9%相同的多肽。在一些實(shí)個(gè)、至少8個(gè)、至少9個(gè)或至少10個(gè)AMP16的重復(fù)序列將在構(gòu)建體中組裝，每個(gè)重復(fù)序列由NPV連接子間隔開(kāi)。[0189]在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞被工程改造以表達(dá)絲氨酸蛋白酶抑制劑(SPI)以抑制氨基酸序列或與其至少85%、90%、95%、98%、99%或99.9%相同的序列。在一些實(shí)施方式中，SPI為TspAd5,其具有SEQIDNO:33的氨基酸序列或與其至少85%、90%、95%、98%、99%或99.9%相同的序列。MANLYNSMMLISLILCPLNEIWNSCGSSCEETCESIASGKDTPCTLQCVPGCDLRGRCIPMSLCPNKVNSSCPENEVFQECGSACPETCDTVSSGFERPCTG[0191]GYVRGYDGKCIPPEDCGKPNNDKCFCKSGYVRASTGECLAPEACGAHLGGCGPREEYRACGSACPESCESIKDVPGCFCKFPFVRGYDLRCIatggccaatctctataatagtataaagacacaccttgcactctgcagtgcgttgtttcctcgggatttgaaagaccttgcacgaatgggtatgtacgaggttatgcttctgcaaatctggcttgtccagaatcttgtgaatcSEQIDNO:33TspAd5(GenBank:EU263307.1)agattattggagaaaattgtggaattgttgtgaacgaaatcattagctgatttcgcttattcgctttatcaattggaagaagcaggaaatgtattctttcaccagtatcgatttctgatactcaactgctgaatgtgatgttcaaagctggctggaagaaaaatcgcaatgcggtcgttcgtttcatcgtggccaatcgattgtatgcttgaaaagatatctatcaagtgatttggttagtgtaaattttgtttgcagattaataagtgggtgagcgataatctggaacagttgaggcaaatcctcttgggatgaggttttcgacgaagcacatacaaagcggcgcacagttcaattaaaataccaatgatattaccaaagtcaggaaaaacacttttgttaaattggtatccaaagttagcggtgctgaagtgaaagtgacaatt