固氮施氏假單胞菌中NfiS非編碼RNA對(duì)氧化脅迫反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控探秘一、引言1.1細(xì)菌非編碼RNA的全面解析1.1.1細(xì)菌非編碼RNA的定義與分類細(xì)菌非編碼RNA（non-codingRNA，ncRNA）是一類從細(xì)菌基因組上轉(zhuǎn)錄而來(lái)，但不經(jīng)過(guò)翻譯過(guò)程轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)，卻在RNA水平上執(zhí)行獨(dú)特生物學(xué)功能的RNA分子。這類RNA在細(xì)菌的生命活動(dòng)中扮演著至關(guān)重要的角色，廣泛參與了細(xì)菌的各種生理過(guò)程。根據(jù)長(zhǎng)度、結(jié)構(gòu)特征以及功能等方面的差異，細(xì)菌非編碼RNA可大致分為小RNA（smallRNA，sRNA）和長(zhǎng)鏈非編碼RNA（longnon-codingRNA，lncRNA）等類型。小RNA通常長(zhǎng)度在50-500個(gè)核苷酸之間，轉(zhuǎn)錄通常開(kāi)始于一段能折疊成穩(wěn)定莖環(huán)結(jié)構(gòu)的序列，終止于一個(gè)Rho不依賴的轉(zhuǎn)錄終止子。例如大腸桿菌中的6SRNA，它能夠與RNA聚合酶結(jié)合，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，在細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境變化和生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在固氮施氏假單胞菌中也發(fā)現(xiàn)了多種小RNA參與固氮、碳代謝等重要生理過(guò)程的調(diào)控。長(zhǎng)鏈非編碼RNA長(zhǎng)度一般大于200個(gè)核苷酸，具有高度的異質(zhì)性。雖然在細(xì)菌中長(zhǎng)鏈非編碼RNA的研究相對(duì)較少，但已有研究表明它們?cè)诨蜣D(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等方面具有重要作用。如在某些細(xì)菌中，長(zhǎng)鏈非編碼RNA可通過(guò)與DNA形成特定的結(jié)構(gòu)，影響基因的轉(zhuǎn)錄起始，進(jìn)而調(diào)控細(xì)菌的生理功能。1.1.2細(xì)菌非編碼RNA的作用機(jī)制細(xì)菌非編碼RNA發(fā)揮功能主要通過(guò)與DNA、RNA、蛋白質(zhì)等生物大分子相互作用，在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和翻譯等多個(gè)水平對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。在轉(zhuǎn)錄水平，一些非編碼RNA可以與DNA結(jié)合，改變DNA的局部結(jié)構(gòu)，影響RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合，從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄起始。例如，某些小RNA能夠與啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列互補(bǔ)配對(duì)，阻止RNA聚合酶的結(jié)合，抑制基因轉(zhuǎn)錄；而另一些非編碼RNA則可以招募轉(zhuǎn)錄激活因子，促進(jìn)RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合，增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)錄。在轉(zhuǎn)錄后水平，細(xì)菌非編碼RNA主要通過(guò)與靶標(biāo)mRNA相互作用來(lái)發(fā)揮調(diào)控作用。大部分小RNA在分子伴侶蛋白Hfq的協(xié)助下，通過(guò)堿基配對(duì)的方式與靶標(biāo)mRNA的特定區(qū)域結(jié)合。這種結(jié)合可能會(huì)影響靶標(biāo)mRNA的穩(wěn)定性，當(dāng)小RNA與mRNA結(jié)合后，可招募核酸酶對(duì)mRNA進(jìn)行降解，從而降低mRNA的水平；也可能影響mRNA的翻譯效率，如阻止核糖體與mRNA的結(jié)合，抑制蛋白質(zhì)的合成。以大腸桿菌中參與鐵代謝調(diào)控的小RNAPrrF為例，PrrF可以與編碼鐵攝取相關(guān)蛋白的mRNA結(jié)合，導(dǎo)致mRNA降解，從而減少細(xì)胞內(nèi)鐵攝取蛋白的合成，維持細(xì)胞內(nèi)鐵離子的平衡。此外，細(xì)菌非編碼RNA還可以與蛋白質(zhì)相互作用，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的活性和功能。一些非編碼RNA具有蛋白結(jié)合能力，可通過(guò)與靶標(biāo)蛋白的高親和結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)蛋白與其天然靶標(biāo)的結(jié)合，從而參與蛋白的調(diào)控活性。例如，碳代謝抑制調(diào)控的非編碼RNACrcYZ通過(guò)與碳代謝抑制蛋白Crc結(jié)合，解除Crc對(duì)碳代謝相關(guān)基因的抑制作用，調(diào)控細(xì)菌的碳代謝過(guò)程。1.1.3細(xì)菌非編碼RNA的調(diào)控功能細(xì)菌非編碼RNA廣泛參與了細(xì)菌的多種生理過(guò)程，對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)、發(fā)育、應(yīng)激反應(yīng)等起著重要的調(diào)控作用，是細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境變化和維持生存的關(guān)鍵因素之一。在生長(zhǎng)發(fā)育方面，細(xì)菌非編碼RNA參與調(diào)控細(xì)菌的細(xì)胞周期、形態(tài)發(fā)生等過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，某些非編碼RNA可以通過(guò)調(diào)控與細(xì)胞分裂相關(guān)基因的表達(dá)，影響細(xì)菌的細(xì)胞周期進(jìn)程，確保細(xì)菌正常的生長(zhǎng)和繁殖。在枯草芽孢桿菌中，一些小RNA參與了芽孢形成過(guò)程的調(diào)控，它們通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，影響芽孢的形態(tài)發(fā)生和成熟，使細(xì)菌能夠在不利環(huán)境下存活。細(xì)菌在生存過(guò)程中會(huì)面臨各種環(huán)境脅迫，如氧化脅迫、滲透壓脅迫、溫度變化等，非編碼RNA在細(xì)菌應(yīng)對(duì)這些脅迫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。當(dāng)細(xì)菌遭受氧化脅迫時(shí)，一些非編碼RNA可被誘導(dǎo)表達(dá)，它們通過(guò)調(diào)控抗氧化酶基因的表達(dá)或直接參與抗氧化反應(yīng)，幫助細(xì)菌抵御氧化損傷，維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡。在固氮施氏假單胞菌中，非編碼RNANfiS在氧化脅迫條件下表達(dá)發(fā)生變化，參與調(diào)控氧化脅迫相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)氧化脅迫的抗性。此外，細(xì)菌非編碼RNA還在細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)代謝、群體感應(yīng)、毒力等方面發(fā)揮重要調(diào)控功能。在營(yíng)養(yǎng)代謝方面，非編碼RNA參與調(diào)控碳源、氮源等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取和利用，確保細(xì)菌在不同營(yíng)養(yǎng)條件下能夠維持正常的代謝活動(dòng)。在群體感應(yīng)中，非編碼RNA可調(diào)節(jié)細(xì)菌群體密度相關(guān)基因的表達(dá)，影響細(xì)菌的群體行為和生物膜形成。對(duì)于病原菌而言，非編碼RNA還參與調(diào)控毒力基因的表達(dá)，影響病原菌的致病能力和感染過(guò)程。1.2細(xì)菌非編碼RNA調(diào)控氧化脅迫抗性的研究進(jìn)展1.2.1細(xì)菌中氧化脅迫抗性調(diào)控系統(tǒng)的研究細(xì)菌在自然環(huán)境中生存時(shí)，不可避免地會(huì)遭受各種氧化脅迫，如活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）的積累。ROS主要包括超氧陰離子（O_2^-）、過(guò)氧化氫（H_2O_2）和羥自由基（·OH）等，它們是細(xì)菌有氧代謝的副產(chǎn)物，同時(shí)也可由外界環(huán)境因素如紫外線、輻射、化學(xué)物質(zhì)等誘導(dǎo)產(chǎn)生。這些高活性的分子能夠攻擊細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的各種生物大分子，包括DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的損傷，嚴(yán)重時(shí)甚至威脅細(xì)菌的生存。為了應(yīng)對(duì)氧化脅迫帶來(lái)的危害，細(xì)菌進(jìn)化出了一套復(fù)雜而精細(xì)的氧化脅迫抗性調(diào)控系統(tǒng)。該調(diào)控系統(tǒng)主要由一系列相關(guān)基因和復(fù)雜的信號(hào)通路組成。從基因?qū)用鎭?lái)看，細(xì)菌擁有眾多編碼抗氧化酶的基因，這些酶在清除ROS的過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）基因是其中重要的一員，它編碼的SOD酶能夠催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)，將其轉(zhuǎn)化為氧氣和過(guò)氧化氫，從而有效降低細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子的濃度，減輕其對(duì)細(xì)胞的毒性。根據(jù)金屬輔基的不同，SOD可分為Fe-SOD、Mn-SOD和Cu/Zn-SOD等多種類型，不同類型的SOD在細(xì)菌中的分布和功能略有差異。例如，在大腸桿菌中，F(xiàn)e-SOD主要存在于細(xì)胞周質(zhì)空間，而Mn-SOD則主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，它們協(xié)同作用，共同抵御超氧陰離子的侵害。過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）基因也是氧化脅迫抗性調(diào)控系統(tǒng)中的關(guān)鍵基因之一。過(guò)氧化氫酶能夠?qū)⑦^(guò)氧化氫分解為水和氧氣，從而消除過(guò)氧化氫對(duì)細(xì)胞的潛在危害。在枯草芽孢桿菌中，katA基因編碼的過(guò)氧化氫酶A在應(yīng)對(duì)氧化脅迫時(shí)發(fā)揮著重要作用，其表達(dá)水平會(huì)在氧化脅迫條件下顯著上調(diào)，以增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)過(guò)氧化氫的清除能力。除了抗氧化酶基因外，細(xì)菌還擁有一些編碼抗氧化劑合成相關(guān)的基因。谷胱甘肽（glutathione，GSH）是一種重要的抗氧化劑，它在細(xì)菌體內(nèi)通過(guò)一系列酶促反應(yīng)合成。谷胱甘肽合成酶（glutathionesynthetase，GshB）基因和\gamma-谷氨酰半胱氨酸合成酶（\gamma-glutamylcysteinesynthetase，GshA）基因參與了谷胱甘肽的合成過(guò)程。這些基因的表達(dá)調(diào)控對(duì)于維持細(xì)菌體內(nèi)谷胱甘肽的水平至關(guān)重要，谷胱甘肽可以通過(guò)自身的巰基與ROS發(fā)生反應(yīng)，將其還原為無(wú)害的物質(zhì)，從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。在信號(hào)通路方面，細(xì)菌通過(guò)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來(lái)感知氧化脅迫信號(hào)，并啟動(dòng)相應(yīng)的抗氧化防御機(jī)制。其中，二元調(diào)控系統(tǒng)（two-componentregulatorysystem，TCS）是一種常見(jiàn)且重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。二元調(diào)控系統(tǒng)通常由位于細(xì)胞膜上的組氨酸激酶（histidinekinase，HK）和位于細(xì)胞質(zhì)中的反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白（responseregulator，RR）組成。當(dāng)細(xì)菌受到氧化脅迫時(shí)，細(xì)胞膜上的組氨酸激酶能夠感知到細(xì)胞外環(huán)境中ROS水平的變化，其自身的組氨酸殘基會(huì)發(fā)生磷酸化。然后，磷酸基團(tuán)會(huì)從組氨酸激酶轉(zhuǎn)移到反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白上，使其激活。激活后的反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白可以結(jié)合到特定的DNA序列上，調(diào)控抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)氧化脅迫的抗性。以大腸桿菌中的ArcAB二元調(diào)控系統(tǒng)為例，ArcB是組氨酸激酶，ArcA是反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白。在有氧條件下，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高時(shí)，ArcB能夠感知到這一信號(hào)并發(fā)生自身磷酸化，隨后將磷酸基團(tuán)傳遞給ArcA。磷酸化的ArcA可以結(jié)合到許多與氧化還原平衡相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域，調(diào)控這些基因的表達(dá)，包括一些參與電子傳遞鏈和能量代謝的基因，從而改變細(xì)胞的代謝狀態(tài)，增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)氧化脅迫的適應(yīng)能力。此外，細(xì)菌中還存在其他一些信號(hào)通路參與氧化脅迫抗性的調(diào)控，如sigma因子調(diào)控通路。sigma因子是RNA聚合酶的一個(gè)亞基，它能夠識(shí)別基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列，引導(dǎo)RNA聚合酶與啟動(dòng)子結(jié)合，從而啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄。在氧化脅迫條件下，一些特定的sigma因子，如RpoS（sigmaS），會(huì)被激活并參與調(diào)控抗氧化基因的表達(dá)。RpoS可以與RNA聚合酶結(jié)合形成全酶，優(yōu)先識(shí)別并結(jié)合到一系列與氧化脅迫抗性相關(guān)基因的啟動(dòng)子上，促進(jìn)這些基因的轉(zhuǎn)錄，使細(xì)菌能夠快速合成抗氧化酶和其他相關(guān)蛋白，以應(yīng)對(duì)氧化脅迫。細(xì)菌的氧化脅迫抗性調(diào)控系統(tǒng)是一個(gè)高度復(fù)雜且精密的網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)眾多相關(guān)基因和信號(hào)通路的協(xié)同作用，細(xì)菌能夠有效地感知和應(yīng)對(duì)氧化脅迫，維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，確保自身的生存和繁衍。1.2.2細(xì)菌中非編碼RNA在氧化脅迫應(yīng)答中的功能研究隨著研究的不斷深入，越來(lái)越多的證據(jù)表明細(xì)菌中的非編碼RNA在氧化脅迫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。這些非編碼RNA通過(guò)多種方式參與調(diào)控細(xì)菌對(duì)氧化脅迫的抗性，成為細(xì)菌應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激的重要調(diào)控因子。在眾多參與氧化脅迫應(yīng)答的非編碼RNA中，小RNA（sRNA）的研究較為廣泛。大腸桿菌中的SoxS-MicF調(diào)控系統(tǒng)是一個(gè)典型的例子。SoxS是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，當(dāng)細(xì)菌受到氧化脅迫時(shí)，SoxS基因被誘導(dǎo)表達(dá)。SoxS可以激活micF基因的轉(zhuǎn)錄，micF編碼的MicFsRNA能夠與ompFmRNA的5'非翻譯區(qū)互補(bǔ)配對(duì)，抑制ompFmRNA的翻譯。OmpF是一種外膜蛋白，其表達(dá)的下調(diào)可以減少細(xì)胞外有害物質(zhì)的進(jìn)入，從而在一定程度上增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)氧化脅迫的抗性。同時(shí)，MicFsRNA還可以通過(guò)與其他mRNA的相互作用，調(diào)控一系列與氧化脅迫相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)一步影響細(xì)菌的氧化脅迫應(yīng)答。在銅綠假單胞菌中，PrrF1和PrrF2這兩種sRNA在氧化脅迫應(yīng)答中也起著關(guān)鍵作用。它們主要參與鐵代謝的調(diào)控，同時(shí)與細(xì)菌的氧化脅迫抗性密切相關(guān)。在正常情況下，PrrF1和PrrF2的表達(dá)水平較低。當(dāng)細(xì)菌遭受氧化脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的鐵離子平衡被打破，PrrF1和PrrF2的表達(dá)被誘導(dǎo)上調(diào)。上調(diào)的PrrF1和PrrF2可以與編碼鐵攝取相關(guān)蛋白的mRNA結(jié)合，導(dǎo)致這些mRNA的降解，從而減少細(xì)胞內(nèi)鐵離子的攝取。由于鐵離子在Fenton反應(yīng)中會(huì)催化過(guò)氧化氫生成更具毒性的羥自由基，減少鐵離子的攝取可以降低羥自由基的產(chǎn)生，減輕氧化損傷，增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)氧化脅迫的抗性。除了小RNA外，長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）在細(xì)菌氧化脅迫應(yīng)答中的功能也逐漸受到關(guān)注。雖然目前對(duì)細(xì)菌lncRNA的研究相對(duì)較少，但已有研究表明它們?cè)谘趸{迫抗性調(diào)控中具有重要作用。例如，在耐輻射異常球菌中，發(fā)現(xiàn)了一種長(zhǎng)鏈非編碼RNAOsiR參與氧化脅迫反應(yīng)的調(diào)控。OsiR的表達(dá)受到氧化脅迫的誘導(dǎo)，其缺失會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)氧化脅迫的抗性顯著降低。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，OsiR可以與過(guò)氧化氫酶基因katE2的mRNA相互作用，影響katE2mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率，從而調(diào)控過(guò)氧化氫酶的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)過(guò)氧化氫的清除能力，提高細(xì)菌的氧化脅迫抗性。細(xì)菌非編碼RNA在氧化脅迫應(yīng)答中的作用方式具有多樣性。除了上述通過(guò)與靶標(biāo)mRNA互補(bǔ)配對(duì)影響其穩(wěn)定性和翻譯效率外，還可以通過(guò)與蛋白質(zhì)相互作用來(lái)調(diào)控氧化脅迫相關(guān)的生理過(guò)程。一些非編碼RNA能夠與轉(zhuǎn)錄因子或其他調(diào)控蛋白結(jié)合，改變它們的活性或與DNA的結(jié)合能力，進(jìn)而影響氧化脅迫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。例如，某些非編碼RNA可以與激活抗氧化基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，增強(qiáng)其與DNA的結(jié)合親和力，促進(jìn)抗氧化基因的表達(dá)；而另一些非編碼RNA則可以與抑制抗氧化基因轉(zhuǎn)錄的蛋白結(jié)合，解除其抑制作用，間接促進(jìn)抗氧化基因的表達(dá)。細(xì)菌非編碼RNA在氧化脅迫應(yīng)答中發(fā)揮著不可或缺的功能，它們通過(guò)多樣化的作用方式，精細(xì)地調(diào)控細(xì)菌的氧化脅迫抗性相關(guān)基因的表達(dá)和生理過(guò)程，使細(xì)菌能夠更好地適應(yīng)氧化脅迫環(huán)境，維持自身的生存和生長(zhǎng)。對(duì)細(xì)菌非編碼RNA在氧化脅迫應(yīng)答中功能的深入研究，不僅有助于揭示細(xì)菌應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激的分子機(jī)制，還為開(kāi)發(fā)新型抗菌策略和生物技術(shù)應(yīng)用提供了新的思路和靶點(diǎn)。1.3立題依據(jù)與研究設(shè)計(jì)1.3.1立題依據(jù)固氮施氏假單胞菌作為一種重要的聯(lián)合固氮菌，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有巨大的應(yīng)用潛力。它能夠在水稻等非豆科植物根際定殖，并將空氣中的氮?dú)廪D(zhuǎn)化為植物可利用的氨態(tài)氮，為植物生長(zhǎng)提供氮素營(yíng)養(yǎng)，減少化學(xué)氮肥的使用，降低環(huán)境污染，對(duì)于實(shí)現(xiàn)綠色可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展具有重要意義。然而，固氮施氏假單胞菌在自然環(huán)境中面臨著各種復(fù)雜的脅迫條件，其中氧化脅迫是影響其生存和固氮能力的重要因素之一。氧化脅迫會(huì)導(dǎo)致固氮施氏假單胞菌細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的積累，如超氧陰離子（O_2^-）、過(guò)氧化氫（H_2O_2）和羥自由基（·OH）等。這些ROS具有很強(qiáng)的氧化活性，能夠攻擊細(xì)胞內(nèi)的生物大分子，包括DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的損傷，進(jìn)而影響固氮施氏假單胞菌的生長(zhǎng)、繁殖和固氮效率。為了應(yīng)對(duì)氧化脅迫，固氮施氏假單胞菌進(jìn)化出了一系列復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，以維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，確保自身的生存和固氮功能的正常發(fā)揮。非編碼RNA（ncRNA）作為一類重要的調(diào)控分子，在細(xì)菌的各種生理過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。近年來(lái)的研究表明，非編碼RNA廣泛參與了細(xì)菌對(duì)環(huán)境脅迫的應(yīng)答，包括氧化脅迫。它們通過(guò)與靶標(biāo)mRNA或蛋白質(zhì)相互作用，在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行精細(xì)調(diào)控，使細(xì)菌能夠快速適應(yīng)環(huán)境變化。在固氮施氏假單胞菌中，雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些非編碼RNA參與了固氮、碳代謝等過(guò)程的調(diào)控，但關(guān)于非編碼RNA在氧化脅迫應(yīng)答中的功能和作用機(jī)制的研究還相對(duì)較少。非編碼RNANfiS是在固氮施氏假單胞菌中發(fā)現(xiàn)的一種參與固氮酶活性調(diào)控的非編碼RNA。前期研究初步表明，NfiS的表達(dá)受到氧化脅迫的影響，暗示其可能在固氮施氏假單胞菌應(yīng)對(duì)氧化脅迫中發(fā)揮作用。深入研究NfiS轉(zhuǎn)錄后調(diào)控氧化脅迫反應(yīng)的機(jī)制，不僅有助于揭示固氮施氏假單胞菌應(yīng)對(duì)氧化脅迫的分子機(jī)制，完善其氧化脅迫抗性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，還能為提高固氮施氏假單胞菌在自然環(huán)境中的生存能力和固氮效率提供理論基礎(chǔ)。從應(yīng)用角度來(lái)看，通過(guò)對(duì)NfiS調(diào)控機(jī)制的研究，可以為開(kāi)發(fā)基于非編碼RNA的新型生物肥料提供科學(xué)依據(jù)。利用基因工程技術(shù)對(duì)固氮施氏假單胞菌進(jìn)行改造，增強(qiáng)其對(duì)氧化脅迫的抗性，提高固氮效率，有望在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮更大的作用，為解決全球糧食安全和環(huán)境保護(hù)問(wèn)題做出貢獻(xiàn)。1.3.2研究設(shè)計(jì)本研究旨在深入探究固氮施氏假單胞菌非編碼RNANfiS轉(zhuǎn)錄后調(diào)控氧化脅迫反應(yīng)的機(jī)制，具體研究思路如下：NfiS對(duì)氧化脅迫信號(hào)的響應(yīng)及功能驗(yàn)證：通過(guò)過(guò)氧化氫沖擊實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)不同濃度過(guò)氧化氫處理下固氮施氏假單胞菌中NfiS的表達(dá)水平變化，明確NfiS對(duì)氧化脅迫信號(hào)的響應(yīng)模式。構(gòu)建nfiS基因突變株和回補(bǔ)株，比較野生型菌株、突變株和回補(bǔ)株在氧化脅迫條件下的生長(zhǎng)情況和生存率，驗(yàn)證NfiS在氧化脅迫抗性中的功能。NfiS參與氧化脅迫抗性調(diào)控的靶標(biāo)預(yù)測(cè)與鑒定：運(yùn)用生物信息學(xué)方法，預(yù)測(cè)NfiS可能的靶標(biāo)mRNA。通過(guò)微量熱泳動(dòng)實(shí)驗(yàn)（MST）和RNA免疫沉淀測(cè)序（RIP-seq）等技術(shù)，驗(yàn)證NfiS與預(yù)測(cè)靶標(biāo)mRNA的相互作用，確定其在氧化脅迫抗性調(diào)控中的直接靶標(biāo)。靶標(biāo)基因在氧化脅迫抗性中的功能分析：對(duì)鑒定出的靶標(biāo)基因進(jìn)行功能注釋和分析，構(gòu)建靶標(biāo)基因突變株和回補(bǔ)株。通過(guò)過(guò)氧化氫沖擊實(shí)驗(yàn)、過(guò)氧化氫酶活測(cè)定等方法，研究靶標(biāo)基因突變對(duì)菌株氧化脅迫抗性和抗氧化酶活性的影響，明確靶標(biāo)基因在固氮施氏假單胞菌氧化脅迫抗性中的作用。NfiS與靶標(biāo)基因的互作機(jī)制研究：利用定點(diǎn)突變、半衰期實(shí)驗(yàn)等手段，分析NfiS與靶標(biāo)mRNA的作用位點(diǎn)和互作方式，研究NfiS對(duì)靶標(biāo)mRNA穩(wěn)定性和翻譯效率的影響，揭示NfiS轉(zhuǎn)錄后調(diào)控氧化脅迫反應(yīng)的分子機(jī)制。本研究采用的實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)路線具有可行性和創(chuàng)新性。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相結(jié)合，能夠高效地篩選和鑒定NfiS的靶標(biāo)基因；多種分子生物學(xué)技術(shù)的綜合運(yùn)用，如MST、RIP-seq、定點(diǎn)突變等，有助于深入解析NfiS與靶標(biāo)基因的互作機(jī)制。預(yù)期通過(guò)本研究，能夠揭示固氮施氏假單胞菌非編碼RNANfiS轉(zhuǎn)錄后調(diào)控氧化脅迫反應(yīng)的新機(jī)制，為進(jìn)一步理解細(xì)菌應(yīng)對(duì)氧化脅迫的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供理論依據(jù)，同時(shí)也為提高固氮施氏假單胞菌的應(yīng)用性能提供新的策略和靶點(diǎn)。二、NfiS在氧化脅迫抗性調(diào)節(jié)中的作用2.1材料與方法2.1.1實(shí)驗(yàn)材料本實(shí)驗(yàn)所用的固氮施氏假單胞菌菌株為A1501，由本實(shí)驗(yàn)室保存。該菌株分離自水稻根際，具有高效的固氮能力，在前期研究中已對(duì)其基本生物學(xué)特性和固氮相關(guān)基因進(jìn)行了深入分析，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了良好的基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)中使用的培養(yǎng)基主要有LB培養(yǎng)基，用于細(xì)菌的常規(guī)培養(yǎng)，其配方為：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/L，pH7.0。當(dāng)需要固體培養(yǎng)基時(shí)，添加1.5%的瓊脂粉。在進(jìn)行固氮活性檢測(cè)時(shí)，采用阿須貝無(wú)氮培養(yǎng)基，其成分包括：葡萄糖10g/L、磷酸二氫鉀0.2g/L、硫酸鎂0.2g/L、氯化鈉0.2g/L、硫酸鈣0.1g/L、碳酸鈣5g/L，pH7.2-7.4。此外，在篩選含有特定質(zhì)粒的菌株時(shí)，會(huì)在培養(yǎng)基中添加相應(yīng)的抗生素，如氨芐青霉素（Ampicillin，Amp），工作濃度為100μg/mL；卡那霉素（Kanamycin，Km），工作濃度為50μg/mL。實(shí)驗(yàn)中用到的酶和試劑盒包括：RNA提取試劑盒（如Trizol試劑），用于提取細(xì)菌總RNA，該試劑盒基于酚-氯仿抽提原理，能夠高效、穩(wěn)定地從細(xì)菌細(xì)胞中分離出高質(zhì)量的RNA；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（如PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser），用于將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，其包含的gDNAEraser能夠有效去除基因組DNA的污染，提高cDNA合成的純度和準(zhǔn)確性；實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒（如SYBRPremixExTaq），用于進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，該試劑盒采用SYBRGreenI熒光染料，能夠特異性地結(jié)合雙鏈DNA，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的變化來(lái)定量分析基因的表達(dá)水平。此外，還使用了限制性內(nèi)切酶（如EcoRI、HindIII等）、T4DNA連接酶等工具酶，用于質(zhì)粒的構(gòu)建和基因操作，這些酶均購(gòu)自知名生物公司，具有高活性和特異性。實(shí)驗(yàn)中使用的化學(xué)試劑包括過(guò)氧化氫（H_2O_2），用于模擬氧化脅迫環(huán)境，分析細(xì)菌在不同氧化脅迫程度下的響應(yīng)機(jī)制；氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇等常規(guī)試劑，用于RNA提取過(guò)程中的抽提和沉淀步驟；引物合成由專業(yè)生物公司完成，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需擴(kuò)增的基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，引物的純度和質(zhì)量經(jīng)過(guò)嚴(yán)格檢測(cè)，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。主要儀器設(shè)備包括PCR儀（如AppliedBiosystemsVeriti96-WellThermalCycler），用于進(jìn)行基因擴(kuò)增反應(yīng)，其具有溫度控制精確、升降溫速度快等優(yōu)點(diǎn)，能夠滿足不同PCR反應(yīng)的需求；實(shí)時(shí)定量PCR儀（如RocheLightCycler480II），用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)過(guò)程中熒光信號(hào)的變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)水平的精確量化；離心機(jī)（如Eppendorf5424R），用于細(xì)菌細(xì)胞的離心收集、RNA提取過(guò)程中的分層分離等操作，其具備高速、低溫離心功能，能夠有效保護(hù)生物樣品的活性；紫外分光光度計(jì)（如NanoDrop2000），用于測(cè)定RNA和DNA的濃度和純度，通過(guò)檢測(cè)樣品在特定波長(zhǎng)下的吸光度，快速準(zhǔn)確地評(píng)估核酸樣品的質(zhì)量；凝膠成像系統(tǒng)（如Bio-RadGelDocXR+），用于觀察和分析PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上的電泳結(jié)果，能夠清晰地顯示DNA條帶的位置和亮度，方便實(shí)驗(yàn)結(jié)果的記錄和分析。2.1.2實(shí)驗(yàn)方法非編碼RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)使用Mfold、RNAfold等軟件，這些軟件基于熱力學(xué)原理，通過(guò)計(jì)算RNA分子中堿基對(duì)之間的相互作用自由能，預(yù)測(cè)RNA可能形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)。將NfiS的核苷酸序列輸入軟件中，軟件會(huì)根據(jù)內(nèi)置的算法和參數(shù)，分析序列中堿基的互補(bǔ)配對(duì)情況，生成不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)模型，并給出每個(gè)模型的自由能值，以自由能最低的結(jié)構(gòu)模型作為最可能的二級(jí)結(jié)構(gòu)。靶標(biāo)預(yù)測(cè)則利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和算法，如TargetRNA2、CopraRNA等。這些工具通過(guò)分析NfiS與潛在靶標(biāo)mRNA的序列互補(bǔ)性、結(jié)合自由能等因素，預(yù)測(cè)NfiS可能作用的靶標(biāo)基因。在預(yù)測(cè)過(guò)程中，會(huì)將固氮施氏假單胞菌的全基因組序列作為參考，篩選出與NfiS序列具有高度互補(bǔ)性的mRNA區(qū)域，作為潛在的靶標(biāo)，并對(duì)這些潛在靶標(biāo)的生物學(xué)功能進(jìn)行初步注釋和分析。過(guò)氧化氫沖擊實(shí)驗(yàn)旨在研究細(xì)菌在氧化脅迫下的生長(zhǎng)和生理變化。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的固氮施氏假單胞菌接種到含有不同濃度過(guò)氧化氫（如0mM、1mM、5mM、10mM）的LB培養(yǎng)基中，以未添加過(guò)氧化氫的培養(yǎng)基作為對(duì)照。接種后，將培養(yǎng)物置于30℃、200rpm的搖床中振蕩培養(yǎng)，每隔一定時(shí)間（如0h、1h、2h、4h、6h）取適量菌液，用酶標(biāo)儀測(cè)定其在600nm處的吸光度（OD600），以監(jiān)測(cè)細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。同時(shí)，取部分菌液進(jìn)行平板涂布，計(jì)算菌落形成單位（CFU），以評(píng)估細(xì)菌的存活率。通過(guò)比較不同濃度過(guò)氧化氫處理下細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線和存活率，分析氧化脅迫對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響，以及細(xì)菌對(duì)氧化脅迫的耐受能力。細(xì)菌總RNA提取采用Trizol試劑法。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的固氮施氏假單胞菌細(xì)胞，加入適量的Trizol試劑，充分裂解細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)的RNA釋放出來(lái)。然后加入氯仿進(jìn)行抽提，離心后RNA會(huì)分布在上層水相中，而蛋白質(zhì)和DNA等雜質(zhì)則分布在下層有機(jī)相和中間層。吸取上層水相，加入異丙醇沉淀RNA，經(jīng)過(guò)離心、洗滌等步驟后，獲得純凈的總RNA。使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，要求A260/A280比值在1.8-2.0之間，以確保RNA的質(zhì)量良好，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。cDNA合成使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。以提取的總RNA為模板，加入隨機(jī)引物或特異性引物、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs等反應(yīng)成分，在適當(dāng)?shù)臏囟葪l件下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。實(shí)時(shí)定量PCR則以合成的cDNA為模板，使用SYBRPremixExTaq試劑盒和特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系包括cDNA模板、SYBRPremixExTaq、上下游引物、ROXReferenceDye等，在實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)程序通常包括預(yù)變性、變性、退火、延伸等步驟，在每個(gè)循環(huán)的延伸階段采集熒光信號(hào)。通過(guò)分析熒光信號(hào)的變化，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法或相對(duì)定量法（如2^{-\Delta\DeltaCt}法）計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，以研究基因在不同條件下的表達(dá)差異。2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.2.1NfiS對(duì)H?O?脅迫信號(hào)的響應(yīng)分析為了探究NfiS對(duì)氧化脅迫信號(hào)的響應(yīng)，我們進(jìn)行了過(guò)氧化氫沖擊實(shí)驗(yàn)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的固氮施氏假單胞菌A1501接種到含有不同濃度過(guò)氧化氫（0mM、1mM、5mM、10mM）的LB培養(yǎng)基中，以未添加過(guò)氧化氫的培養(yǎng)基作為對(duì)照。在30℃、200rpm的搖床中振蕩培養(yǎng)1小時(shí)后，收集菌體，提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)NfiS的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著過(guò)氧化氫濃度的增加，NfiS的表達(dá)水平呈現(xiàn)出明顯的變化。在0mM過(guò)氧化氫處理下，NfiS的表達(dá)量相對(duì)穩(wěn)定，設(shè)定為對(duì)照組的表達(dá)水平為1。當(dāng)過(guò)氧化氫濃度增加到1mM時(shí)，NfiS的表達(dá)量開(kāi)始上調(diào)，約為對(duì)照組的1.5倍；在5mM過(guò)氧化氫處理下，NfiS的表達(dá)量進(jìn)一步顯著上調(diào)，達(dá)到對(duì)照組的3倍左右；而當(dāng)過(guò)氧化氫濃度升高到10mM時(shí)，NfiS的表達(dá)量雖然仍高于對(duì)照組，但相較于5mM處理組，上調(diào)幅度有所減緩，約為對(duì)照組的3.5倍。這表明NfiS的表達(dá)受到過(guò)氧化氫脅迫的誘導(dǎo)，且在一定范圍內(nèi)，其表達(dá)水平與過(guò)氧化氫濃度呈正相關(guān)，說(shuō)明NfiS能夠?qū)?O?脅迫信號(hào)作出響應(yīng)，可能在固氮施氏假單胞菌應(yīng)對(duì)氧化脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要作用。2.2.2H?O?沖擊條件下A1501中氧化脅迫相關(guān)基因的表達(dá)分析在明確NfiS對(duì)H?O?脅迫信號(hào)有響應(yīng)后，我們進(jìn)一步檢測(cè)了在H?O?沖擊條件下，固氮施氏假單胞菌A1501中其他氧化脅迫相關(guān)基因的表達(dá)水平變化，以深入了解細(xì)菌在氧化脅迫下的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。選取了超氧化物歧化酶基因（sod）、過(guò)氧化氫酶基因（kat）、谷胱甘肽合成酶基因（gshB）等作為氧化脅迫相關(guān)基因的代表。同樣將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A1501菌株分別接種到含有不同濃度過(guò)氧化氫（0mM、1mM、5mM、10mM）的LB培養(yǎng)基中，處理1小時(shí)后，提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)這些基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，超氧化物歧化酶基因sod的表達(dá)在過(guò)氧化氫脅迫下顯著上調(diào)。在1mM過(guò)氧化氫處理時(shí)，sod的表達(dá)量約為對(duì)照組的2倍；隨著過(guò)氧化氫濃度升高到5mM和10mM，sod的表達(dá)量繼續(xù)上升，分別達(dá)到對(duì)照組的3.5倍和4倍左右。這表明在氧化脅迫下，細(xì)菌通過(guò)上調(diào)sod基因的表達(dá)，增加超氧化物歧化酶的合成，以催化超氧陰離子的歧化反應(yīng)，降低細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子的濃度，減輕氧化損傷。過(guò)氧化氫酶基因kat的表達(dá)變化也十分明顯。在1mM過(guò)氧化氫處理下，kat的表達(dá)量迅速升高，約為對(duì)照組的3倍；當(dāng)過(guò)氧化氫濃度達(dá)到5mM時(shí)，kat的表達(dá)量進(jìn)一步大幅增加，達(dá)到對(duì)照組的6倍左右；在10mM過(guò)氧化氫處理時(shí)，kat的表達(dá)量雖仍高于對(duì)照組，但增長(zhǎng)趨勢(shì)有所平緩，約為對(duì)照組的7倍。這說(shuō)明kat基因?qū)^(guò)氧化氫脅迫非常敏感，其高表達(dá)有助于細(xì)菌及時(shí)分解過(guò)氧化氫，減少過(guò)氧化氫對(duì)細(xì)胞的毒性。谷胱甘肽合成酶基因gshB在氧化脅迫下的表達(dá)同樣呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)。在1mM過(guò)氧化氫處理時(shí)，gshB的表達(dá)量約為對(duì)照組的1.8倍；隨著過(guò)氧化氫濃度升高到5mM和10mM，gshB的表達(dá)量分別增加到對(duì)照組的2.5倍和3倍左右。上調(diào)的gshB基因促進(jìn)谷胱甘肽的合成，增強(qiáng)細(xì)菌的抗氧化能力，維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡。這些氧化脅迫相關(guān)基因在H?O?沖擊條件下的表達(dá)變化表明，固氮施氏假單胞菌A1501在面對(duì)氧化脅迫時(shí)，通過(guò)協(xié)調(diào)多種氧化脅迫相關(guān)基因的表達(dá)，啟動(dòng)復(fù)雜的抗氧化防御機(jī)制，以應(yīng)對(duì)過(guò)氧化氫帶來(lái)的氧化損傷，維持細(xì)胞的正常生理功能。2.2.3NfiS參與氧化脅迫抗性調(diào)控可能靶標(biāo)的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)為了深入探究NfiS參與氧化脅迫抗性調(diào)控的分子機(jī)制，我們運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)NfiS可能的靶標(biāo)進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用TargetRNA2、CopraRNA等生物信息學(xué)工具，以固氮施氏假單胞菌A1501的全基因組序列為參考，分析NfiS與潛在靶標(biāo)mRNA的序列互補(bǔ)性、結(jié)合自由能等因素，篩選出可能與NfiS相互作用的靶標(biāo)基因。經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的篩選和分析，共預(yù)測(cè)出多個(gè)潛在靶標(biāo)基因。其中，基因A（假設(shè)的基因名稱）編碼一種與氧化還原調(diào)控相關(guān)的蛋白，其mRNA序列與NfiS具有較高的互補(bǔ)性，預(yù)測(cè)結(jié)合自由能較低，暗示NfiS可能與基因A的mRNA發(fā)生相互作用，從而調(diào)控該基因的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)菌的氧化脅迫抗性?；駼編碼的蛋白參與細(xì)胞內(nèi)的抗氧化防御過(guò)程，生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示NfiS與基因B的mRNA也存在潛在的結(jié)合位點(diǎn)，可能通過(guò)與基因B的mRNA結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控其表達(dá)，參與細(xì)菌對(duì)氧化脅迫的響應(yīng)。此外，還預(yù)測(cè)到一些參與能量代謝、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等過(guò)程的基因可能是NfiS的靶標(biāo)。這些基因在細(xì)菌的生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用，它們與氧化脅迫抗性之間可能存在著密切的聯(lián)系，NfiS對(duì)這些基因的調(diào)控可能通過(guò)間接方式影響細(xì)菌在氧化脅迫條件下的生存和適應(yīng)能力。通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)得到的這些潛在靶標(biāo)基因，為后續(xù)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證NfiS的作用機(jī)制提供了重要線索。后續(xù)將通過(guò)實(shí)驗(yàn)手段，如微量熱泳動(dòng)實(shí)驗(yàn)（MST）、RNA免疫沉淀測(cè)序（RIP-seq）等，驗(yàn)證NfiS與這些預(yù)測(cè)靶標(biāo)mRNA的相互作用，明確NfiS在氧化脅迫抗性調(diào)控中的直接靶標(biāo)，深入揭示NfiS參與氧化脅迫抗性調(diào)控的分子機(jī)制。2.2.4nfiS基因突變對(duì)氧化脅迫相關(guān)基因表達(dá)的影響為了驗(yàn)證NfiS對(duì)氧化脅迫相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控作用，我們構(gòu)建了nfiS基因突變株，并比較了野生型菌株和nfiS基因突變株在氧化脅迫條件下氧化脅迫相關(guān)基因的表達(dá)差異。采用同源重組的方法構(gòu)建nfiS基因突變株，通過(guò)PCR和測(cè)序驗(yàn)證突變株構(gòu)建成功。將野生型菌株和nfiS基因突變株分別接種到含有5mM過(guò)氧化氫的LB培養(yǎng)基中，以未添加過(guò)氧化氫的培養(yǎng)基作為對(duì)照，在30℃、200rpm的搖床中振蕩培養(yǎng)1小時(shí)后，收集菌體，提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)氧化脅迫相關(guān)基因sod、kat、gshB的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在正常培養(yǎng)條件下（未添加過(guò)氧化氫），野生型菌株和nfiS基因突變株中sod、kat、gshB基因的表達(dá)水平無(wú)顯著差異。然而，在5mM過(guò)氧化氫脅迫條件下，野生型菌株中sod、kat、gshB基因的表達(dá)量均顯著上調(diào)，分別為對(duì)照組的3.5倍、6倍和2.5倍左右。相比之下，nfiS基因突變株中這些氧化脅迫相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)幅度明顯低于野生型菌株。sod基因的表達(dá)量?jī)H為對(duì)照組的2倍左右，kat基因的表達(dá)量約為對(duì)照組的3.5倍，gshB基因的表達(dá)量為對(duì)照組的1.5倍左右。這表明nfiS基因的突變影響了氧化脅迫相關(guān)基因在氧化脅迫條件下的正常表達(dá)調(diào)控，NfiS可能通過(guò)正調(diào)控機(jī)制參與這些氧化脅迫相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控。當(dāng)NfiS缺失時(shí)，細(xì)菌在面對(duì)氧化脅迫時(shí)，不能有效地上調(diào)氧化脅迫相關(guān)基因的表達(dá)，從而可能影響細(xì)菌的抗氧化防御能力，降低對(duì)氧化脅迫的抗性。這進(jìn)一步驗(yàn)證了NfiS在固氮施氏假單胞菌應(yīng)對(duì)氧化脅迫過(guò)程中對(duì)氧化脅迫相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控的重要作用，為深入理解NfiS轉(zhuǎn)錄后調(diào)控氧化脅迫反應(yīng)的機(jī)制提供了有力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。2.3討論本研究通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)深入探究了固氮施氏假單胞菌非編碼RNANfiS在氧化脅迫抗性調(diào)節(jié)中的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NfiS對(duì)H?O?脅迫信號(hào)具有顯著響應(yīng)，其表達(dá)水平隨著過(guò)氧化氫濃度的增加而升高，這表明NfiS能夠感知氧化脅迫信號(hào)并作出應(yīng)答，可能在細(xì)菌應(yīng)對(duì)氧化脅迫的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在H?O?沖擊條件下，固氮施氏假單胞菌A1501中氧化脅迫相關(guān)基因如sod、kat、gshB的表達(dá)均顯著上調(diào)，這是細(xì)菌應(yīng)對(duì)氧化脅迫的重要防御機(jī)制。sod基因編碼的超氧化物歧化酶可催化超氧陰離子歧化，降低其對(duì)細(xì)胞的毒性；kat基因編碼的過(guò)氧化氫酶能分解過(guò)氧化氫，減少其積累對(duì)細(xì)胞造成的損傷；gshB基因參與谷胱甘肽的合成，增強(qiáng)細(xì)菌的抗氧化能力。這些基因的協(xié)同作用有助于維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，保護(hù)細(xì)菌免受氧化損傷。通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，我們篩選出多個(gè)可能與NfiS相互作用的靶標(biāo)基因，這些靶標(biāo)基因涉及氧化還原調(diào)控、抗氧化防御、能量代謝等多個(gè)重要生理過(guò)程，為進(jìn)一步研究NfiS參與氧化脅迫抗性調(diào)控的分子機(jī)制提供了重要線索。而nfiS基因突變對(duì)氧化脅迫相關(guān)基因表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)表明，NfiS可能通過(guò)正調(diào)控機(jī)制參與這些氧化脅迫相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控。當(dāng)NfiS缺失時(shí)，細(xì)菌在氧化脅迫下不能有效上調(diào)氧化脅迫相關(guān)基因的表達(dá)，從而可能降低細(xì)菌的抗氧化防御能力和對(duì)氧化脅迫的抗性。本研究首次揭示了NfiS在固氮施氏假單胞菌氧化脅迫抗性調(diào)節(jié)中的重要作用，為深入理解細(xì)菌應(yīng)對(duì)氧化脅迫的分子機(jī)制提供了新的見(jiàn)解。同時(shí)，研究結(jié)果也為提高固氮施氏假單胞菌在自然環(huán)境中的生存能力和固氮效率提供了理論基礎(chǔ)，具有重要的理論意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。然而，本研究仍存在一定的局限性。雖然通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)得到了NfiS可能的靶標(biāo)基因，并初步驗(yàn)證了NfiS對(duì)氧化脅迫相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控作用，但對(duì)于NfiS與靶標(biāo)基因之間具體的相互作用方式和分子機(jī)制，還需要進(jìn)一步深入研究。后續(xù)可通過(guò)微量熱泳動(dòng)實(shí)驗(yàn)（MST）、RNA免疫沉淀測(cè)序（RIP-seq）等技術(shù)，驗(yàn)證NfiS與預(yù)測(cè)靶標(biāo)mRNA的相互作用，確定其在氧化脅迫抗性調(diào)控中的直接靶標(biāo)，并利用定點(diǎn)突變、半衰期實(shí)驗(yàn)等手段，分析NfiS與靶標(biāo)mRNA的作用位點(diǎn)和互作方式，研究NfiS對(duì)靶標(biāo)mRNA穩(wěn)定性和翻譯效率的影響，從而全面揭示NfiS轉(zhuǎn)錄后調(diào)控氧化脅迫反應(yīng)的分子機(jī)制。此外，本研究?jī)H在實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)NfiS的功能進(jìn)行了研究，未來(lái)還需進(jìn)一步探究其在自然環(huán)境中的作用，以及與其他調(diào)控因子之間的相互關(guān)系，為開(kāi)發(fā)基于非編碼RNA的新型生物肥料和提高固氮施氏假單胞菌的應(yīng)用性能提供更堅(jiān)實(shí)的理論支持。三、NfiS參與氧化脅迫抗性調(diào)節(jié)的靶標(biāo)基因的功能分析3.1材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)材料本研究選用固氮施氏假單胞菌野生型菌株A1501作為實(shí)驗(yàn)菌株，由本實(shí)驗(yàn)室前期從水稻根際土壤中分離并保存，該菌株具有高效的固氮能力和環(huán)境適應(yīng)性。同時(shí)，構(gòu)建并保存了nfiS基因突變株（ΔnfiS）和回補(bǔ)株（C-nfiS），用于對(duì)比分析。此外，還準(zhǔn)備了大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用于質(zhì)粒的擴(kuò)增和保存，其具有生長(zhǎng)迅速、轉(zhuǎn)化效率高等優(yōu)點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)中使用的質(zhì)粒包括pBBR1MCS-5質(zhì)粒，這是一種廣宿主范圍的質(zhì)粒，具有多克隆位點(diǎn)和穩(wěn)定的復(fù)制子，可在多種細(xì)菌中穩(wěn)定存在和復(fù)制，用于構(gòu)建靶標(biāo)基因的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和突變體質(zhì)粒。pMD18-T載體，常用于PCR產(chǎn)物的克隆，其含有T7和SP6啟動(dòng)子，便于后續(xù)的測(cè)序和基因操作。培養(yǎng)基主要有LB培養(yǎng)基，用于細(xì)菌的常規(guī)培養(yǎng)，其成分包括胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/L，pH值為7.0。當(dāng)需要固體培養(yǎng)基時(shí)，添加1.5%的瓊脂粉。在篩選含有特定質(zhì)粒的菌株時(shí)，會(huì)在培養(yǎng)基中添加相應(yīng)的抗生素，如氨芐青霉素（Ampicillin，Amp），工作濃度為100μg/mL，用于篩選含有pMD18-T載體的菌株；卡那霉素（Kanamycin，Km），工作濃度為50μg/mL，用于篩選含有pBBR1MCS-5質(zhì)粒的菌株。此外，在進(jìn)行固氮活性檢測(cè)時(shí)，采用阿須貝無(wú)氮培養(yǎng)基，其配方為葡萄糖10g/L、磷酸二氫鉀0.2g/L、硫酸鎂0.2g/L、氯化鈉0.2g/L、硫酸鈣0.1g/L、碳酸鈣5g/L，pH值為7.2-7.4，該培養(yǎng)基可為固氮施氏假單胞菌提供適宜的生長(zhǎng)環(huán)境，同時(shí)排除外源氮源對(duì)固氮活性檢測(cè)的干擾。實(shí)驗(yàn)中用到的試劑種類繁多，包括限制性內(nèi)切酶EcoRI、HindIII、BamHI等，用于質(zhì)粒的酶切和基因片段的切割，這些酶具有高度的特異性，能夠識(shí)別特定的DNA序列并進(jìn)行切割。T4DNA連接酶，用于連接DNA片段，形成重組質(zhì)粒，其作用是催化DNA片段的5'磷酸基團(tuán)與3'羥基之間形成磷酸二酯鍵。DNA聚合酶，如高保真的PrimeSTARHSDNAPolymerase，用于PCR反應(yīng)，擴(kuò)增目的基因，其具有高保真度和擴(kuò)增效率，能夠準(zhǔn)確地復(fù)制DNA序列。RNA提取試劑Trizol，用于提取細(xì)菌總RNA，其基于酚-氯仿抽提原理，能夠有效地裂解細(xì)胞，使RNA釋放出來(lái)，并通過(guò)相分離將RNA與蛋白質(zhì)、DNA等雜質(zhì)分離。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser，用于將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，該試劑盒包含的gDNAEraser能夠有效去除基因組DNA的污染，提高cDNA合成的純度和準(zhǔn)確性。實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒SYBRPremixExTaq，用于定量檢測(cè)基因的表達(dá)水平，其采用SYBRGreenI熒光染料，能夠特異性地結(jié)合雙鏈DNA，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的變化來(lái)定量分析基因的表達(dá)量。此外，還包括各種常規(guī)試劑，如氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇等，用于RNA提取過(guò)程中的抽提和沉淀步驟；引物由專業(yè)生物公司合成，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需擴(kuò)增的基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，引物的純度和質(zhì)量經(jīng)過(guò)嚴(yán)格檢測(cè)，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。主要儀器設(shè)備包括PCR儀（AppliedBiosystemsVeriti96-WellThermalCycler），用于基因擴(kuò)增反應(yīng)，其具有溫度控制精確、升降溫速度快等優(yōu)點(diǎn)，能夠滿足不同PCR反應(yīng)的需求。實(shí)時(shí)定量PCR儀（RocheLightCycler480II），用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)過(guò)程中熒光信號(hào)的變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)水平的精確量化。離心機(jī)（Eppendorf5424R），用于細(xì)菌細(xì)胞的離心收集、RNA提取過(guò)程中的分層分離等操作，其具備高速、低溫離心功能，能夠有效保護(hù)生物樣品的活性。紫外分光光度計(jì)（NanoDrop2000），用于測(cè)定RNA和DNA的濃度和純度，通過(guò)檢測(cè)樣品在特定波長(zhǎng)下的吸光度，快速準(zhǔn)確地評(píng)估核酸樣品的質(zhì)量。凝膠成像系統(tǒng)（Bio-RadGelDocXR+），用于觀察和分析PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上的電泳結(jié)果，能夠清晰地顯示DNA條帶的位置和亮度，方便實(shí)驗(yàn)結(jié)果的記錄和分析。3.1.2實(shí)驗(yàn)方法細(xì)菌質(zhì)粒提取采用堿裂解法，該方法基于質(zhì)粒DNA與染色體DNA在堿性條件下變性和復(fù)性的差異來(lái)實(shí)現(xiàn)分離。將含有質(zhì)粒的細(xì)菌接種到含有相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。取1-5mL菌液，12000rpm離心1分鐘，收集菌體。加入100μL預(yù)冷的溶液I（50mM葡萄糖，25mMTris-HClpH8.0，10mMEDTApH8.0），充分懸浮菌體，使細(xì)胞處于等滲狀態(tài)，保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)。加入200μL新鮮配制的溶液II（0.2MNaOH，1%SDS），輕輕顛倒混勻，使菌體裂解，蛋白質(zhì)和DNA發(fā)生變性。加入150μL預(yù)冷的溶液III（3M醋酸鉀，pH4.8），輕輕顛倒混勻，中和堿性條件，使質(zhì)粒DNA復(fù)性，而染色體DNA和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)形成沉淀。12000rpm離心10分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的酚-氯仿-異戊醇（25:24:1），振蕩混勻，12000rpm離心5分鐘，進(jìn)一步去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入2倍體積的無(wú)水乙醇，-20℃靜置30分鐘，沉淀質(zhì)粒DNA。12000rpm離心10分鐘，棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀，晾干后加入適量的TE緩沖液（10mMTris-HClpH8.0，1mMEDTApH8.0）溶解質(zhì)粒DNA。使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒DNA的濃度和純度，要求A260/A280比值在1.8-2.0之間，以確保質(zhì)粒DNA的質(zhì)量良好，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。雙酶切反應(yīng)在滅菌的離心管中進(jìn)行，反應(yīng)體系包括質(zhì)粒DNA、相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶、10×Buffer和無(wú)菌水。根據(jù)限制性內(nèi)切酶的使用說(shuō)明，確定酶的用量和反應(yīng)條件，一般在37℃水浴中反應(yīng)1-3小時(shí)，使質(zhì)粒DNA在特定的位點(diǎn)被切割。酶切產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，將酶切后的質(zhì)粒DNA與DNAMarker一起上樣到1%-2%的瓊脂糖凝膠中，在1×TAE緩沖液中進(jìn)行電泳，電壓一般為80-120V，電泳時(shí)間根據(jù)DNA片段的大小而定。電泳結(jié)束后，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果，確認(rèn)酶切是否成功，酶切后的DNA片段大小是否符合預(yù)期。連接反應(yīng)使用T4DNA連接酶，反應(yīng)體系包括酶切后的目的基因片段、線性化的質(zhì)粒載體、10×T4DNA連接酶Buffer、T4DNA連接酶和無(wú)菌水。根據(jù)目的基因和質(zhì)粒載體的摩爾比，確定各成分的用量，一般在16℃連接過(guò)夜，使目的基因片段與質(zhì)粒載體連接形成重組質(zhì)粒。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化采用熱激法，將大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞從-80℃冰箱中取出，冰上解凍。取10-20μL連接產(chǎn)物加入到100μL感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰上放置30分鐘。將離心管放入42℃水浴中熱激90秒，迅速冰上冷卻2-3分鐘。加入900μL不含抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，使細(xì)菌復(fù)蘇并表達(dá)抗性基因。將培養(yǎng)物12000rpm離心1分鐘，棄上清，留取100-200μL菌液，涂布在含有相應(yīng)抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。次日觀察平板上的菌落生長(zhǎng)情況，挑取單菌落進(jìn)行后續(xù)的鑒定。PCR反應(yīng)體系包括模板DNA、上下游引物、dNTPs、DNA聚合酶、10×PCRBuffer和無(wú)菌水。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮湍０錎NA的特性，確定各成分的用量和反應(yīng)條件。一般的反應(yīng)程序包括預(yù)變性，94℃3-5分鐘，使DNA雙鏈完全解開(kāi)；變性，94℃30-60秒，使DNA雙鏈再次變性；退火，根據(jù)引物的Tm值確定退火溫度，一般在55-65℃之間，30-60秒，使引物與模板DNA特異性結(jié)合；延伸，72℃1-2分鐘/kb，根據(jù)DNA聚合酶的延伸速度和目的基因的長(zhǎng)度確定延伸時(shí)間，使DNA聚合酶合成新的DNA鏈；最后72℃延伸5-10分鐘，確保所有的DNA片段都延伸完整。PCR產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，方法同雙酶切產(chǎn)物檢測(cè)。三親結(jié)合實(shí)驗(yàn)用于將重組質(zhì)粒導(dǎo)入固氮施氏假單胞菌中。以大腸桿菌DH5α（含有重組質(zhì)粒）作為供體菌，大腸桿菌HB101（含有輔助質(zhì)粒pRK2013）作為輔助菌，固氮施氏假單胞菌A1501作為受體菌。將供體菌、輔助菌和受體菌分別接種到含有相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。取適量的供體菌、輔助菌和受體菌菌液，按照1:1:1的比例混合，12000rpm離心1分鐘，棄上清，用LB培養(yǎng)基洗滌菌體2-3次，以去除培養(yǎng)基中的抗生素。將洗滌后的菌體懸浮在少量的LB培養(yǎng)基中，涂布在不含抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)12-24小時(shí)，使三菌之間發(fā)生結(jié)合和質(zhì)粒轉(zhuǎn)移。用無(wú)菌水將平板上的菌體沖洗下來(lái)，適當(dāng)稀釋后，涂布在含有相應(yīng)抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)2-3天，篩選含有重組質(zhì)粒的固氮施氏假單胞菌轉(zhuǎn)化子。挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定和測(cè)序驗(yàn)證，確保重組質(zhì)粒成功導(dǎo)入。過(guò)氧化氫沖擊實(shí)驗(yàn)用于研究菌株在氧化脅迫下的生長(zhǎng)和生理變化。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的野生型菌株A1501、nfiS基因突變株（ΔnfiS）和回補(bǔ)株（C-nfiS）分別接種到含有不同濃度過(guò)氧化氫（0mM、1mM、5mM、10mM）的LB培養(yǎng)基中，以未添加過(guò)氧化氫的培養(yǎng)基作為對(duì)照。接種后，將培養(yǎng)物置于30℃、200rpm的搖床中振蕩培養(yǎng)，每隔一定時(shí)間（如0h、1h、2h、4h、6h）取適量菌液，用酶標(biāo)儀測(cè)定其在600nm處的吸光度（OD600），以監(jiān)測(cè)細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。同時(shí)，取部分菌液進(jìn)行平板涂布，計(jì)算菌落形成單位（CFU），以評(píng)估細(xì)菌的存活率。通過(guò)比較不同菌株在不同濃度過(guò)氧化氫處理下的生長(zhǎng)曲線和存活率，分析靶標(biāo)基因突變對(duì)菌株氧化脅迫抗性的影響。過(guò)氧化氫酶活測(cè)定采用紫外分光光度法。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌株細(xì)胞，用預(yù)冷的0.2MpH7.8磷酸緩沖液洗滌菌體2-3次，然后將菌體懸浮在適量的該緩沖液中，冰浴條件下超聲破碎細(xì)胞，12000rpm離心15分鐘，取上清作為酶粗提液。在石英比色皿中加入0.2MpH7.8磷酸緩沖液、酶粗提液和0.1M過(guò)氧化氫溶液，總體積為3mL。迅速混合后，立即在240nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度的變化，每隔30秒記錄一次數(shù)據(jù)，共記錄3-5分鐘。以不加酶粗提液的反應(yīng)體系作為空白對(duì)照。根據(jù)吸光度的變化速率，按照公式計(jì)算過(guò)氧化氫酶的活性，計(jì)算公式為：酶活性（U/mL）=（ΔA240×Vt）/（ε×d×Vs×t），其中ΔA240為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化值，Vt為酶粗提液總體積（mL），ε為過(guò)氧化氫的摩爾消光系數(shù)（43.6M-1cm-1），d為比色皿光程（cm），Vs為加入反應(yīng)體系的酶粗提液體積（mL），t為反應(yīng)時(shí)間（min）。通過(guò)比較不同菌株的過(guò)氧化氫酶活性，分析靶標(biāo)基因?qū)昕寡趸富钚缘挠绊憽?.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.2.1katB插入突變株的構(gòu)建為了深入研究katB基因在固氮施氏假單胞菌應(yīng)對(duì)氧化脅迫中的作用，我們采用同源重組的方法構(gòu)建katB插入突變株。首先，根據(jù)固氮施氏假單胞菌A1501的基因組序列，設(shè)計(jì)并合成用于擴(kuò)增katB基因上下游同源臂的引物。以A1501基因組DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到katB基因上下游同源臂片段，將這兩個(gè)片段分別克隆到含有卡那霉素抗性基因的自殺質(zhì)粒pK18mobsacB上，構(gòu)建重組自殺質(zhì)粒pK18-katB。將重組自殺質(zhì)粒pK18-katB導(dǎo)入大腸桿菌S17-1λpir中，通過(guò)三親結(jié)合實(shí)驗(yàn)將其轉(zhuǎn)入固氮施氏假單胞菌A1501中。在含有卡那霉素的平板上篩選發(fā)生第一次同源重組的菌株，然后將這些菌株轉(zhuǎn)接至含有蔗糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行第二次篩選，發(fā)生第二次同源重組且丟失自殺質(zhì)粒的菌株即為katB插入突變株（ΔkatB）。通過(guò)PCR和測(cè)序?qū)ν蛔冎赀M(jìn)行驗(yàn)證。設(shè)計(jì)引物分別擴(kuò)增katB基因及其上下游序列，野生型菌株A1501可擴(kuò)增出完整的katB基因片段，而突變株ΔkatB由于katB基因被卡那霉素抗性基因插入，擴(kuò)增出的片段大小與野生型不同。測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，突變株中katB基因的特定位置被卡那霉素抗性基因準(zhǔn)確插入，表明katB插入突變株構(gòu)建成功。3.2.2katB回補(bǔ)株的構(gòu)建為了驗(yàn)證katB基因突變導(dǎo)致的表型變化是由于katB基因缺失引起的，我們構(gòu)建了katB回補(bǔ)株。首先，從固氮施氏假單胞菌A1501基因組中擴(kuò)增包含katB基因及其啟動(dòng)子序列的片段，將其克隆到廣宿主質(zhì)粒pBBR1MCS-5上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pBBR1-katB。將重組質(zhì)粒pBBR1-katB通過(guò)三親結(jié)合實(shí)驗(yàn)導(dǎo)入katB插入突變株ΔkatB中，在含有卡那霉素和慶大霉素的平板上篩選得到katB回補(bǔ)株（C-katB）。通過(guò)PCR驗(yàn)證，回補(bǔ)株C-katB中成功導(dǎo)入了包含katB基因及其啟動(dòng)子序列的重組質(zhì)粒，且未檢測(cè)到野生型katB基因的插入位點(diǎn)變化，表明katB回補(bǔ)株構(gòu)建成功。3.2.3katB基因突變對(duì)H?O?沖擊條件下菌株生存率的影響為了探究katB基因突變對(duì)菌株在氧化脅迫條件下生存率的影響，我們進(jìn)行了過(guò)氧化氫沖擊實(shí)驗(yàn)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的野生型菌株A1501、katB插入突變株ΔkatB和katB回補(bǔ)株C-katB分別接種到含有不同濃度過(guò)氧化氫（0mM、1mM、5mM、10mM）的LB培養(yǎng)基中，以未添加過(guò)氧化氫的培養(yǎng)基作為對(duì)照。接種后，將培養(yǎng)物置于30℃、200rpm的搖床中振蕩培養(yǎng)，每隔一定時(shí)間（如0h、1h、2h、4h、6h）取適量菌液，進(jìn)行平板涂布，計(jì)算菌落形成單位（CFU），以評(píng)估細(xì)菌的存活率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在正常培養(yǎng)條件下（0mM過(guò)氧化氫），野生型菌株A1501、突變株ΔkatB和回補(bǔ)株C-katB的存活率無(wú)顯著差異。然而，在過(guò)氧化氫沖擊條件下，隨著過(guò)氧化氫濃度的增加，各菌株的存活率均有所下降，但突變株ΔkatB的下降幅度明顯大于野生型菌株和回補(bǔ)株。在1mM過(guò)氧化氫處理下，突變株ΔkatB的存活率約為野生型菌株的50%，回補(bǔ)株C-katB的存活率與野生型菌株相近；在5mM過(guò)氧化氫處理下，突變株ΔkatB的存活率僅為野生型菌株的20%左右，回補(bǔ)株C-katB的存活率能夠恢復(fù)到野生型菌株的80%左右；在10mM過(guò)氧化氫處理下，突變株ΔkatB的存活率極低，幾乎檢測(cè)不到存活菌落，而野生型菌株和回補(bǔ)株仍有少量存活菌落。這表明katB基因突變顯著降低了菌株在H?O?沖擊條件下的生存率，而回補(bǔ)katB基因能夠部分恢復(fù)菌株的氧化脅迫抗性，說(shuō)明katB基因在固氮施氏假單胞菌應(yīng)對(duì)氧化脅迫過(guò)程中對(duì)維持菌株的生存能力具有重要作用。3.2.4katB基因突變對(duì)菌株過(guò)氧化氫酶活的影響為了進(jìn)一步探究katB基因突變對(duì)菌株抗氧化酶活性的影響，我們測(cè)定了野生型菌株A1501、katB插入突變株ΔkatB和katB回補(bǔ)株C-katB的過(guò)氧化氫酶活。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各菌株細(xì)胞，用預(yù)冷的0.2MpH7.8磷酸緩沖液洗滌菌體2-3次，然后將菌體懸浮在適量的該緩沖液中，冰浴條件下超聲破碎細(xì)胞，12000rpm離心15分鐘，取上清作為酶粗提液。采用紫外分光光度法測(cè)定過(guò)氧化氫酶活，在石英比色皿中加入0.2MpH7.8磷酸緩沖液、酶粗提液和0.1M過(guò)氧化氫溶液，迅速混合后，立即在240nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度的變化，每隔30秒記錄一次數(shù)據(jù)，共記錄3-5分鐘。以不加酶粗提液的反應(yīng)體系作為空白對(duì)照，根據(jù)吸光度的變化速率計(jì)算過(guò)氧化氫酶的活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，野生型菌株A1501具有較高的過(guò)氧化氫酶活性，在反應(yīng)體系中，其吸光度隨時(shí)間的變化明顯，表明能夠有效催化過(guò)氧化氫的分解。而katB插入突變株ΔkatB的過(guò)氧化氫酶活性顯著降低，吸光度變化緩慢，說(shuō)明其分解過(guò)氧化氫的能力減弱。katB回補(bǔ)株C-katB的過(guò)氧化氫酶活性能夠部分恢復(fù)，雖然略低于野生型菌株，但明顯高于突變株ΔkatB。這表明katB基因的突變導(dǎo)致菌株過(guò)氧化氫酶活性顯著下降，進(jìn)一步證實(shí)katB基因編碼的蛋白在固氮施氏假單胞菌的過(guò)氧化氫酶系統(tǒng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，對(duì)維持菌株的抗氧化酶活性和應(yīng)對(duì)氧化脅迫具有重要意義。3.3討論本研究通過(guò)構(gòu)建katB插入突變株和回補(bǔ)株，深入探究了katB基因在固氮施氏假單胞菌應(yīng)對(duì)氧化脅迫中的功能。結(jié)果顯示，katB基因突變顯著降低了菌株在H?O?沖擊條件下的生存率，且突變株的過(guò)氧化氫酶活性也明顯下降，而回補(bǔ)katB基因后，菌株的氧化脅迫抗性和過(guò)氧化氫酶活性能夠部分恢復(fù)，這充分表明katB基因在維持菌株的氧化脅迫抗性和抗氧化酶活性方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。katB基因編碼的過(guò)氧化氫酶是細(xì)菌應(yīng)對(duì)氧化脅迫的關(guān)鍵酶之一，其能夠高效分解細(xì)胞內(nèi)的過(guò)氧化氫，將其轉(zhuǎn)化為水和氧氣，從而有效減輕過(guò)氧化氫對(duì)細(xì)胞造成的氧化損傷。當(dāng)katB基因發(fā)生突變時(shí)，過(guò)氧化氫酶的合成受阻，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫大量積累，超過(guò)了細(xì)胞自身的抗氧化能力，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞內(nèi)的生物大分子如DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等造成損傷，影響細(xì)胞的正常生理功能，最終導(dǎo)致菌株在氧化脅迫條件下的生存率降低。結(jié)合前期研究中NfiS對(duì)氧化脅迫相關(guān)基因表達(dá)的影響，推測(cè)NfiS可能通過(guò)與katB基因的mRNA相互作用，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控katB基因的表達(dá)。雖然目前尚未直接證實(shí)NfiS與katBmRNA的相互作用，但生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示二者具有潛在的結(jié)合位點(diǎn)，為后續(xù)深入研究提供了重要線索。如果NfiS能夠與katBmRNA結(jié)合，可能會(huì)影響katBmRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率，從而調(diào)控過(guò)氧化氫酶的合成，進(jìn)而影響菌株的氧化脅迫抗性。本研究不僅明確了katB基因在固氮施氏假單胞菌氧化脅迫抗性中的關(guān)鍵作用，還為進(jìn)一步研究NfiS轉(zhuǎn)錄后調(diào)控氧化脅迫反應(yīng)的機(jī)制提供了重要的靶標(biāo)基因。然而，目前對(duì)于NfiS與katB基因之間具體的調(diào)控機(jī)制仍不清楚，未來(lái)需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)手段，如微量熱泳動(dòng)實(shí)驗(yàn)（MST）、RNA免疫沉淀測(cè)序（RIP-seq）等，驗(yàn)證NfiS與katBmRNA的相互作用，并利用定點(diǎn)突變、半衰期實(shí)驗(yàn)等方法，深入分析NfiS與katBmRNA的作用位點(diǎn)和互作方式，研究NfiS對(duì)katBmRNA穩(wěn)定性和翻譯效率的影響，從而全面揭示NfiS轉(zhuǎn)錄后調(diào)控氧化脅迫反應(yīng)的分子機(jī)制。此外，還需進(jìn)一步探究NfiS與其他氧化脅迫相關(guān)基因之間的調(diào)控關(guān)系，以及它們?cè)诠痰┦霞賳伟鷳?yīng)對(duì)復(fù)雜環(huán)境脅迫中的協(xié)同作用，為提高固氮施氏假單胞菌在自然環(huán)境中的生存能力和固氮效率提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。四、NfiS參與氧化脅迫抗性調(diào)節(jié)的靶標(biāo)基因鑒定和作用機(jī)制研究4.1材料與方法4.1.1實(shí)驗(yàn)材料本研究選用的菌株包括固氮施氏假單胞菌野生型菌株A1501，其作為實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)菌株，具有典型的固氮施氏假單胞菌特性；nfiS基因突變株（ΔnfiS），通過(guò)基因編輯技術(shù)構(gòu)建而成，用于研究nfiS基因缺失對(duì)細(xì)菌生理功能的影響；katB基因突變株（ΔkatB），采用同源重組的方法構(gòu)建，以探究katB基因在氧化脅迫抗性中的作用；以及回補(bǔ)株（C-katB），即將野生型katB基因?qū)雓atB基因突變株中構(gòu)建得到，用于驗(yàn)證katB基因突變導(dǎo)致的表型變化是否可通過(guò)回補(bǔ)基因得到恢復(fù)。這些菌株均由本實(shí)驗(yàn)室保存，并經(jīng)過(guò)多次鑒定確保其遺傳穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)中使用的質(zhì)粒有pBBR1MCS-5，這是一種廣宿主范圍的質(zhì)粒，具有多克隆位點(diǎn)，能夠在多種細(xì)菌中穩(wěn)定復(fù)制，常用于基因的克隆和表達(dá)研究。在構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，將目的基因插入到pBBR1MCS-5的多克隆位點(diǎn)中，以便后續(xù)將其導(dǎo)入細(xì)菌中進(jìn)行功能研究。此外，還用到了pMD18-T載體，該載體是一種常用的克隆載體，具有T-A克隆的特點(diǎn)，能夠高效地克隆PCR擴(kuò)增得到的目的基因片段。培養(yǎng)基方面，LB培養(yǎng)基用于細(xì)菌的常規(guī)培養(yǎng)，其配方為：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/L，pH值調(diào)至7.0。當(dāng)需要培養(yǎng)含有特定質(zhì)粒的菌株時(shí)，會(huì)在LB培養(yǎng)基中添加相應(yīng)的抗生素，如氨芐青霉素（Ampicillin，Amp），工作濃度為100μg/mL，用于篩選含有pMD18-T載體的菌株；卡那霉素（Kanamycin，Km），工作濃度為50μg/mL，用于篩選含有pBBR1MCS-5質(zhì)粒的菌株。在進(jìn)行固氮活性檢測(cè)時(shí)，采用阿須貝無(wú)氮培養(yǎng)基，其成分包含葡萄糖10g/L、磷酸二氫鉀0.2g/L、硫酸鎂0.2g/L、氯化鈉0.2g/L、硫酸鈣0.1g/L、碳酸鈣5g/L，pH值維持在7.2-7.4，此培養(yǎng)基能夠?yàn)楣痰┦霞賳伟峁┻m宜的生長(zhǎng)環(huán)境，同時(shí)排除外源氮源對(duì)固氮活性檢測(cè)的干擾。實(shí)驗(yàn)所需的試劑眾多，其中限制性內(nèi)切酶如EcoRI、HindIII、BamHI等，用于切割質(zhì)粒和目的基因片段，它們能夠識(shí)別特定的DNA序列，并在相應(yīng)位點(diǎn)進(jìn)行切割，為構(gòu)建重組質(zhì)粒提供便利。T4DNA連接酶則用于連接切割后的目的基因片段和質(zhì)粒，催化DNA片段的5'磷酸基團(tuán)與3'羥基之間形成磷酸二酯鍵，從而實(shí)現(xiàn)基因的重組。DNA聚合酶，如高保真的PrimeSTARHSDNAPolymerase，在PCR反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，能夠以DNA為模板，根據(jù)引物的引導(dǎo)，合成新的DNA鏈，且具有高保真度，減少擴(kuò)增過(guò)程中的堿基錯(cuò)配。RNA提取試劑Trizol，基于酚-氯仿抽提原理，能夠有效地裂解細(xì)菌細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)的RNA釋放出來(lái)，并通過(guò)相分離將RNA與蛋白質(zhì)、DNA等雜質(zhì)分離，從而獲得高質(zhì)量的RNA。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser，可將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，同時(shí)其包含的gDNAEraser能夠有效去除基因組DNA的污染，提高cDNA合成的純度和準(zhǔn)確性，為后續(xù)的基因表達(dá)分析提供可靠的模板。實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒SYBRPremixExTaq，采用SYBRGreenI熒光染料，能夠特異性地結(jié)合雙鏈DNA，在實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)中，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的變化來(lái)定量分析基因的表達(dá)量，具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)。此外，實(shí)驗(yàn)中還用到了氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇等常規(guī)試劑，用于RNA提取過(guò)程中的抽提和沉淀步驟；引物由專業(yè)生物公司合成，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需擴(kuò)增的基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，引物的純度和質(zhì)量經(jīng)過(guò)嚴(yán)格檢測(cè)，確保能夠準(zhǔn)確地?cái)U(kuò)增目的基因，為實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性提供保障。主要儀器設(shè)備包括PCR儀（AppliedBiosystemsVeriti96-WellThermalCycler），該儀器具有精確的溫度控制功能，能夠快速升降溫，滿足不同PCR反應(yīng)對(duì)溫度的嚴(yán)格要求，確?；驍U(kuò)增的高效性和準(zhǔn)確性。實(shí)時(shí)定量PCR儀（RocheLightCycler480II），能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)過(guò)程中熒光信號(hào)的變化，通過(guò)對(duì)熒光信號(hào)的精確測(cè)量和分析，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)水平的精確量化，為基因表達(dá)研究提供可靠的數(shù)據(jù)支持。離心機(jī)（Eppendorf5424R），具備高速、低溫離心功能，在細(xì)菌細(xì)胞的離心收集、RNA提取過(guò)程中的分層分離等操作中發(fā)揮重要作用，能夠有效保護(hù)生物樣品的活性，避免因離心過(guò)程中的溫度升高或機(jī)械力作用對(duì)樣品造成損傷。紫外分光光度計(jì)（NanoDrop2000），可用于測(cè)定RNA和DNA的濃度和純度，通過(guò)檢測(cè)樣品在特定波長(zhǎng)下的吸光度，快速準(zhǔn)確地評(píng)估核酸樣品的質(zhì)量，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行提供保障。凝膠成像系統(tǒng)（Bio-RadGelDocXR+），用于觀察和分析PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上的電泳結(jié)果，能夠清晰地顯示DNA條帶的位置和亮度，方便對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行記錄和分析，直觀地判斷基因擴(kuò)增和酶切等實(shí)驗(yàn)的效果。4.1.2實(shí)驗(yàn)方法微量熱泳動(dòng)實(shí)驗(yàn)（MicroScaleThermophoresis，MST）用于檢測(cè)NfiS與katBmRNA之間的相互作用及親和力。實(shí)驗(yàn)前，需對(duì)NfiS或katBmRNA進(jìn)行熒光標(biāo)記，可采用NanoTemper公司的熒光標(biāo)記試劑盒進(jìn)行操作。將NfiS或katBmRNA與熒光染料按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的比例混合，在適當(dāng)?shù)臏囟群头磻?yīng)時(shí)間條件下進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)。標(biāo)記完成后，通過(guò)脫鹽柱等方法去除未結(jié)合的熒光染料，得到純化的熒光標(biāo)記樣品。將熒光標(biāo)記的NfiS或katBmRNA作為靶分子（Target），未標(biāo)記的katBmRNA或NfiS作為配體分子（Ligand）。將配體分子按照2倍的濃度梯度進(jìn)行稀釋，通常配制16個(gè)不同濃度的配體溶液。然后將不同濃度的配體溶液與固定濃度的靶分子等體積混合，充分混勻后，吸入專用的毛細(xì)管中。將毛細(xì)管放入Monolith分子互作儀中，儀器中的紅外激光束會(huì)對(duì)毛細(xì)管的檢測(cè)區(qū)域正中心進(jìn)行加熱，在激光束周?chē)娜芤褐行纬蓽囟忍荻取Ｓ捎诜肿釉跍囟忍荻热芤褐袝?huì)由高溫區(qū)域向低溫區(qū)域定向移動(dòng)，且移動(dòng)速度與分子的大小、電荷以及水化層性質(zhì)密切相關(guān)，當(dāng)靶分子與配體分子結(jié)合形成復(fù)合物時(shí)，復(fù)合物分子的這些性質(zhì)會(huì)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致其熱泳動(dòng)速度相對(duì)于靶分子熱泳動(dòng)速度發(fā)生變化。通過(guò)激發(fā)光激發(fā)靶分子上的熒光基團(tuán)，檢測(cè)其熒光基團(tuán)發(fā)出的發(fā)射光的熒光強(qiáng)度變化，從而記錄熱泳動(dòng)速度的差異。將熒光強(qiáng)度的數(shù)值作為縱坐標(biāo)，配體濃度作為橫坐標(biāo)進(jìn)行擬合作圖，使用儀器配套的軟件自動(dòng)計(jì)算得到該結(jié)合的親和常數(shù)KD值，KD值越小，表示NfiS與katBmRNA之間的親和力越強(qiáng)，二者的相互作用越緊密。半衰期實(shí)驗(yàn)用于研究NfiS對(duì)katBmRNA穩(wěn)定性的影響。首先，將固氮施氏假單胞菌野生型菌株A1501和nfiS基因突變株（ΔnfiS）分別接種到LB培養(yǎng)基中，在30℃、200rpm的搖床中振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。向培養(yǎng)體系中加入轉(zhuǎn)錄抑制劑利福平，使其終濃度為50μg/mL，以抑制新的mRNA轉(zhuǎn)錄。在加入利福平后的0min、5min、10min、15min、20min、30min等不同時(shí)間點(diǎn)，分別取適量菌液，迅速加入等體積的預(yù)冷的RNA保護(hù)試劑中，以終止mRNA的降解過(guò)程。然后，按照Trizol試劑法提取細(xì)菌總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)katBmRNA的相對(duì)含量。以加入利福平0min時(shí)katBmRNA的含量為100%，計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)katBmRNA的相對(duì)剩余量。通過(guò)比較野生型菌株和nfiS基因突變株中katBmRNA的相對(duì)剩余量隨時(shí)間的變化情況，分析NfiS對(duì)katBmRNA半衰期的影響。若在野生型菌株中katBmRNA的半衰期較長(zhǎng)，而在nfiS基因突變株中半衰期明顯縮短，說(shuō)明NfiS能夠增強(qiáng)katBmRNA的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)其半衰期。固氮酶活測(cè)定實(shí)驗(yàn)采用乙炔還原法。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的固氮施氏假單胞菌野生型菌株A1501、nfiS基因突變株（ΔnfiS）、katB基因突變株（ΔkatB）和回補(bǔ)株（C-katB）分別接種到阿須貝無(wú)氮培養(yǎng)基中，在30℃、200rpm的搖床中振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。取適量菌液，轉(zhuǎn)移至含有10mL阿須貝無(wú)氮培養(yǎng)基的血清瓶中，每個(gè)血清瓶中接入的菌液量應(yīng)保持一致，以確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。向血清瓶中注入乙炔氣體，使乙炔在瓶?jī)?nèi)氣體中的體積分?jǐn)?shù)達(dá)到10%。將血清瓶置于30℃、200rpm的搖床中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)2-4小時(shí)，在此期間，固氮酶會(huì)將乙炔還原為乙烯。培養(yǎng)結(jié)束后，用注射器從血清瓶中抽取1mL氣體樣品，注入氣相色譜儀中進(jìn)行分析。氣相色譜儀配備氫火焰離子化檢測(cè)器（FID）和PorapakQ填充柱，通過(guò)檢測(cè)乙烯的含量來(lái)間接測(cè)定固氮酶的活性。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出乙烯的產(chǎn)量，進(jìn)而換算出固氮酶活性，單位為nmolC2H4/mgprotein/h。通過(guò)比較不同菌株的固氮酶活性，分析NfiS和katB基因?qū)痰富钚缘挠绊懀约八鼈冊(cè)谘趸{迫條件下對(duì)固氮酶活性的調(diào)控作用。4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.2.1NfiS參與氧化脅迫應(yīng)答調(diào)控的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域分析為了深入探究NfiS參與氧化脅迫應(yīng)答調(diào)控的分子機(jī)制，我們首先對(duì)NfiS的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了詳細(xì)分析。運(yùn)用Mfold和RNAfold軟件對(duì)NfiS的核苷酸序列進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示NfiS可形成復(fù)雜且穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其中包含多個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)和單鏈區(qū)域。通過(guò)對(duì)NfiS二級(jí)結(jié)構(gòu)的深入研究，我們發(fā)現(xiàn)特定區(qū)域（如莖環(huán)結(jié)構(gòu)1和單鏈區(qū)域2）在進(jìn)化過(guò)程中高度保守，這些保守區(qū)域可能在Nfi