1.2基因工程的基本操作程序主講人：你知道培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉一

般需要哪些步驟嗎?問題探討基因工程的基本操作程序

目

的基

因

的

獲

取

基

因

表

達

載

體

的

構(gòu)

建

將

目的基

因?qū)?/p>

受體細胞

目

的

基

因

的

檢

測

與

鑒

定一.

目的基因的獲取目的基因：用于改變受體細胞性狀或獲得預期表達產(chǎn)物等的基因。主要

是指編碼蛋白質(zhì)的基因。如與生物抗逆性

、

優(yōu)良品質(zhì)

、

生產(chǎn)藥物

、

毒物降解和工業(yè)用酶等相關(guān)的基因。培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉用到的目的基因——Bt抗蟲蛋白基因，簡稱Bt基因：蘇云金桿菌通過產(chǎn)生蘇云金桿菌伴孢晶體蛋白(Bt抗蟲蛋白)，破壞鱗翅目昆蟲的消化系統(tǒng)來殺死棉鈴蟲?？茖W家通過實驗，將該細菌的“殺蟲基因

”轉(zhuǎn)到棉花里，讓棉花也能產(chǎn)生Bt抗蟲蛋白抵抗蟲害。小資料當Bt抗蟲蛋白被分解為多肽后，多肽與害蟲腸上皮細胞的特

異性受體結(jié)合，導致細胞膜穿孔，最后造成害蟲死亡。Bt抗蟲蛋白只有在某類昆蟲腸道的堿性環(huán)境中才能表現(xiàn)出毒

性，而人和牲畜的胃液呈酸性，腸道細胞也沒有特異性受體。因此，Bt抗蟲蛋白不會對人畜產(chǎn)生上述影響。那么，如何獲取目的基因呢?1.從基因文庫中獲取目的基因基因文庫：將含有某種生物的不同基因的許多DNA片段，導入受體

菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有該生物的不同的基因?；蚪M文庫——包含一種生物所有的基因；部分基因文庫——只包含一種生物的一部分基因，如cDNA文庫。將某種生物體內(nèi)的DNA全部提取出來，選用適當

的限制酶，將DNA切成一定范圍大小的DNA片段。將這些DNA片段分別與載體連接起來。導入受體菌的群體中儲存，每個受體

菌都含有一段不同的DNA片段。這個群體包含了這

種生物的所有基因，

叫做這種生物的基

因組文庫。受體菌

DNA基因組文庫的構(gòu)建啟動子：RNA聚

合酶結(jié)合位點非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)外顯子內(nèi)含子真核細胞基因結(jié)構(gòu)示意圖cDNA文庫的構(gòu)建反轉(zhuǎn)錄法：以目的基因轉(zhuǎn)錄成的

mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互

補的單鏈DNA

，然后在酶

的

作

用下

合

成

雙

鏈

DNA（即cDNA）。cDNA與載體連接后，

儲存在受體菌群中。

目的基因轉(zhuǎn)錄成mRNAmRNA為模板反轉(zhuǎn)錄成DNA反轉(zhuǎn)錄完成以DNA為模板合成雙鏈DNA形成不含內(nèi)含子的雙鏈DNAmRNA內(nèi)含子的去除cDNA文庫和基因組文庫的比較2.利用PCR技術(shù)擴增目的基因多聚酶鏈式反應縮寫為PCR。原理：DNA半保留復制。前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成引物。PCR擴增儀2.利用PCR技術(shù)擴增目的基因條件：①模板：DNA的兩條鏈②原料：四種脫氧核苷酸③酶：熱穩(wěn)定DNA聚合酶(

Taq

酶）④引物（一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸，使

DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸。）⑤反應需在一定的緩沖液中進行⑥溫度控制引物與單鏈相應互補序列結(jié)合；在DNA聚合酶作用下進行延伸。

延伸（70～75℃)如此重復循環(huán)多次。

2n

復性（55～60℃)變性（90～95℃)目的基因DNA受熱變性后解鏈為單鏈；PCR的過程3.人工合成前提：基因比較?。缓塑账嵝蛄幸阎?。技術(shù)方法：通過DNA合成儀用化學方法直接人工合成。二.基因表達載體的構(gòu)建獲取了足夠量的Bt基因后，下一步就是要讓基因在受體細胞

中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代；同時，使Bt基因能夠表達和發(fā)揮

作用，這就需要構(gòu)建基因表達載體。這一步是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的核心工作。 目的基因限制酶相同的黏性末端目的基因與載體的結(jié)合過程，

實際上是不同

來源的基因重

組的過程。獲取目的基因限制酶切割位點限制酶切割位點重組 DNA分子

DNA連接酶限制酶質(zhì)粒二.基因表達載體的構(gòu)建思考作為基因工程表達載體，只含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？為什么？不可以。因為目的基因在表達載體中得到表達并發(fā)揮作用，還需要有其他的調(diào)控元件，如啟動子，終止子和標記基因等。（1）沒有啟動子和終止子，目的基因?qū)o法轉(zhuǎn)錄。（2）目的基因是否導入受體生物中需要有篩選標記。（3）為了增強目的基因的表達水平，往往還要增加一些其他的調(diào)控元

件，如增強子。（4）有時需要確定目的基因表達產(chǎn)物的存在部位，往往要加上可以標識存在部位的基因，如綠色熒光蛋白基因等。啟動子：RNA聚合酶識別和結(jié)合部位（轉(zhuǎn)錄起始部位）標記基因：用于

鑒別受體細胞是

否含有目的基因目的：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳

給下一代，同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。重組DNA分子復制原點終止子：轉(zhuǎn)

錄終止部位插入基因基因表達載體模式圖廣州市第六中學

魏

敏1.2基因工程的基本操作程序《選修三》專題1基因工程PARTONE基因工程的基本操作程序

目

的基

因

的

獲

取

基

因

表

達

載

體

的

構(gòu)

建

將

目的基

因?qū)?/p>

受體細胞

目

的

基

因

的

檢

測

與

鑒

定三.將目的基因?qū)胧荏w細胞構(gòu)建好的基因表達載體需要通過一定的方式才能進入受體細胞。轉(zhuǎn)化——目的基因進入受體細胞內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和

表達的過程。導入動物細胞

——顯微注射法導入微生物細胞

——感受態(tài)細胞吸收DNA分子花粉管通道法

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

基因槍法導入植物細胞方法1.將目的基因?qū)胫参锛毎?）花粉管通道法（將Bt基因?qū)朊藁毎┨攸c：簡便經(jīng)濟。在植物受粉后的一定時

間內(nèi)

，

剪去柱頭

，

將DNA溶液滴加在花柱切

面上，使目的基因借助

花粉管通道進入胚囊。（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

特點：經(jīng)濟有效。農(nóng)桿菌特點：易感染雙子葉植物和裸子植物。Ti質(zhì)粒的T-DNA可轉(zhuǎn)移至受體細胞染色體的DNA

上。1.將目的基因?qū)胫参锛毎?）基因槍法（微彈轟擊法）特點：用于單子葉植物，成本高。操作程序：基因表達載體↓包裹在金屬顆粒（金粉、鎢粉）表面↓打入受體細胞1.將目的基因?qū)胫参锛毎麑⒛康幕蜃⑸涞絼游锛毎荏w細胞：受精卵技術(shù)：顯微注射技術(shù)操作程序：將表達載體注射入受精卵↓胚胎早期培養(yǎng)↓移植到雌性動物輸卵管或子宮內(nèi)發(fā)育成個體2.將目的基因?qū)雱游锛毎?.將目的基因?qū)胛⑸锛毎?.原核生物作受體細胞的原因：繁殖快、多為單細胞、遺傳物質(zhì)相對少。2.常用受體菌：大腸桿菌3.轉(zhuǎn)化方法：Ca2+處理細胞→感受態(tài)細胞→表達載體與感受態(tài)細胞混合→在一定

溫度下促進感受態(tài)細胞吸收DNA分子，完成轉(zhuǎn)化。感受態(tài)細胞：用Ca2+處理細胞，使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中

DNA分子的生理狀態(tài)。四.

目的基因的檢測與鑒定目的基因進入受體細胞后，是否穩(wěn)定維持和表達其遺傳特性，

只有通過檢測與鑒定才能知道，這也是檢查轉(zhuǎn)基因抗蟲棉是否培育

成功的一步。①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA③檢測目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)

抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等分子水平檢測個體水平鑒定1.

DNA分子雜交目的：檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因。方法：探針+轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA。用放射性標記的

、含

有目的基因的DNA片段。2.分子雜交目的：檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA。方法：從轉(zhuǎn)基因生物中提取mRNA，用標記的目的基因做探針，與

mRNA雜交，如顯示出雜交帶，則表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA。3.抗原-抗體雜交目的：檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)。方法：從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)，用相應的抗體進行抗原-抗體

雜交，若出現(xiàn)雜交帶，表明目的基因已形成蛋白質(zhì)產(chǎn)品。4.個體水平鑒定做抗蟲或抗病接種實驗；或?qū)蚬こ坍a(chǎn)品進行功能活性比較。如：通過采摘抗蟲棉的葉片飼喂棉鈴蟲來確定Bt基因是否賦予了棉

花抗蟲特性以及抗性的程度?？瓜x棉的接種實驗（左為抗蟲轉(zhuǎn)基因棉，使蟲體發(fā)育不正常）思考聯(lián)系前面有關(guān)細胞器功能的知識，結(jié)合基因工程操作程序的基本思

路思考：若要生產(chǎn)人的糖蛋白，可以用大腸桿菌嗎？提示：有些蛋白質(zhì)肽鏈上有共價結(jié)合的糖鏈，這些糖鏈是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

和高爾基體上加工完成的，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體存在于真核細胞中，

大腸桿菌不存在這兩種細胞器，因此在大腸桿菌中生產(chǎn)這種糖蛋白

是不可能的?；虮磉_載體的構(gòu)建目的基因?qū)胧荏w細胞目的基因的檢測與鑒定構(gòu)建目的構(gòu)建零件及其作用導入植物細胞的方法導入動物細胞的方法導入微生物細胞的方法分子水平的檢測個體生物學水平的檢測目的基因的獲取從基因文庫中獲取利用PCR技術(shù)擴增人工合成基因組文庫cDNA文庫原理：DNA半保留復制大致過程基因工程的基本操作程序總結(jié)反饋練習1.基因工程中可以通過PCR技術(shù)擴增目的基因?；卮鹣铝袉栴}：(1)生物體細胞內(nèi)的DNA復制開始時，解開DNA雙鏈的酶是

解旋酶____。在體外利用PCR技術(shù)擴增目的基因時，使反應體

系中的模板DNA解鏈為單鏈的條件是___加熱至90～

95

_。C___。上述

兩個解鏈過程的共同點是破壞了DNA雙鏈分子中的____氫_鍵___。(2)目前在PCR反應中使用Taq酶而不使用大腸桿菌DNA聚合酶的主

要原因是

Ta

q酶熱穩(wěn)定性高,_而大腸桿菌DNA聚合酶在高溫下會失活

__。反饋練習2.閱讀如下資料:科學家將牛生長激素基因?qū)胄∈笫芫阎?得到了體型巨大的“超級小鼠

”;科學家采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法培育出轉(zhuǎn)基因煙草?；卮鹣铝袉栴}：此資料屬于基因工程的范疇。將基因表達載體導入小鼠的受精卵中

常用_顯微注射

法。構(gòu)建基因表達載體常用的工具酶是

限制酶__

和__DNA連_接_酶___。在培育有些轉(zhuǎn)基因植物時，常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，

農(nóng)桿菌的作用是_農(nóng)桿菌可感染植物,_將目的基因轉(zhuǎn)移到受體細胞中。反饋練習3.真核生物基因中通常有內(nèi)含子，而原核生物基因中沒有，原核生物沒有真

核生物所具有的切除內(nèi)含子對應的RNA序列的機制。已知在人體中基因A(有

內(nèi)含子)可以表達出某種特定蛋白(簡稱蛋白A)?；卮鹣铝袉栴}：(1)某同學從人的基因組文庫中獲得了基因A，以大腸桿菌作為受體細胞卻未

得到蛋白A，其原因是___基_因A有內(nèi)含子,在_大腸桿菌中,其初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中

__與內(nèi)含子對應的RNA序_列_不_能_被_切_除,_無_法_表_達_出_蛋_白A________________。(2)若用家蠶作為表達基因A的受體，在噬菌體和昆蟲病毒兩種載體中，不選

用___噬菌體____作為載體，其原因是___噬_菌_體_的_宿_主_是_細_菌_,_而_不_是_家_蠶_。(3)若要高效地獲得蛋白A,可選用大腸桿菌作為受體。因為與家蠶

相比，大腸桿菌具有__繁殖快、_容易_培養(yǎng)

__

(答出兩點即可)等優(yōu)點。(4)若要檢測基因A是否翻譯出蛋白A,可用的檢測物質(zhì)是

_蛋白A的抗體

(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗體”)。2.

閱讀如下資料:T4溶菌酶在溫度較高時易失去