(19)國家知識產(chǎn)權局(12)發(fā)明專利(10)授權公告號CN1200818(65)同一申請的已公布的文獻號(73)專利權人四川大學華西醫(yī)院地址610000四川省成都市武侯區(qū)國學巷37號莊偉華柴正張穎(74)專利代理機構成都正德明志知識產(chǎn)權代理有限公司51360專利代理師黃鑫G01N21/64(2006.01)(54)發(fā)明名稱應用本發(fā)明公開了一種脂滴特異性熒光探針及其制備方法和應用，涉及生物醫(yī)藥技術領域；本發(fā)明提供了脂滴特異性熒光探針的結(jié)構式，且在制備時，將2-甲醛-6-(二乙氨基)苯并[B]呋喃與丙二腈衍生物在堿環(huán)境作用下制備了一類具備擴展的π共軛體系的熒光探針；這類熒光探針均具有分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(TICT)特性，在水溶液中熒光極其微弱，而在葵花籽油中熒光顯著增強，具有顯著的斯托克斯位移、優(yōu)良的生物相容性、卓越的光穩(wěn)定性以及高信噪比。同時，該熒光探針在細胞脂滴成像方面展現(xiàn)出極高的靈敏度和信Bodipy493/503實施例1產(chǎn)品合并21.一種脂滴特異性熒光探針，其特征在于，其結(jié)構式為以下的其中一種：02.權利要求1所述的脂滴特異性熒光探針的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：將2-甲醛-6-(二乙氨基)苯并[B]呋喃和丙二腈衍生物溶于溶劑中，然后在堿作用下反所述丙二腈衍生物為丙二腈或1,3茚滿二酮。3.如權利要求2所述的脂滴特異性熒光探針的制備方法，其特征在于，所述2-甲醛-6-(二乙氨基)苯并[B]呋喃和丙二腈衍生物摩爾比為1:5-5:1。4.如權利要求2所述的脂滴特異性熒光探針的制備方法，其特征在于，所述堿和2-甲醛-6-(二乙氨基)苯并[B]呋喃摩爾比為1:4000-1:200。5.如權利要求2所述的脂滴特異性熒光探針的制備方法，其特征在于，所述堿為三乙一種。6.如權利要求2所述的脂滴特異性熒光探針的制備方法，其特征在于，在0-180℃溫度下反應1-72h,對反應液進行濃縮處理，柱色譜法分離純化。7.如權利要求2所述的脂滴特異性熒光探針的制備方法，其特征在于，所述溶劑為水、苯、均三甲苯、叔戊醇、1,4-二氧六環(huán)、1,2-二氯乙烷、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二甲基乙酰胺中的至少一種。8.權利要求1所述的脂滴特異性熒光探針在制備細胞脂滴成像和/或脂滴特異性標記試劑方面的應用。3一種脂滴特異性熒光探針及其制備方法和應用技術領域[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術領域，具體涉及一種脂滴特異性熒光探針及其制備方法和應用。背景技術[0002]脂滴作為動態(tài)的細胞內(nèi)細胞器，在脂質(zhì)儲存和代謝中發(fā)揮著關鍵作用。研究表明，脂滴的異常積累與多種代謝紊亂密切相關，如II型糖尿病、脂肪肝疾病和動脈粥樣硬化等。其中，動脈粥樣硬化是一種慢性全身性進行性疾病，已成為全球心血管疾病發(fā)病率和死亡率的主要原因。動脈粥樣硬化病變的發(fā)展伴隨著持續(xù)的脂質(zhì)沉積，進而促進斑塊的形成并最終導致急性心血管事件。對脂滴的可視化在臨床干預中顯示出巨大潛力。通過在細胞和組織水平提供有價值的信息，脂滴成像將有助于動脈粥樣硬化的早期診斷和治療，以及預防與動脈粥樣硬化相關的急性心血管事件。[0003]近年來，針對脂滴的熒光成像因其靈敏快捷、非侵入性、高時空分辨率、實時原位等獨特優(yōu)勢受到了廣泛關注，在臨床轉(zhuǎn)化方面表現(xiàn)出廣闊的應用前景。近年來，已經(jīng)開發(fā)了各種用于脂滴成像的熒光染料。其中，尼羅紅(Nilered)和BODIPY493/503是目前廣泛使用的商業(yè)熒光染料。然而，尼羅紅因其特異性低和發(fā)射光譜寬而受到限制，信噪比較低。針在水性環(huán)境和脂滴環(huán)境中均表現(xiàn)出強發(fā)射，生物成像應用有限。因此，具有高信噪比和大斯托克斯位移的新型脂滴特異性熒光探針還需要進一步開發(fā)。發(fā)明內(nèi)容[0004]為了解決上述技術問題，本發(fā)明的目的是提供一種脂滴特異性熒光探針及其制備方法和應用，該具備擴展的π共軛體系的熒光探針在細胞脂滴成像方面，展現(xiàn)出極高的靈敏度和信噪比，能夠輕松實現(xiàn)脂滴的動態(tài)精準靶向成像，有效解決了現(xiàn)有熒光探針信噪比低、生物成像應用有限的問題。[0005]本發(fā)明解決上述技術問題的技術方案如下：提供一種脂滴特異性熒光探針，其結(jié)構式為以下的其中一種： 4[0007]本發(fā)明還提供了上述脂滴特異性熒光探針的制備方法，包括以下步驟：[0008]將2-甲醛-6-(二乙氨基)苯并[B]呋喃和丙二腈衍生物溶于溶劑中，然后在堿作用[0009]進一步，2-甲醛-6-(二乙氨基)苯并[B]呋喃和丙二腈衍生物摩爾比為1:5-5:1。[0010]進一步，堿和2-甲醛-6-(二乙氨基)苯并[B]呋喃摩爾比為1:4000-1:200。[0011]進一步，丙二腈衍生物為丙二腈、1,3茚滿二酮、(3,5,5-三甲基環(huán)己-2-烯亞基)丙二腈、2-(3-氰基-4,5,5-三甲基呋喃-2(5H)-亞甲基)丙二腈、(E)-2-異氰基-2-(3-氧代-2,3-二氫-1H-茚-1-亞基)乙腈和(E)-2-(3-(氰基(異氰基)亞甲基)-2,3-二氫-1H-茚-1-亞基)丙二腈中的其中一種。氨基鋰和碳酸氫鈉中的至少一種。[0013]進一步，在0-180℃溫度下反應1-72h,對反應液進行濃縮處理，柱色譜法分離純二甲基甲酰胺和N,N-二甲基乙酰胺中的至少一種。[0016]本發(fā)明還提供了上述脂滴特異性熒光探針在細胞脂滴成像和/或脂滴特異性標記方面的應用。[0017]本發(fā)明具有以下有益效果：[0018]1、本發(fā)明通過用苯并呋喃片段作為π橋作為供電基團，用丙二腈及其衍生物作為電子受體基團，制備具有推拉電子特征的D-A型熒光分子，表現(xiàn)為顯著的斯托克斯位移、優(yōu)良的生物相容性、卓越的光穩(wěn)定性以及高信噪比，有助于減少背景熒光干擾，提高脂滴成像靈敏度。5附圖說明[0032]在室溫下，將2-甲醛-6-(二乙氨基)苯并[B]呋喃(0.50g,2.30mmol)與丙二腈[0036]在室溫下，將2-甲醛-6-(二乙氨基)苯并[B]呋喃(0.50g,6[0040]1、將實施例1和實施例2所得產(chǎn)物分別溶解在二甲基亞砜中，配置成10mM的存儲[0041]由圖3和圖4可知，隨著溶劑極性的增加，本發(fā)明的熒光探針在不同極性溶劑中的最大發(fā)射波長向較長波長(即紅色端)移動；這很可能歸因于扭轉(zhuǎn)分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(TICT)效[0042]2、將實施例1和實施例2所得產(chǎn)物分別溶解在二甲基亞砜中，配置成10mM的存儲[0043]由圖5和圖6可知，本發(fā)明的熒光探針在水溶液中幾乎沒有熒光，而在葵花籽油中的熒光強度顯著升高。這種僅在油脂環(huán)境下出現(xiàn)熒光增強的特性，極大程度減少了熒光探針自身帶來的干擾，有利于提高信噪比。[0044]3、將HeLa細胞接種到玻底皿中，別將實施例1和實施例2所得熒光探針配置成10mM的二甲基亞砜儲存液，用培養(yǎng)基稀釋成5色熒光染料進一步孵育30min以便標記脂滴；通過三次PBS洗滌去除未結(jié)合的染料，并利用共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)觀察熒光探針脂滴靶向成像能力，其結(jié)果如圖7和圖8所示。[0045]由圖7和圖8可知，本發(fā)明的熒光探針發(fā)出的紅色熒光與BODIPY493/503的綠色熒光實現(xiàn)了良好的重疊；這一現(xiàn)象充分表明，本發(fā)明的熒光探針適用于脂滴的生物成像研究。[0046]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和三三88887--二8圖28圖圖附書明說3/5頁3/5頁圖36006509葵花籽油葵花籽油水一